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Departamento de Biología Aplicada División de Genética Estudio de nuevos mutantes que alteran la actividad del meristemo y la polaridad adaxial-abaxial en Arabidopsis thaliana Isabel Ochando Sánchez San Juan de Alicante, 2005 Estudio de nuevos mutantes que alteran la actividad del meristemo y la polaridad adaxial-abaxial en Arabidopsis thaliana Trabajo realizado en la División de Genética del Departamento de Biología Aplicada de la Universidad Miguel Hernández de Elche, para optar al Grado de Doctor, por la Licenciada Isabel Ochando Sánchez. San Juan de Alicante, 31 de mayo de 2005 Departamento de Biología Aplicada Universidad Miguel Hernández – Campus de Sant Joan d’Alacant ANTONIO MARTÍNEZ LABORDA, Profesor Titular de Genética de la Universidad Miguel Hernández de Elche, CERTIFICA que la Licenciada Dña. Isabel Ochando Sánchez ha realizado bajo su dirección y supervisión la Tesis Doctoral que con el título Estudio de nuevos mutantes que alteran la actividad del meristemo y la polaridad adaxial-abaxial en Arabidopsis thaliana presenta para optar al Grado de Doctor. El trabajo reflejado en la presente memoria se ha desarrollado íntegramente en la División de Genética de la Universidad Miguel Hernández de Elche. Y para que así conste y surta a los efectos oportunos, firmo el presente certificado en Sant Joan d’Alacant a 31 de mayo de 2005 Fdo.: Dr. Antonio Martínez Laborda Universidad Miguel Hernández, Campus de Sant Joan, Ctra. Alicante-Valencia Km. 87, 03550 San Juan, Alicante. Spain Tel: 34 96 591 9476 – Fax: 34 96 591 9568 – e-mail: laborda@umh.es – URL: http://biolapli.umh.es Departamento de Biología Aplicada Universidad Miguel Hernández – Campus de Elche Prof. Dr. D. José Luis Micol Molina, Catedrático de Universidad y director del Departamento de Biología Aplicada de la Universidad Miguel Hernández de Elche, INFORMA Que la Tesis Doctoral titulada Estudio de nuevos mutantes que alteran la actividad del meristemo y la polaridad adaxial-abaxial en Arabidopsis thaliana ha sido realizada por la licenciada Dña. Isabel Ochando Sánchez, bajo la inmediata dirección y supervisión del Prof. D. Antonio Martínez Laborda, y que el Departamento de Biología Aplicada ha dado su conformidad para que sea presentada ante la comisión de doctorado. Elche, a 31 de mayo de 2005 Fdo.: José Luis Micol Molina Universidad Miguel Hernández, Campus de Elche, Edificio Vinalopó, Avenida del Ferrocarril s/n, 03202 Elche, Alicante. Spain Tel: 34 96 665 8504 – Fax: 34 96 665 8511 – e-mail: jlmicol@umh.es – URL: http://biolapli.umh.es A mi familia A Miguel Índices I Índice de Materias Índice de Figuras ................................................................................................ VII Índice de Tablas ................................................................................................... IX I.- Introducción ....................................................................................................... 1 I.1.- El desarrollo vegetal ........................................................................................... 2 I.2.- Utilización de los sistemas modelo en el estudio del desarrollo ......................... 4 I.3.- Arabidopsis thaliana como sistema modelo en el estudio del desarrollo vegetal ............................................................................................... 5 I.4.- Singularidades de Arabidopsis thaliana.............................................................. 6 I.5.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana ....................................................... 8 I.6.- Desarrollo de Arabidopsis thaliana ................................................................... 10 I.6.1.- Desarrollo embrionario.............................................................................. 10 I.6.2.- Origen y estructura de los meristemos radicular y apical.......................... 11 I.6.2.1.- Genes implicados en la formación y el mantenimiento del meristemo apical ......................................................................... 13 I.6.3.- El desarrollo postembrionario ................................................................... 14 I.6.3.1.- El desarrollo del tallo ......................................................................... 15 I.6.3.1.1.- Diferenciación del sistema vascular........................................... 16 I.6.3.1.2.- Papel de las hormonas vegetales en la formación del patrón vascular..................................................................... 17 I.6.3.2.- El desarrollo de la hoja ...................................................................... 19 I.6.3.3.- El desarrollo de los órganos florales ................................................. 21 I.6.3.4.- El desarrollo del fruto......................................................................... 24 I.6.4.- El establecimiento de la polaridad en los órganos laterales ..................... 26 I.6.5.- Los genes HD-ZIP..................................................................................... 30 I.6.5.1.- Función de los genes HD-ZIP de Arabidopsis thaliana ..................... 31 I.6.5.2.- La familia de genes HD-ZIP III .......................................................... 32 I.6.6.- La regulación post-transcripcional mediada por microRNA ...................... 33 II.- Antecedentes y objetivos........................................................................ 36 Índices II III.- Materiales y métodos ............................................................................... 40 III.1.- Organismos utilizados en este trabajo............................................................ 41 III.1.1.- Estirpes de Arabidopsis thaliana ............................................................. 41 III.1.1.1.- Estirpes silvestres............................................................................ 41 III.1.1.2.- Estirpes mutantes............................................................................ 41 III.1.1.2.1.- Nomenclatura utilizada en la denominación de genes, mutaciones y fenotipos ........................................... 41 III.1.1.2.2.- Procedencia de las estirpes mutantes ..................................... 42 III.1.2.- Estirpes de Escherichia coli .................................................................... 43 III.1.3.- Estirpes de Agrobacterium tumefaciens ................................................. 43 III.2.- Vectores. Plásmidos y construcciones ........................................................... 43 III.3.- Oligonucleótidos empleados como cebadores ............................................... 44 III.4.- Medios de cultivo, disoluciones y tampones................................................... 46 III.4.1.- Medios de cultivo .................................................................................... 46 III.4.1.1- Medios de cultivo para Arabidopsis thaliana .................................... 46 III.4.1.1.1.- Medio de cultivo líquido ........................................................... 46 III.4.1.1.2.- Medio de cultivo sólido............................................................. 46 III.4.1.2.- Medios de cultivo para microorganismos ........................................ 47 III.4.1.2.1.- Medio de cultivo líquido ........................................................... 47 III.4.1.2.2.- Medio de cultivo sólido............................................................. 47 III.4.1.3.- Medios de cultivo con antibióticos ................................................... 47 III.4.2.- Disoluciones y tampones ........................................................................ 47 III.4.2.1.- Disoluciones de uso común............................................................. 47 III.4.2.2.- Disoluciones para el aislamiento de DNA genómico de Arabidopsis thaliana.................................................................... 48 III.4.2.3.- Disoluciones empleadas en el aislamiento de DNA plasmídico ...... 48 III.4.2.4.- Disoluciones utilizadas en electroforesis ......................................... 48 III.4.2.5.- Disoluciones empleadas en la identificación de clones bacterianos mediante hibridación.................................... 48 III.4.2.6.- Disoluciones utilizadas en la hibridación in situ de tejidos .............. 49 III.4.2.7.- Disolución para la infiltración de plantas con Agrobacterium tumefaciens ...................................................... 49 III.4.2.8.- Disolución de esterilización de semillas de Arabidopsis thaliana .... 49 III.4.2.9.- Sustrato para cultivo de Arabidopsis thaliana en maceta................ 50 Índices III III.5.- Condiciones y métodos de cultivo .................................................................. 50 III.5.1.- Condiciones y métodos de cultivo para Arabidopsis thaliana ................. 50 III.5.1.1.- Cultivos en placas de Petri .............................................................. 50 III.5.1.2.- Cultivos en maceta .......................................................................... 50 III.5.1.3.- Realización de cruzamientos........................................................... 51 III.5.2.- Condiciones y métodos de cultivo para Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens .................................................................. 51 III.6.- Estudio de las características morfológicas e histológicas ............................. 52 III.6.1.- Fotografía a bajo aumento ...................................................................... 52 III.6.2.- Microscopía óptica .................................................................................. 52 III.6.2.1.- Inclusión en resina JB4 ................................................................... 52 III.6.2.2.- Inclusión en parafina ....................................................................... 53 III.6.3.- Microscopía electrónica de barrido (SEM) .............................................. 54 III.7.- Aislamiento y manipulación de ácidos nucleicos ............................................ 54 III.7.1.- Preparaciones de DNA genómico de Arabidopsis thaliana..................... 54 III.7.2.- Preparaciones de DNA plasmídico ......................................................... 55 III.7.3.- Tratamiento de DNA con enzimas de restricción .................................... 55 III.7.4.- Reacciones de ligación de DNA.............................................................. 55 III.7.5.- Técnicas electroforéticas ........................................................................ 56 III.7.5.1.- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) en condiciones desnaturalizantes.................................................... 56 III.7.5.2.- Electroforesis en geles de agarosa en condiciones no desnaturalizantes............................................... 56 III.7.6.- Recuperación de DNA a partir de geles de agarosa............................... 56 III.7.7.- Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) ........................................................................... 56 III.7.8.- Secuenciación de DNA ........................................................................... 57 III.7.9.- Análisis y tratamiento informático de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas............................................................... 57 III.8.- Técnicas de hibridación molecular de ácidos nucleicos ................................. 58 III.8.1.- Identificación de clones bacterianos mediante hibridación en colonia.... 58 III.8.1.1.- Obtención de la sonda marcada...................................................... 58 III.8.1.2.- Transferencia del DNA a una membrana de nailon......................... 58 III.8.1.3.- Tratamientos de prehibridación, hibridación con la sonda y lavado de la membrana ............................................................... 59 III.8.1.4.- Detección colorimétrica de la señal................................................. 59 Índices IV III.8.2.- Análisis de la expresión mediante hibridación in situ en tejidos vegetales ................................................................................. 60 III.8.2.1.- Obtención de ribosondas marcadas con digoxigenina .................... 60 III.8.2.2.- Cuantificación del rendimiento del marcaje..................................... 60 III.8.2.3.- Obtención y procesamiento histológico de las muestras................. 61 III.8.2.4.- Prehibridación e hibridación de la sonda......................................... 61 III.8.2.5.- Lavados e inmunodetección colorimétrica de la señal .................... 62 III.9.- Transformación bacteriana ............................................................................. 62 III.9.1.- Transformación por choque térmico........................................................ 62 III.9.2.- Transformación por electroporación........................................................ 62 III.10.- Transformación de Arabidopsis thaliana....................................................... 63 III.10.1.- Obtención de las construcciones de sobreexpresión............................ 63 III.10.2.- Obtención de la construcción de interferencia ...................................... 64 III.10.3.- Infiltración con Agrobacterium tumefaciens .......................................... 64 III.10.4.- Selección de los transformantes ........................................................... 66 III.11.- Cartografía génica mediante análisis de ligamiento a marcadores SSLP .... 66 III.12.- Genotipado molecular de los alelos icu4 ...................................................... 66 III.13.- Tratamientos con auxinas y con inhibidores de su transporte...................... 67 III.14.- Análisis estadístico mediante χ2 ................................................................... 67 IV.- Resultados ..................................................................................................... 69 IV.1.- Caracterización fenotípica de los mutantes icu4-1 e icu4-2 ........................... 70 IV.1.1.- Morfología foliar ...................................................................................... 70 IV.1.2.- Estructura corporal ................................................................................. 72 IV.1.3.- Morfología de los órganos florales.......................................................... 75 IV.1.4.- Morfología del patrón vascular en la inflorescencia................................ 75 IV.1.5.- Desarrollo embrionario ........................................................................... 77 IV.2.- Caracterización fenotípica del doble mutante icu4-1 hst-1............................. 78 IV.3.- Obtención de dobles mutantes con otros genes implicados en el establecimiento del eje adaxial-abaxial .......................................................... 81 IV.4.- Caracterización molecular del gen ICU4 ........................................................ 82 IV.4.1.- Estructura del gen ICU4 ......................................................................... 84 IV.4.2.- Obtención de plantas transgénicas ........................................................ 86 IV.4.2.1.- Sobreexpresión de los cDNA silvestre y mutante del gen ICU4 en las plantas silvestres En-2................................... 86 Índices V IV.4.2.2.- Sobreexpresión de una construcción de interferencia en las plantas homocigotas icu4-1/icu4-1 ...................................... 88 IV.4.3.- Análisis de la expresión del gen ICU4 .................................................... 90 IV.5.- Análisis de las interacciones genéticas entre ICU4 y otros miembros de la familia HD-ZIP III ................................................................... 91 IV.5.1.- Obtención de alelos de pérdida de función ............................................ 91 IV.5.2.- Análisis de los dobles mutantes icu4 athb8 ............................................ 91 IV.5.3.- Análisis de los dobles mutantes icu4-1 rev............................................. 92 IV.5.4.- Análisis de los dobles mutantes icu4-1 phb1-d ...................................... 93 IV.6.- Análisis de los dobles mutantes icu4-1 fil-3.................................................... 94 IV.7.- Estudio de la función del gen ICU4 en la filotaxia .......................................... 95 IV.7.1.- Análisis del patrón de filotaxia de los dobles mutantes icu4-1 pny-40126 ..................................................................................... 96 IV.7.2.- Análisis del patrón de filotaxia de los dobles mutantes icu4-1 bp-1 ............................................................................................... 97 IV.8.- Estudio de la función del gen ICU4 en el desarrollo vascular ........................ 97 IV.8.1.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes icu4-1 phb-1d ....... 98 IV.8.2.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes icu4 hst-1.............. 98 IV.8.3.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes phb-1d hst-1 ......... 98 IV.8.4.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes icu4-1 fil-3............. 99 IV.8.5.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes icu4-1 rev ............. 99 IV.8.6.- Análisis del patrón vascular de las plantas transgénicas 35S:ICU4 y 35S:ICU4-G189D ............................................................... 101 IV.8.7.- Efectos de las auxinas y de los inhibidores de su transporte en el desarrollo del patrón vascular ....................................................... 102 V.- Discusión ....................................................................................................... 104 V.1.- icu4-1 e icu4-2 son dos alelos semidominantes del gen ICU4...................... 105 V.2.- El gen ICU4 codifica un producto con función adaxial .................................. 106 V.3.- El gen ICU4 codifica el factor de transcripción ATHB15, perteneciente a la familia HD-ZIP III ............................................................. 108 V.4.- Una mutación puntual en el sitio de unión del miRNA165/166 causa la sobreexpresión del gen ICU4 ......................................................... 110 V.5.- Los alelos de pérdida de función de ICU4 no muestran fenotipo mutante.... 111 V.6.- ICU4 participa en la formación del patrón radial del tallo .............................. 112 Índices VI V.6.1.- ICU4 promueve la diferenciación de los tejidos vasculares................... 112 V.6.2.- ICU4 participa en la formación del patrón en la eustela ........................ 113 V.6.3.- ICU4 participa en la formación del patrón interno de los haces vasculares ................................................................................... 115 V.6.4.- La participación de ICU4 en la formación del patrón radial del tallo incluye también a tejidos no vasculares ................................... 116 V.6.5.- Relación entre el flujo polar de auxinas y la función del gen ICU4 en la formación del patrón radial del tallo ..................................... 118 V.7.- Relaciones sinérgicas y antagónicas entre diferentes alelos mutantes de miembros de la familia HD-ZIP III............................................. 121 V.8.- ICU4 participa en la formación del patrón de filotaxia e interacciona con genes implicados en dicho proceso ....................................................... 124 VI.- Conclusiones ............................................................................................. 127 VII.- Bibliografía ................................................................................................. 130 Agradecimientos............................................................................................... 156 Índices VII Índice de Figuras Figura I.1.- Arabidopsis thaliana .................................................................................... 5 Figura I.2.- Representación esquemática del plan corporal de Arabidopsis thaliana .... 9 Figura I.3.- Establecimiento del plan corporal de Arabidopsis thaliana ....................... 10 Figura I.4.- Organización radial de los tejidos en la raíz de Arabidopsis ..................... 12 Figura I.5.- Estructura del meristemo apical de Arabidopsis ....................................... 13 Figura I.6.- Organización radial de los tejidos del tallo en Arabidopsis y tipos de haces vasculares ....................................................................... 17 Figura I.7.- Morfología de la hoja ................................................................................. 20 Figura I.8.- Morfología de la flor de Arabidopsis .......................................................... 22 Figura I.9.- Revisión del modelo ABC.......................................................................... 23 Figura I.10.- Morfología del fruto de Arabidopsis......................................................... 24 Figura I.11.- Establecimiento de los ejes adaxial-abaxial y central-periférico ............. 30 Figura I.12.- Filograma de los miembros de la familia HD-ZIP III de Arabidopsis ....... 32 Figura III.1.- Plásmido pBIN-JIT................................................................................... 44 Figura III.2.- Esquemas de las construcciones transgénicas....................................... 65 Figura IV.1.- Fenotipo de las rosetas basales y de las hojas vegetativas de plantas En-2 e icu4-1 .......................................................................... 71 Figura IV.2.- Cortes transversales de cotiledones de plántulas de 3 días................... 71 Figura IV.3.- Crecimientos anómalos en la superficie abaxial de hojas vegetativas del mutante icu4-1 ............................................................... 72 Figura IV.4.- Alteración de la filotaxia de los mutantes icu4-1 ..................................... 73 Figura IV.5.- Meristemo apical del tallo de plántulas En-2 e icu4-1, 3 días después de la germinación .......................................................... 74 Figura IV.6.- Retraso en el tiempo de floración en los mutantes icu4-1 ...................... 74 Figura IV. 7.- Efectos de la mutación icu4-1 en la diferenciación vascular de los tallos ............................................................................................. 77 Figura IV.8.- La mutación icu4-1 causa defectos en la embriogénesis ....................... 78 Figura IV.9.- Fenotipo de la roseta basal y las hojas vegetativas de hst-1 y del doble mutante icu4-1 hst-1............................................... 79 Índices VIII Figura IV.10.- Fenotipo del pistilo, del fruto y de los estambres de icu4-1, hst-1 y del doble mutante icu4-1 hst-1 .................................................. 80 Figura IV.11.- Fenotipo de pistilos y silicuas de crc-1 y del doble mutante icu4-1 crc-1.............................................................................. 82 Figura IV.12.- Estructura del gen ICU4........................................................................ 85 Figura IV.13.- Fenotipo de las plantas En-2 portadoras de la construcción 35S:ICU4 ............................................................................................... 88 Figura IV.14.- Fenotipo de las plantas En-2 portadoras de la construcción 35S:ICU4-G189D y de una planta icu4-1 con la construcción de interferencia...................................................................................... 89 Figura IV.15.- Análisis de la expresión del gen ICU4 en tallos de inflorescencia de En2 y de icu4-1 mediante hibridación in situ ............................................. 90 Figura IV.16.- Localización de las inserciones de T-DNA de los alelos icu4 y athb8 ........................................................................................... 92 Figura IV.17.- Fenotipos del doble mutante icu4-1 rev-1............................................. 93 Figura IV.18.- Disminución del fenotipo causado por la mutación phb-1d en el doble heterocigoto ICU4/icu4-1;PHB/phb-1d ................... 94 Figura IV.19.- Fenotipo de fil-3 y del doble mutante icu4-1 fil-3 .................................. 95 Figura IV.20.- Fenotipo de pny-40126 y del doble mutante icu4-1 pny-40126 ............ 96 Figura IV.21.- Fenotipo de bp-1 y del doble mutante icu4-1 bp-1................................ 97 Figura IV.22.- Cortes transversales de tallos de inflorescencia de algunos dobles mutantes que muestran un fenotipo alterado............. 100 Figura IV.23.- Cortes transversales de tallos de inflorescencia de plantas transgénicas En-2 que sobreexpresan el cDNA silvestre de ICU4 y el cDNA mutante de icu4-1............................................................... 101 Figura IV.24.- Efectos de los tratamientos de plantas En-2 e icu4-1 con NAA 1µM y NPA 40 µM....................................................................... 103 Índices IX Índice de Tablas Tabla III.1.- Estirpes mutantes utilizadas durante el desarrollo de esta Tesis ............. 42 Tabla III.2.- Oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta Tesis............. 45 Tabla III.3.- Antibióticos utilizados durante el desarrollo de esta Tesis........................ 47 Tabla III.4.- Genotipado molecular de los alelos icu4 .................................................. 67 Tabla III.5.- Valores del estadístico χ2 con distintos grados de libertad (GL)............... 68 Tabla IV.1.- Tiempo de floración y número de hojas que forman la roseta en el silvestre (En-2) y en las plantas mutantes icu4-1 ................ 75 Tabla IV.2.- Análisis histológico del tallo del silvestre En-2 y del mutante icu4-1 ........ 76 I.- Introducción Introducción 2 I.- Introducción I.1.- El desarrollo vegetal Se denomina desarrollo al conjunto de cambios progresivos que experimenta el cigoto hasta que se convierte en un organismo pluricelular adulto. Los principales procesos implicados en el desarrollo son la división, la diferenciación, la migración y la muerte celular, los cuales derivan en la formación de patrones y la morfogénesis. Estos fenómenos, que finalmente desembocan en la construcción del plan general corporal del organismo, están controlados genéticamente (Wolpert et al., 2002; Gilbert, 2003). A lo largo de los siglos, filósofos y científicos se han preguntado acerca del comportamiento coordinado de las células, que permite la formación de los distintos tejidos y órganos que conforman el individuo adulto. Hasta mediados del siglo XIX, el estudio del desarrollo se limitaba a la observación y la descripción de las estructuras, y es a partir de entonces cuando surgió una aproximación multidisciplinar que integraba disciplinas como la Embriología, que inicialmente se dedicaba al estudio descriptivo del desarrollo embrionario, la Citología o estudio de la estructura y la función celular, y más tarde, ya en el siglo XX, la Genética o estudio de la herencia biológica. En la actualidad, la mayoría de los biólogos que realizan estudios causales del desarrollo, tanto animal como vegetal, se dedican al análisis de la función de los genes implicados en la ontogenia (García-Bellido, 1986; Campos-Ortega, 1994). Por lo tanto, la inducción, el aislamiento y la caracterización de mutantes morfológicos han constituido, durante estas últimas décadas, las principales herramientas de trabajo de la Biología del desarrollo, ya que posibilitan la identificación de los genes afectados, responsables últimos de la elaboración de los distintos programas del desarrollo (Jürgens et al., 1991; Wolpert et al., 2002). Históricamente, el análisis del desarrollo vegetal ha recibido menos atención que el del desarrollo animal. Así, algunos conceptos clave de la Biología del desarrollo como los de determinación, diferenciación, totipotencia celular o formación de patrones tienen su origen en el estudio de la ontogenia animal. No obstante, también debemos algunos principios fundamentales a los estudios sobre el desarrollo de las plantas. Entre éstos, podemos citar los conceptos de homología, morfología y equivalencia (Goethe, 1790), la identificación del núcleo y el protoplasma (Brown, 1835), la teoría celular (Schleiden, 1839) o la alternancia de generaciones o ciclo digenético (Hofmeister, 1851). Introducción 3 El estudio del desarrollo vegetal es importante no sólo por la relevancia económica y social de las especies cultivadas, sino también por su contribución al conocimiento de los mecanismos de desarrollo que son específicos de las plantas (Meyerowitz y Pruitt, 1985). Cabe recordar que el desarrollo multicelular de plantas y animales ha evolucionado de forma paralela, ya que el último ancestro común de ambos reinos fue un eucariota unicelular. Por tanto, a pesar de haber evolucionado a partir del mismo conjunto inicial de genes, difieren en sus mecanismos de desarrollo. Es por ello que los estudios comparativos de estos mecanismos en plantas y animales pueden permitirnos determinar si los procesos de diferenciación y formación de patrón en los distintos reinos son similares y representan las únicas vías posibles o si, alternativamente, se han elegido entre una variedad de posibles soluciones, permaneciendo los procesos actuales como resultado del azar evolutivo y la historia filogenética (Meyerowitz, 1994). Algunas de las diferencias entre el desarrollo animal y el vegetal se deben a la presencia de la pared rígida dispuesta alrededor de las células vegetales, que impide las migraciones y los movimientos celulares característicos de la embriogénesis animal. En ausencia de migración celular, la morfogénesis vegetal se basa fundamentalmente en el control de la expansión y la división celular, que posibilita el crecimiento diferencial de las estructuras, y en la diferenciación dependiente de la posición. En relación con este último concepto, el aislamiento celular debido a la presencia de la pared no es total, ya que la existencia de receptores extracelulares y de puentes citoplasmáticos denominados plasmodesmos (Cilia y Jackson, 2004) permite que haya comunicación entre células y procesos de información posicional. Las plantas presentan una estructura corporal simple, con no más de 40 tipos celulares distintos. Este hecho contrasta, en gran medida, con la compleja organización corporal de los animales, en los que podemos distinguir alrededor de 100 tipos celulares distintos (Lyndon, 1990; Howell, 1998). El desarrollo vegetal es, a diferencia del animal, un proceso fundamentalmente postembrionario (Lyndon, 1990; Howell, 1998; Bäurle y Laux, 2003). Así, la embriogénesis sólo genera un rudimento del adulto, de forma que la organogénesis tiene lugar en etapas posteriores a partir de los meristemos. Éstos son estructuras formadas por células sin pared celular diferenciada, capaces de dividirse, expandirse y diferenciarse para dar lugar de manera continua y reiterada a todos los tejidos de la planta, tanto somáticos como reproductivos. A partir del meristemo caulinar o apical se formarán las estructuras correspondientes a las partes aéreas del individuo, siendo el meristemo radicular el responsable de la formación de la raíz. Introducción 4 La totipotencia que caracteriza a las células de los meristemos puede presentarse en otros linajes celulares. Este hecho supone un ejemplo de la enorme plasticidad que presenta el desarrollo vegetal, que permite a las plantas, organismos sésiles, enfrentarse con éxito a las variaciones de su entorno, e indica que la identidad celular, una vez establecida, debe ser mantenida activamente para evitar el retorno al estado indiferenciado de las células meristemáticas (Taylor, 1997; Laux, 2003). I.2.- Utilización de los sistemas modelo en el estudio del desarrollo. Las ventajas del estudio del desarrollo en los sistemas modelo, especies en cuyo análisis experimental se concentran los esfuerzos de un amplio grupo de equipos de investigación, están supeditadas a la posibilidad de extrapolar los conocimientos derivados de su estudio a otros organismos (Bolker, 1995). Puesto que van a utilizarse de forma habitual y sistemática para la experimentación, los organismos modelo deben presentar características que faciliten su mantenimiento y manipulación en el laboratorio, y que, además, permitan la obtención de resultados en un periodo de tiempo razonablemente breve. Lo que caracteriza a estos organismos es un ciclo de vida corto, un tamaño pequeño, su facilidad de propagación y un mantenimiento barato. Además, resulta de mucha utilidad que tanto su morfología como su genoma sean relativamente simples. De esta forma, se facilita la interpretación de los resultados obtenidos durante su estudio. Entre los sistemas modelo utilizados en el estudio de la Biología del desarrollo animal podemos destacar el díptero Drosophila melanogaster, el nematodo Caenorhabditis elegans, el pez cebra (Danio rerio), el anfibio Xenopus laevis, el pollo (Gallus gallus) o el ratón (Mus musculus). Para la elección de especies vegetales, el criterio que se ha seguido durante la mayor parte del siglo XX ha sido el del interés por las plantas empleadas en la agricultura. Es por ello que, inicialmente, la especie mejor estudiada en cuanto a su genética, biología molecular y desarrollo fuera el maíz (Zea mays), una planta de más de dos metros de altura y con una sola generación anual (Fosket, 1994). Algo similar ocurría con otras especies, como el tomate (Lycopersicon esculentum), el guisante (Pisum sativum) o el tabaco (Nicotiana tabacum). La especie más estudiada en la actualidad es Arabidopsis thaliana, seguida por la escrofulariácea Antirrhinum majus. Si bien, en los últimos años, empiezan a utilizarse nuevas especies vegetales, casos de la monocotiledónea Oryza sativa, la leguminosa Medicago truncatula o el briófito Physcomitrella patens. Introducción 5 I.3.- Arabidopsis thaliana como sistema modelo en el estudio del desarrollo vegetal. A partir de mediados de la década de los ochenta, numerosos laboratorios han escogido Arabidopsis thaliana, una crucífera sin valor económico, como sistema modelo para el estudio de los procesos biológicos de las plantas; y en la actualidad, esta especie se ha convertido en la planta modelo por excelencia (Bowman, 1994; Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002). Nada hace pensar que Arabidopsis difiera del resto de las plantas con flores en los aspectos básicos de su biología, por lo que se espera que las conclusiones derivadas de su estudio se puedan aplicar al análisis de numerosos aspectos estructurales y funcionales de otras especies vegetales (Meyerowitz y Somerville, 1994). Arabidopsis thaliana (L.) Heynh. (Fig. I.1) es una planta vascular, una angiosperma Dicotiledónea que pertenece a la amplia familia de las Brasicáceas o Crucíferas, formada por aproximadamente 340 géneros y más de 3.300 especies (Al-Shehbaz, 1984; Strasburger, 1994). A esta familia pertenecen plantas herbáceas, como Capsella bursa-pastoris o diversos Lepidium, o arbustivas, caso del Boleum asperum, así como plantas de interés en la agricultura, como diversas variedades de la col (Brassica oleracea), el rábano (Raphanus sativus), el nabo (B. napus subsp. rapifera), plantas oleaginosas como la colza (B. napus var. arvensis), especias como las mostazas blanca y negra (Sinapis alba y B. nigra, respectivamente) o plantas ornamentales como los alhelíes Erysimum cheiri y Mathiola incana Figura I.1.- Arabidopsis thaliana. (Strasburger, 1994). Al igual que sucede en la mayoría de las crucíferas, Arabidopsis es una especie cosmopolita (Strasburger, 1994), por lo que resulta difícil conocer su origen geográfico exacto. No obstante, se ha sugerido que es originaria de Asia Central (Rédei, 1970), habiéndose dispersado durante los últimos 100.000 años por las regiones de clima moderado (Meyerowitz, 1987; Innan et al., 1997). Arabidopsis fue descubierta y descrita en el siglo XVI por Johannes Thal (de ahí su epíteto específico, thaliana), quien la denominó inicialmente Pilosella siliquosa. A comienzos del siglo XX, Introducción 6 Friedrich Laibach llevó a cabo los primeros estudios con esta crucífera (Laibach, 1907; Rédei, 1970; Bowman, 1994). Sin embargo, no fue hasta la década de los cuarenta cuando el propio Laibach reconoció las bondades de Arabidopsis para su utilización en el trabajo experimental de laboratorio (Laibach, 1943). Así, en 1947, junto a su colaboradora Erna Reinholz, obtuvo la primera colección de mutantes inducidos por rayos-X (citado en Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002; Somerville y Koornneef, 2002). Dos décadas después, tras el descubrimiento de los mutágenos químicos, varios grupos de investigación alabaron las propiedades de Arabidopsis para su utilización en estudios de mutagénesis. En 1964, diversos investigadores que trabajaban con esta crucífera crearon el denominado Arabidopsis Information Service (AIS), que tenía como propósito el intercambio de información entre los distintos grupos. Poco tiempo después, en 1965, se celebró el primer simposio sobre Arabidopsis (http://www.arabidopsis.org/ais/1965/contents01S.html), con lo que comenzó a organizarse la comunidad de científicos que utilizaban esta planta como modelo experimental. Sin embargo, en la década de los setenta, disminuyó el interés por esta crucífera, probablemente por la utilización de otras especies vegetales que ofrecían mayores ventajas como modelos en los estudios fisiológicos. La década de los ochenta puede ser considerada como el resurgir de esta especie en lo que respecta a su uso como organismo modelo para los estudios genéticos, fisiológicos, bioquímicos y moleculares en las plantas, siendo considerada en la actualidad como la Drosophila de la Biología vegetal (Meyerowitz y Pruitt, 1985; Meyerowitz, 1989). Durante estos años, el notable incremento en la cantidad de herramientas disponibles para el trabajo experimental con esta crucífera se ha traducido en un gran aumento en el número de publicaciones sobre Arabidopsis. I.4.- Singularidades de Arabidopsis thaliana. Entre las características que han llevado a que Arabidopsis sea utilizada como organismo modelo en Biología vegetal, destacan su capacidad de crecimiento bajo condiciones controladas, así como su pequeño tamaño, que permite cultivar hasta 10.000 plantas/m2. Presenta, además, un ciclo de vida corto, que se completa en unas 6 semanas, lo que favorece la obtención de hasta 8 generaciones al año en condiciones de cultivo optimizadas para un crecimiento rápido, con temperatura de 25ºC e iluminación continua. Dado que es una especie autógama, se autofecunda sin necesidad de la intervención humana, bastando un solo cruzamiento manipulado para Introducción 7 la obtención de poblaciones F2. Se trata de una especie muy prolífica y su numerosa descendencia, que puede alcanzar las 10.000 semillas por planta, facilita el análisis genético. Las semillas pueden almacenarse varios años a temperatura ambiente, sin pérdida de su viabilidad. Por otro lado, Arabidopsis posee el genoma más pequeño conocido hasta el momento dentro de las plantas superiores, con tan sólo 125 Mb (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), de las que únicamente un 10% constituyen DNA repetido. Estructurado en cinco cromosomas, el pequeño tamaño de su genoma facilita, en gran medida, los estudios moleculares, así como la clonación basada en la cartografía génetica (Leutwiler et al., 1984; Pruitt y Meyerowitz, 1986; Meinke et al., 1998; Meyerowitz, 2001; Page y Grossniklaus, 2002). A pesar de las pequeñas dimensiones de su genoma, Arabidopsis presenta las características típicas de otras angiospermas en lo referente a morfología, anatomía, crecimiento, desarrollo y respuestas al ambiente. Tras la consecución de la secuencia íntegra del genoma de Arabidopsis, se ha podido determinar que contiene un total de 25.498 presuntos genes. Sorprendentemente, este número se acerca al que se ha estimado para la especie humana, cerca de 30.000 genes (International Human Genome Sequencing Consortium, 2001), y es muy superior a los 13.601 predichos para Drosophila melanogaster (Adams et al, 2000) o los 19.099 para Caenorhabditis elegans (The Caenorhabditis elegans Sequencing Consortium, 1998). La facilidad con la que se puede mutagenizar esta planta, ya sea con mutágenos físicos, como los neutrones rápidos o los rayos X, químicos, caso del metanosulfonato de etilo (EMS), o bien mediante transposones o el T-DNA de Agrobacterium tumefaciens, permite la obtención de mutantes con fenotipos de interés que son susceptibles de ser utilizados en el análisis genético para el abordaje de problemas biológicos concretos. No obstante, aproximadamente el 65% de los genes de Arabidopsis son miembros de alguna familia génica (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), lo que complica los estudios genéticos. Una estrategia para solventar los problemas asociados a la redundancia génica es el aislamiento de alelos de ganancia de función o de alelos dominantes negativos (Estelle y Somerville, 1986; Bleecker et al., 1988; Wilson et al., 1996; McConnell y Barton, 1998; Weigel et al., 2000; McConnell et al., 2001; Dievart et al., 2003; Shpak et al., 2003; Prigge et al., 2005). Así mismo, la genética inversa ha resultado muy productiva en el estudio de familias génicas con redundancia funcional (Hua y Meyerowitz, 1998; Siegfried et al., 1999; Pelaz et al., Introducción 8 2000; Alonso et al., 2003; Franklin et al., 2003; Friml et al., 2003; Pinyopich et al., 2003). Estos trabajos se han centrado en pequeñas familias génicas o en grupos de genes relacionados pertenecientes a grandes familias. Con el empuje de las nuevas tecnologías, ha incrementado enormemente el número disponible de herramientas bioinformáticas para el análisis de Arabidopsis. Así, en la dirección de Internet correspondiente al TAIR (The Arabidopsis Information Resource), http://www.arabidopsis.org, podemos encontrar periódicamente actualizaciones de la información acerca de genes, mutantes, polimorfismos, medios de cultivo y demás herramientas de utilidad en el estudio de la biología de esta crucífera (García-Hernández et al., 2002). I.5.- Estructura corporal de Arabidopsis thaliana. El desarrollo vegetativo de Arabidopsis comienza con la germinación, tras la rotura de la cubierta de la semilla y la emergencia de la radícula. A continuación, se produce la elongación del hipocotilo y el desarrollo de las hojas vegetativas. Al final del desarrollo vegetativo, tras la integración de distintas señales tanto exógenas (luz, fotoperiodo, nutrientes, temperatura) como endógenas (hormonas, regulación génica), tiene lugar la transición floral, con lo que la planta pasa de una fase vegetativa a una reproductiva (Martínez-Zapater y Somerville, 1990; Blázquez et al., 2001; Mouradov et al., 2002; Simpson y Dean, 2002). El meristemo radicular da origen a toda la raíz, mientras que las partes aéreas de la planta se generan a partir del meristemo apical, mediante la producción reiterada de unidades denominadas fitómeros (Galinat, 1959) o metámeros (White, 1984). Se han descrito tres tipos de fitómeros en Arabidopsis (Schultz y Haughn, 1991), cada uno de los cuales se origina en una etapa distinta del ciclo de vida (Fig. I.2). Básicamente, los tres se disponen según un patrón de filotaxia espiral, con un ángulo de divergencia entre órganos sucesivos de aproximadamente 137,5°. Los fitómeros de tipo 1 se forman durante la fase de desarrollo vegetativo, y se caracterizan por la elongación casi nula de los entrenudos, con lo que se forma una roseta basal. Cada nudo está constituido por una hoja vegetativa y un meristemo axilar del que puede surgir una rama o inflorescencia secundaria (paraclado). Pueden distinguirse dos fases: una roseta temprana, formada por dos pares de hojas juveniles redondeadas, pequeñas y enteras, que carecen de tricomas en su superficie ventral o envés y se disponen según un patrón de filotaxia decusada, es decir, cada par de hojas muestra Introducción 9 un ángulo de divergencia de 180°; y Tallo principal una roseta adulta, formada por hojas aserradas de mayor tamaño, con tricomas en sus dos superficies y dispuestas filotaxia según espiral un patrón de (Martínez-Zapater, 1994; Haughn et al., 1995). Una vez aparecen las hojas de la roseta adulta, el resto de hojas y flores se generarán en el tallo siguiendo un patrón de filotaxia espiral. También Hojas caulinares para el tallo principal o inflorescencia primaria se consideran dos fases, una de ellas temprana, formada por Hojas de la roseta fitómeros de tipo 2 que presentan largos entrenudos y hojas caulinares Figura I.2.- Representación esquemática del plan con ramas laterales (inflorescencias corporal de Arabidopsis thaliana. Se muestra los tres secundarias o paraclados) en sus tipos de fitómeros (1, 2 y 3). O, flores; 2p y 3p axilas. En este tipo de fitómero paraclados orden, puede aparecer una segunda rama respectivamente; *, axila sin paraclado en una rama (rama accesoria) entre la axilar y la de segundo y tercer accesoria. Tomado con modificaciones de Talbert et al., 1995. hoja caulinar (Fig. I.2). En etapas más tardías, el tallo principal está formado por fitómeros de tipo 3. Éstos constituyen la porción terminal fértil que confiere al tallo la denominación de inflorescencia (Weberling, 1989). Los fitómeros de tipo 3 presentan entrenudos no muy largos y nudos con flores no acompañadas de hojas. Según Goethe (1790), las flores son tallos especializados que presentan órganos florales en lugar de hojas. Por lo tanto, las flores de Arabidopsis pueden considerarse como ramas florales homólogas a las ramas axilares; aunque, mientras que las flores presentan un crecimiento determinado y están formadas por tipos especiales de fitómeros (cuatro verticilos de órganos concéntricos), el crecimiento indeterminado de las ramas axilares y accesorias repite, en parte, el patrón de fitómeros del tallo principal (Weberling, 1989), pudiéndose observar paraclados de segundo y, eventualmente, de tercer orden (Fig. I.2). Introducción 10 I.6.- Desarrollo de Arabidopsis thaliana. I.6.1.- Desarrollo embrionario. El plan básico de la organización corporal del organismo adulto se genera durante la embriogénesis (Jürgens et al., 1991; Mayer et al., 1991). Esto implica la formación de los meristemos radicular y caulinar o apical, los cotiledones, la radícula y el hipocotilo, y resulta en el establecimiento del eje apical-basal de la planta y la formación de un patrón radial que se manifiesta en la ordenación concéntrica de la epidermis y la vasculatura. Estos elementos de patrón se establecen muy tempranamente durante la embriogénesis y se mantienen a lo largo del ciclo de vida de la planta (Laux y Jürgens, 1997). El desarrollo embrionario de Arabidopsis es muy similar al de Capsella bursapastoris, otro miembro de la familia de las Brasicáceas, utilizada habitualmente como modelo de la embriogénesis de las plantas dicotiledóneas (Esau, 1977). Los estadios de la embriogénesis se han definido de acuerdo al número de células derivadas de la célula apical o a la forma de los embriones en desarrollo: cigoto, dos células terminales, cuadrante, octante, dermatógeno, globular, triangular, corazón, torpedo y cotiledonar (Fig. I.3). E D A B cot C mc cot mc pd hc ca cb rd su mr Figura I.3.- Establecimiento del plan corporal de Arabidopsis thaliana. (A) Estadio de dos células terminales. Mediante una división asimétrica del cigoto se forma una célula apical (ca) y una basal de mayor tamaño (cb). (B) Estadio de octante. A partir de la célula basal se ha generado el suspensor (su). (C) Estadio de dermatógeno. Divisiones tangenciales separan el protodermo (pd) de las células internas. (D) Estadio de corazón. El dominio apical del embrión se divide en cotiledones (cot) y meristemo caulinar o apical (mc). (E) Plántula. A lo largo del eje apical-basal se sitúan los cotiledones, el meristemo apical, el hipocotilo (hc), la radícula (rd) y el meristemo radicular (mr). Tomado con modificaciones de Laux y Jürgens, 1997. Introducción 11 La primera división del cigoto en Arabidopsis es transversal y asimétrica, y produce una pequeña célula apical o terminal (chalazal), que dará lugar a la mayor parte del embrión, y a una célula basal alargada (micropilar), de la que derivarán la radícula y el suspensor, un tejido extraembrionario a través del cual el embrión obtiene nutrientes de la madre (Fig. I.3). Esta división inicial establece el eje apical-basal, que se alinea con el eje chalaza-micrópilo, lo que sugiere una orientación influida por el tejido materno circundante. Mediante dos divisiones longitudinales y una división transversal, se obtiene un embrión octante de ocho células. Cada una de estas ocho células se divide tangencialmente produciendo un embrión de 16 células, el dermatógeno, con ocho células internas y ocho protodermales externas. Las células protodermales del dermatógeno sufren divisiones anticlinales, mientras que las células internas se dividen longitudinalmente. Esto da lugar al establecimiento del patrón radial que, por lo tanto, se produce durante el estadio dermatógeno. Las células protodermales acabarán formando la epidermis, mientras que el procámbium derivará de las células internas, de manera que la mayoría de los elementos de patrón ya se pueden visualizar en el estadio globular. El primordio del procámbium, consistente en células estrechas derivadas de las células internas, se sitúa justo encima del primordio de la raíz. A continuación, las divisiones celulares en la región de los futuros cotiledones y la elongación celular en la región del procámbium confieren al embrión una simetría bilateral, adoptando una forma triangular. Mediante sucesivas divisiones celulares la región apical se engrosa lateralmente, formándose los primordios de los cotiledones, con lo que se inicia la etapa de corazón, en la que el hipocotilo se expande y se completa el primordio de la raíz. Como resultado de una serie de divisiones rápidas y de elongaciones celulares, el embrión adopta la forma característica que justifica que el siguiente estadio reciba la denominación de torpedo. Además, el tejido provascular comienza a diferenciarse en la base de los cotiledones. Las células centrales del hipocotilo y del primordio de la radícula se diferencian, formando el tejido vascular primario. Por último, se produce la desecación del embrión y su entrada en el estado de dormancia que persistirá hasta que las condiciones ambientales sean favorables, lo que inducirá la germinación, iniciándose el periodo de desarrollo postermbrionario (Jürgens et al., 1991). I.6.2.- Origen y estructura de los meristemos radicular y apical. Los meristemos radicular y apical, que se originan durante la embriogénesis en los polos opuestos del eje apical-basal, son los responsables últimos de la arquitectura postembrionaria de la planta. Ambos meristemos difieren tanto en el momento en el que se originan como en su organización celular. El meristemo Introducción 12 radicular se forma relativamente pronto durante la embriogénesis, en el estadio corazón, y consta de tres filas de células iniciales que darán lugar a un linaje celular bien definido (Mayer et al., 1993). El meristemo apical, por su parte, surge más tarde, en el estadio torpedo, y muestra una organización túnica-corpus con un linaje celular que no está definido de forma estricta (Barton y Poethig, 1993). Las tres filas de células que forman el meristemo radicular rodean a un grupo de células mitóticamente inactivas, el centro quiescente (Dolan et al., 1993). Por encima del centro quiescente se van añadiendo células a las capas concéntricas de tejido radicular, de manera que, siguiendo un patrón radial, se forman la epidermis, el córtex, el endodermo, el periciclo y el tejido vascular (Fig. I.4). El meristemo de la raíz comienza a ser activo en el estadio corazón, en el que la raíz embrionaria comienza a extenderse. A B Epidermis Protofloema Cortex Centro quiescente Endodermo Caliptra lateral Periciclo Células iniciales Protoxilema Columnela Figura I.4.- Organización radial de los tejidos en la raíz de Arabidopsis. (A) Sección longitudinal del ápice radicular. (B) Sección transversal de la raíz aproximadamente a 1 mm del ápice. Los diferentes tipos celulares se indican con un código de colores. Tomado con modificaciones de Dolan et al., 1993. El meristemo apical, que se forma a partir de un grupo de células situado en la mitad superior del embrión globular, se organiza en zonas y capas (Steeves y Sussex, 1989; Kerstetter y Hake, 1997; Fig. I.5). Durante la transición del estadio corazón al torpedo, se definen tres capas distintas de células que formarán la túnica (L1 y L2) y el corpus (L3) del meristemo apical. La capa superior de la túnica (L1) deriva del protodermo y dará lugar a la epidermis de la planta, mientras que la capa inferior de la túnica (L2), que formará el mesófilo, y el corpus (L3), que formará el tejido vascular, derivan de las células embrionarias internas. En el estadio embrionario de Introducción 13 torpedo, el patrón de divisiones celulares se caracteriza por una organización túnicacorpus (Barton y Poethig, 1993). Yuxtapuesta a esta estructura en capas, existe un segundo nivel de organización que divide al meristemo en dos regiones diferentes, tanto anatómica como funcionalmente, denominadas zona central (ZC) y zona periférica (ZP; Fig. I.5 A). La zona central se caracteriza por una baja tasa de división y es donde se localizan las células totipotentes que actuarán como reserva celular de la región periférica. A medida que las células de la zona central se incorporan a la región periférica, se inicia su diferenciación. Estas células pasarán a formar parte de los primordios de los órganos laterales o bien de los entrenudos, siendo reemplazadas por células de la región central. B A C Figura I.5.- Estructura del meristemo apical de Arabidopsis. Dominios de expresión de genes implicados en su formación y mantenimiento. (A) Representación esquemática de un corte longitudinal del meristemo donde se observa su organización en zonas (CZ, zona central; PZ, zona periférica) y en capas (L1, L2 y L3). (B) Representación esquemática de un corte longitudinal del meristemo, representados en color verde los primordios de los órganos laterales y en morado el meristemo, donde se indican los dominios de expresión de los genes CLAVATA (CLV; CLV1, indicado en rojo; CLV3, en naranja) y WÜSCHEL (WUS; indicado en azul). (C) Vista transversal del ápice del tallo donde se muestran los dominios de expresión de los genes KNOX, SHOOTMERISTEMLESS (STM) y KNAT1 y de los genes ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) y AS2. Tomado con modificaciones de Tsiantis y Hay, 2003. I.6.2.1.- Genes implicados en la formación y el mantenimiento del meristemo apical. El análisis de los mutantes afectados en la formación y el mantenimiento del meristemo apical ha permitido la identificación de genes que participan en estos procesos (Fig. I.5 B y C). Los genes CLAVATA (CLV1, CLV2 y CLV3; Clark et al., 1993; 1997; Kayes y Clark, 1998; Brand et al., 2000) restringen la acumulación de Introducción 14 células totipotentes en los meristemos apical y floral. Los mutantes de pérdida de función clv1, clv2 y clv3 presentan rasgos fenotípicos similares: meristemos de gran tamaño, tallos fasciados y mayor número de órganos florales, típicamente carpelos (Clark et al., 1993; 1997; Kayes y Clark, 1998; Fletcher et al., 1999). CLV1 y CLV2 codifican receptores transmembrana con una región extracelular rica en leucina (LRR; leucine-rich repeat; Clark et al., 1997). CLV3 codifica un pequeño polipéptido que es secretado al espacio intercelular (Fletcher et al., 1999). CLV3 se expresa en la zona central de las capas L1 y L2, y su producto se une al complejo CLV1/CLV2 en L3 (Trotochaud et al., 1999; Rojo et al., 2002; Lenhard y Laux, 2003). La ruta de transducción de señales activada por las proteínas CLV, regula negativamente la actividad del gen WÜSCHEL (WUS) y restringe su dominio de expresión a un pequeño grupo de células de la capa L3 (Mayer et al., 1998; Fig. I.5 B). WUS, que codifica un factor de transcripción con homeodominio, activa la expresión de CLV3, y está implicado en la iniciación y localización de la población de células meristemáticas indiferenciadas en el meristemo apical, función que ya desempeñaba durante la embriogénesis. En los mutantes wus las células meristemáticas son incapaces de mantener su estado indiferenciado, lo que resulta en una terminación prematura del meristemo (Laux et al., 1996; Mayer et al., 1998). El tamaño y la posición de la población de células totipotentes del meristemo son, por tanto, regulados por esta vía de señalización. Para el mantenimiento del meristemo, también se requiere la actividad del gen KNOX (KNOTTED-like HOMEOBOX) de la clase I SHOOT MERISTEMLESS (STM; Long et al., 1996) y de otros genes pertenecientes a dicha familia. Los mutantes stm son incapaces de formar y mantener un meristemo apical funcional (Barton y Poethig, 1993). La proteína STM inhibe la diferenciación de la zona central del meristemo mediante la represión de la expresión de los genes ASYMMETRIC LEAVES1 (AS1) y AS2 (Fig. I.5 C), que están implicados en promover la formación de órganos laterales en la zona periférica (Byrne et al., 2000; 2002; Semiarti et al., 2001; Iwakawa et al., 2002) y también participan en el establecimiento de la polaridad en el eje dorsoventral o adaxial-abaxial de los órganos laterales (Xu et al., 2003). I.6.3.- El desarrollo postembrionario. El desarrollo vegetal es fundamentalmente postembrionario. Durante la embriogénesis sólo se define el plan corporal básico del adulto, y es en etapas posteriores cuando tiene lugar la organogénesis a partir de los meristemos apical y radicular. Las plantas superiores están generalmente compuestas de dos clases Introducción 15 distintas de órganos en base a su crecimiento y simetría. Las raíces y los tallos son órganos indeterminados que presentan un crecimiento apical a partir de los meristemos apical y radicular, así como un crecimiento radial a partir del cámbium vascular, y poseen simetría radial. Los órganos laterales, como las hojas y los órganos florales, son órganos determinados que presentan un crecimiento lateral, y polaridad y asimetría en los ejes próximo-distal y dorsoventral o adaxial-abaxial (adaxial, próximo al meristemo, y abaxial, alejado del meristemo). El crecimiento diferencial y asimétrico a lo largo de estos ejes resulta en la gran variedad de formas observadas, desde los complicados pétalos de las orquídeas hasta las hojas reducidas de las acacias. La relación entre los órganos laterales y el meristemo apical, a partir del cual se desarrollan, es la base para la formación de los ejes de simetría. Experimentos quirúrgicos han sugerido que el meristemo apical produce una señal requerida para que las células adopten el destino correcto en el eje adaxial-abaxial (Sussex, 1954), y estudios genéticos recientes han llevado a la identificación de varios genes que se expresan en los órganos laterales y están probablemente implicados en la interpretación de la señal emitida por el meristemo apical (McConnell y Barton,1998; McConnell et al., 2001; Eshed et al., 2001. Véase el apartado I.6.4). I.6.3.1.- El desarrollo del tallo. El tallo es la parte aérea de las cormofitas que da soporte a los órganos laterales y las ramas. Crece buscando la luz, con geotropismo negativo, al contrario que la raíz, y presenta simetría radial. Desde el exterior al interior, está formado por la epidermis, la corteza, el cilindro central y la médula (Fig. I.6 A). La epidermis proviene de la capa L1 del meristemo y está formada por una sola fila de células rectangulares. Por debajo de la epidermis está la corteza, constituida por un número variable de capas de parénquima. La capa más profunda de la corteza se denomina endodermo y delimita el tránsito al cilindro central o estela. Ésta, en Arabidopsis, es una eustela, ya que contiene haces vasculares discretos que se disponen formando un anillo alrededor de una médula formada por células parenquimatosas de gran tamaño con cloroplastos o amiloplastos. La eustela está constituida fundamentalmente por el sistema vascular y por células parenquimatosas que rellenan todos los huecos entre los distintos componentes vasculares. Hay diferencias notables entre los diversos grupos vegetales respecto a la estructura primaria del tallo, principalmente en lo que concierne al desarrollo del sistema vascular, del que depende la distribución del agua y la conexión de las hojas y el tallo. El sistema vascular presenta caracteres propios en pteridofitas, Introducción 16 monocotiledóneas y dicotiledóneas, y es el exponente más significativo del grado de complejidad estructural de un vegetal. En cualquier caso, está constituido por el xilema, que contiene tráqueas, traqueidas, fibras del xilema y parénquima, y el floema, que está formado por tubos y células cribosas, células anexas, células albuminíferas, fibras liberianas y parénquima (Paniagua, 2002). I.6.3.1.1.- Diferenciación del sistema vascular. El sistema vascular constituye una elaborada red de tejidos conductores que conecta todos los órganos de la planta, transportando agua, minerales, compuestos orgánicos y moléculas de señalización. Está formado básicamente por los dos tejidos conductores anteriormente mencionados, el xilema y el floema, y por células de los meristemos vasculares, el cámbium y el procámbium (Paniagua, 2002). El sistema vascular del tallo se origina a partir del procámbium. Éste se aprecia ya en la zona más profunda del meristemo apical como cordones celulares que se tiñen intensamente con azul de toluidina. Según la especie vegetal, el procámbium aparece como un cilindro hueco, que es la disposición más frecuente en las gimnospermas y las dicotiledóneas; como un cilindro sólido, en cuyo interior no hay médula; o como un sistema de cordones paralelos al eje longitudinal del tallo, que forman, unos respecto a otros, un cilindro discontinuo o una serie de cordones dispersos, siendo esta disposición, la atactostela, la típica en los tallos de las monocotiledóneas (Paniagua, 2002). El cilindro del procámbium, o cada cordón procambial, da lugar inicialmente a protoxilema y protofloema. En la mayoría de los tallos, el xilema se diferencia de forma centrífuga, es decir, los elementos más maduros o metaxilema quedan en posición más externa que los menos maduros o protoxilema. El floema, por el contrario, se diferencia de forma centrípeta, quedando el metafloema en posición más interna que el protofloema (Paniagua, 2002). Existen varios tipos de haces vasculares (Ye et al., 2002; Fukuda, 2004; Fig. I.6 B). En gimnospermas, dicotiledóneas y en algunas monocotiledóneas, el cilindro vascular –o cada haz vascular, según la planta– es de tipo colateral, esto es, con el floema situado en una zona más periférica que el xilema. En la mayoría de las monocotiledóneas el patrón es anfivasal, con el xilema rodeando al floema. En las cucurbitáceas y las solanáceas, los haces son de tipo bicolateral, es decir, con el floema ocupando las posiciones más interna y más externa y el xilema en medio. En los helechos, el haz vascular es anficribal, con el floema rodeando al xilema. En los tallos de licopodiáceas la disposición es radial, observándose un xilema cruciforme en cuyos huecos se dispone el floema. Introducción 17 El tallo de Arabidopsis consta de 7 a 9 haces vasculares, en los que el xilema y el floema adoptan un patrón colateral, separados por regiones interfasciculares ocupadas por fibras lignificadas (Ye et al., 2002; Fig. I.6 A). ep A B f pr Colateral Bicolateral Anficribal Anfivasal m Figura I.6.- Organización radial de los tejidos del tallo en Arabidopsis y tipos de haces vasculares. (A) Corte transversal de un tallo de inflorescencia de Arabidopsis donde se observa del exterior al interior, la epidermis (ep), la corteza (co), el endodermo (e), las fibras interfasciculares (if) y los haces vasculares, formados por floema (f), procambium (pr) y xilema (x), situados en la eustela, y la médula (m). (B) Diferentes tipos de haces vasculares según la disposición relativa del xilema (rojo) y el floema (verde). Tomado con modificaciones de Zhong y Ye, 2001 (A) y de Fukuda, 2004 (B). I.6.3.1.2.- Papel de las hormonas vegetales en la formación del patrón vascular. El desarrollo vascular comienza en el embrión con la formación de las células provasculares que, con posterioridad, darán lugar a células del procámbium a partir de las cuales se diferenciarán los tejidos conductores (Steeves y Sussex, 1989). En las partes más viejas de la planta, los tejidos vasculares pueden desarrollarse a partir del meristemo secundario denominado cámbium vascular (Esau, 1965). Las hormonas vegetales, como las auxinas, las citoquininas y los brasinoesteroides, tienen una función reguladora en la diferenciación de los tejidos vasculares (Ye, 2002; Fukuda, 2004). Experimentos llevados a cabo en los años 50 demostraron que los efectos inductivos que ejercían las hojas y los primordios de órganos en el desarrollo vascular podían ser reemplazados por la aplicación de auxinas (Jacobs, 1952; Young, 1953). Trabajos posteriores han demostrado el efecto de las auxinas, tanto en la inducción como en la formación del patrón que adopta el tejido vascular (Bennet et al., 1998; Berleth y Mattson, 2000; Ye, 2002). Sachs llevó a cabo un gran número de experimentos en los que investigó la inducción del tejido vascular con auxinas (Sachs, 1981; 1991), a partir de los cuales propuso la hipótesis de la canalización. Según ésta, elevados niveles de auxina incrementan la capacidad celular para su transporte polar, lo que genera un mecanismo de retroalimentación positiva que permite la canalización del flujo de la hormona. La diferenciación vascular tiene lugar, dentro de las regiones Introducción 18 por las que fluye la auxina, en los sitios de máxima concentración de ésta. La identificación de la proteína PINFORMED1 (PIN1) fue un apoyo para la hipótesis de la canalización. PIN1 es esencial para el transporte polar de auxina y, normalmente, se localiza en la membrana basal de la célula (Galweiler et al., 1998). Durante el desarrollo embrionario, se produce la transición de una localización de PIN1 uniforme, por toda la membrana celular, a una orientada a lo largo del eje apical-basal, lo que es consistente con un mecanismo de retroalimentación positiva por auxina (Steinmann et al., 1999). Además, la localización anormal de PIN1 en los mutantes emb30/gnom resulta en una proliferación de tejido vascular acorde con el reparto de auxinas a tipos celulares inapropiados (Steinmann et al., 1999; Koizumi et al., 2000). Sachs también sugirió la existencia de una función implicada en la inhibición del desarrollo de los haces vasculares. Éstos, formados en los sitios con elevadas tasas de transporte de auxina, son capaces de inhibir el desarrollo de nuevos haces en sus proximidades (Sachs, 1981; 1991). Aunque las auxinas son capaces de inducir la formación de primordios, una vez formados, la región adyacente a esos primordios se vuelve insensible a posteriores aplicaciones de la hormona. El mecanismo por el cual las auxinas, u otras moléculas producidas por los primordios en desarrollo, ejercen su acción inhibidora no se conoce (Reinhardt et al., 2000). El aislamiento de mutantes que presentan islas de tejido vascular no conectadas a tejido vascular preexistente son difíciles de explicar mediante la hipótesis de la canalización (Carland et al., 1999; Deyholos et al., 2000; Koizumi et al., 2000). Algunos de estos mutantes responden de forma normal a tratamientos con auxina y se explican más fácilmente mediante la hipótesis de la difusión-reacción. Esta hipótesis se basa en un modelo computacional y propone que la interacción de dos sustancias que difunden, con tasas de difusión diferentes, regula la formación autónoma de venas en un tejido inicialmente uniforme. Una de esas sustancias promueve la inducción del tejido vascular, mientras que la otra resulta en la inhibición del desarrollo vascular (Koch y Meinhardt, 1994). Aunque se conocen sustancias con efectos inductores, como las auxinas, aún no se ha descrito compuesto alguno capaz de inhibir el desarrollo vascular. Los mecanismos moleculares que controlan la formación del patrón vascular todavía no se conocen. Se ha aislado un número limitado de mutantes que muestran un patrón vascular alterado en el tallo. El mutante amphivasal vascular bundle (avb1; Zhong et al.,1999) presenta un incremento en el número de haces vasculares en el tallo, algunos de los cuales pierden su localización normal en la eustela y se sitúan, de manera anormal, en la médula. Sus haces vasculares muestran, además, un patrón anfivasal. Otro mutante, acaulis5 (acl5; Hanzawa et al., 1997), presenta una cubierta Introducción 19 de células con paredes engrosadas que rodea a los haces vasculares. Aunque el número de haces vasculares en las plantas acl5 es similar al silvestre, la cantidad de tejido vascular diferenciado es mayor en el mutante. CONTINUOUS VASCULAR RING1 (COV1; Parker et al., 2003) está implicado en el mantenimiento del patrón vascular ordenado del tallo. Mutaciones en este gen alteran el patrón vascular, resultando en un anillo continuo de xilema y floema, con muy poco tejido interfascicular. COV1 es una proteína de membrana que podría participar en una vía de señalización que regulara negativamente la diferenciación del tejido vascular. I.6.3.2.- El desarrollo de la hoja. Las hojas son órganos laterales con una función primordial en la fotosíntesis. Se originan en los flancos del meristemo apical, donde las células fundadoras se dividen rápidamente para formar pequeñas excrecencias, denominadas hojas P1, que adquirirán una apariencia plana conforme se van desarrollando. En Arabidopsis , el mecanismo que permite distinguir las células fundadoras del órgano de las de división lenta presentes en el meristemo implica la ausencia de transcripción de los genes KNOX de clase I STM (véase apartado I.6.2.1), BREVIPEDICELLUS (BP, también conocido como KNAT1), KNAT2 y KNAT6 en la posición donde se iniciará la hoja. De hecho, STM nunca se expresa en los primordios foliares, lo que permite la transcripción de los genes AS1 y AS2 (véase apartado I.6.2.1) en las hojas P1 (Byrne et al., 2000; 2002). Ambos genes interaccionan en la misma vía para promover la diferenciación de las células de los primordios foliares mediante la represión de BP, KNAT2 y KNAT6 (Semiarti et al., 2001; Byrne et al., 2002). A medida que se desarrolla, la hoja se aparta del ápice y toma forma de lámina ovalada. En cada hoja, se distingue un pecíolo, que conecta con el tallo, y el limbo o lámina foliar, que es el órgano fotosintético por excelencia (Fig. I.7 A). El limbo es quizá el órgano más polimorfo de los vegetales. Generalmente, es una lámina aplanada que muestra polaridad a lo largo del eje dorsoventral (adaxial-abaxial). No obstante, también puede adquirir una forma cilíndrica, como en las coníferas, un aspecto tubular, como en algunas plantas insectívoras, o estar aplanadas lateralmente, como es el caso de Iris. Los primordios foliares se forman mediante la proliferación de grupos de células situados en la capa superficial del meristemo apical (coníferas y algunas monocotiledóneas) o en la segunda o tercera capa de células del meristemo (dicotiledóneas y algunas monocotiledóneas). La asimetría en la lámina foliar a lo largo del eje adaxial-abaxial se manifiesta en la existencia de dos caras con características distintas, una adaxial o dorsal, el haz, y otra ventral o abaxial, el envés (Fig. I.7 B). Introducción 20 La epidermis aísla a la hoja de su entorno y regula el intercambio de gases con el exterior. Contiene abundantes estomas y tricomas, siendo éstos más abundantes en la superficie adaxial. El mesófilo está fundamentalmente formado por parénquima, con dos estratos diferentes: el parénquima en empalizada y el parénquima lagunar. El parénquima en empalizada se sitúa inmediatamente por debajo de la epidermis adaxial, estando constituido por células prismáticas y alargadas en la orientación dorsoventral, que dejan pocos espacios intercelulares. Estas células contienen abundantes cloroplastos que se disponen en la periferia celular. El parénquima lagunar está formado por células que contienen menos cloroplastos que el parénquima en empalizada y son de forma irregular y variable, aunque siempre presentan lóbulos que les permiten unirse entre sí dejando grandes espacios llenos de aire (Fig. I.7 B). Se puede decir que si el parénquima en empalizada está especializado en la fotosíntesis, el parénquima lagunar lo está en el intercambio de gases que, a través de las cámaras subestomáticas y los estomas, alcanzan el exterior. Con ello, aumenta la eficacia de la fotosíntesis. B A distal ad pe pl xi fl proximal ab Figura I.7.- Morfología de la hoja. (A) Hoja de Antirrhinum que presenta un pecíolo proximal y un limbo distal. (B) Corte transversal de una hoja de Arabidopsis donde se observa la asimetría en el eje adaxialabaxial: epidermis adaxial (ad), parénquima en empalizada (pe), parénquima lagunar (pl), epidermis abaxial (ab), xilema en posición adaxial (xi) y floema en posición abaxial (fl). Modificado de Golz y Hudson, 2002 (A) y Bowman et al., 2002 (B). En la hoja entran varios haces vasculares que pueden continuar paralelos a lo largo de todo el órgano, situación común en las monocotiledóneas, o ramificarse, como sucede en muchas dicotiledóneas. El conjunto de esta estructura vascular se denomina venación. Las venas pequeñas incluyen un haz vascular con sus tejidos protectores, mientras que las grandes venas están formadas por un grupo de haces vasculares. En Arabidopsis, el patrón de venación es broquidódromo (Candela et al., 1999). La vena mayor es la que penetra por la base de la hoja, dando lugar a la gran Introducción 21 vena central o principal. De ella se van separando grandes ramas hacia los lados, que se anastomosan entre sí, formando una serie de arcos que no llegan a alcanzar el margen foliar. Además, se observa toda una serie de venas secundarias y terciarias que unen la principal y las grandes venas, produciendo territorios intervasculares de la hoja o areolas. Las ramificaciones venosas de menor tamaño terminan en extremos ciegos muy finos. I.6.3.3.- El desarrollo de los órganos florales. En las angiospermas, los órganos implicados en las funciones reproductoras se localizan en estructuras especializadas llamadas flores. La flor se puede considerar como un eje caulinar, denominado pedúnculo, más o menos reducido y de crecimiento definido, que se ensancha en el extremo apical, formando el tálamo o receptáculo. Éste da asiento a los verticilos, que contienen filomas transformados en órganos florales. Los órganos sexuales forman el androceo y el gineceo, mientras que otra serie de filomas, que constituyen el cáliz y la corola, tienen una función colateral, de tipo auxiliar del proceso reproductivo. La flor se origina en el período reproductivo a partir del meristemo apical del tallo principal o de las ramas laterales. En una flor, desde el verticilo más externo al más interno, encontramos los órganos siguientes: los sépalos y los pétalos, que forman el perianto que rodea a los órganos reproductores; los estambres, que son un grupo de filamentos rematados en una parte dilatada apical llamada antera, donde se forman los gametófitos masculinos, y los carpelos, que constan de una parte basal dilatada llamada ovario, donde se forman los gametófitos femeninos, se prolongan en un cuello alargado, el estilo, y terminan en una posición apical denominada estigma (Fig I.8). La flor de Arabidopsis ha sido descrita con gran detalle, tanto en cuanto a su morfología como a su ontogenia (Smyth et al., 1990). Presenta la estructura típica de las flores de las Brasicáceas, con simetría radial. Se compone de cuatro verticilos concéntricos, que comprenden cuatro sépalos, cuatro pétalos situados en posiciones alternas a las de los sépalos, seis estambres y dos carpelos que se fusionan formando un pistilo (Fig. I.8). El orden de aparición de los verticilos suele darse de acuerdo con su posición en el tálamo. El ritmo de crecimiento de cada verticilo suele ser diferente al de los demás y no guarda relación con la cronología de su aparición. Así, en Arabidopsis, los pétalos surgen antes que los estambres, aunque luego se desarrollan con más lentitud. Los carpelos tienen un crecimiento inicial más rápido que el de los estambres, pero el de éstos continúa mientras se detiene el de aquéllos, con lo que los estambres Introducción 22 rebasan finalmente a los carpelos, quedando la antera en una posición idónea para la polinización del estigma. A estambres carpelos B pétalo sépalo pétalos sépalos estambre pedicelo pistilo Figura I.8.- Morfología de la flor de Arabidopsis. (A) Fotografía de una flor de Arabidopsis donde se indican sus órganos. (B) Diagrama floral de Arabidopsis donde se representan sus cuatro verticilos concéntricos, que comprenden cuatro sépalos, cuatro pétalos, seis estambres y dos carpelos que se fusionan formando un pistilo. Tomado con modificaciones de http://www.salk.edu/LABS/pbio-w/gallery.html (A) y www.botany.ubc.ca/ haughn/overview.htm (B). Las flores se forman a partir de meristemos florales que derivan de los meristemos de inflorescencia. Ambos meristemos son muy similares en estructura, pero mientras que los meristemos de inflorescencia son indeterminados, los meristemos florales son determinados y tras producir un número finito de órganos se detiene su crecimiento. Esto implica el cese de la actividad de las células meristemáticas indiferenciadas y su incorporación a los primordios de los órganos florales (Okamuro et al., 1996; Poutau et al., 1997; Washburn y Thomas, 2000; Zik e Irish, 2003). Genes importantes en Arabidopsis para la identidad del meristemo floral son AGAMOUS (AG; Bowman et al., 1989; Yanofsky et al., 1990), LEAFY (LFY; Schultz y Haughn, 1991; Huala y Sussex, 1992; Weigel et al., 1992), APETALA1 (AP1; Irish y Sussex, 1990; Mandel et al., 1992; Bowman et al., 1993), AP2 (Kunst et al., 1989; Riechmann y Meyerowitz, 1998) y CAULIFLOWER (CAL; Bowman et al., 1993). Algunos de ellos participan también en la determinación de los órganos florales (Fig. I.9; ver más adelante). La expresión de AG, un factor de transcripción de tipo MADS, se inicia en etapas muy tempranas del desarrollo floral, restringiéndose al ápice del meristemo, en las células que formarán los estambres y los carpelos. La actividad de AG parece ser suficiente para conferirle al meristemo floral su naturaleza determinada (Mizukami y Ma, 1997). El gen LFY comienza a expresarse durante la etapa de transición floral. Se expresa específicamente en el meristemo floral e induce la Introducción 23 expresión de genes implicados en la formación de los órganos florales (Weigel et al., 1992; Blázquez y Weigel, 2000; Lohmann et al., 2001). Con posterioridad a la expresión inicial de LFY, lo hacen AP1 y CAL. Estos dos últimos genes son parálogos muy cercanos que codifican factores de transcripción de tipo MADS (Mandel et al., 1992; Bowman et al., 1993). AP2 está implicado tanto en la regulación de la identidad del meristemo floral como en el desarrollo de la semilla (Jofuku et al., 1994). Codifica una proteína de unión a DNA de tipo EREBP (Ethylene Responsive Element Binding Protein; Riechmann y Meyerowitz, 1998). También participan en el proceso otros genes, como por ejemplo, el gen FRUITFULL (FUL; Gu et al., 1998; Ferrándiz et al., 2000), otro parálogo cercano a AP1 y CAL. Los genes anteriores, junto a otros como WUS (véase apartado I.6.2.1) y UNUSUAL FLORAL ORGANS (UFO; Ingram et al., 1995; Levin y Meyerowitz, 1995), están implicados en la activación transcripcional de los genes homeóticos encargados de conferir identidad a los órganos florales, según el modelo ABC (Bowman et al., 1991; Coen y Meyerowitz, 1991; Meyerowitz et al., 1991; Coen, 1992; Weigel y Meyerowitz, 1994; Lohmann y Weigel, 2002), que ha sido recientemente redefinido con la introducción de los genes de la clase E, SEPALLATA1, 2 , 3 y 4 (SEP1, 2, 3 y 4; Pelaz et al., 2000; 2001; Ditta et al., 2004; Fig. I.9). Figura I.9.- Revisión del modelo ABC. Introducción en el modelo ABC de los genes de la clase E. Inicialmente los genes LFY, UFO y WUS se expresan en dominios específicos del meristemo floral. Sus productos desencadenan la activación de los genes implicados en la determinación de la identidad de cada órgano floral. Esto, junto con la represión de AP1 por AG, da lugar al patrón ABC en la flor (función A en verde, función B en azul y función C en naranja). La función de los genes SEP se restringiría a los verticilos segundo, tercero y cuarto, colaborando en la generación de la identidad de los órganos florales. Se cree que las proteínas SEP forman complejos proteicos con los productos de los genes de identidad B y C. Se, sépalos; Pe, pétalos; St Estambres; Ca, carpelos. Tomado con modificaciones de Lohmann y Weigel, 2002. Introducción 24 I.6.3.4.- El desarrollo del fruto. El fruto es un órgano con un alto grado de especialización que se desarrolla a partir del pistilo, una vez que ha tenido lugar la fecundación. Las formas muy diversas que presenta en las distintas especies están relacionadas con la función que desempeña. Suministra un entorno adecuado para la formación de las semillas, habiendo un estricto acoplamiento entre su desarrollo y el de éstas, y proporciona un mecanismo eficaz para la propagación de las semillas. El fruto de Arabidopsis, al igual que ocurre con las más de 3.000 especies de Brasicáceas, es un fruto dehiscente que se desarrolla a partir de un gineceo formado por un pistilo bicarpelar. Esta clase de frutos recibe el nombre de silicua (Ferrándiz et al., 1999; Fig. I.10). A estigma estilo B valvas ovario replum entrenudo nectarios Figura I.10.- Morfología del fruto de Arabidopsis. (A) Microscopía electrónica de barrido de un fruto de Arabidopsis en estadio de antesis en el que se indican las distintas regiones del fruto que se observan externamente. (B) Sección tranversal de un fruto en antesis. Se indican las distintas capas celulares. ex: exocarpo; ms: mesocarpo; enb: capa más externa del endocarpo; ena: capa interna del endocarpo. En cada uno de los dos lóculos (lc) se observan los óvulos (o). El tracto transmisor (tt) se localiza en la zona media del septum (sp). Se indica la localización de los vasos laterales (lv) en las valvas, y los medios (mv) en el replum (rp). Barra de escala 50 µm. Tomado de Ferrándiz et al., 1999. El gineceo maduro de Arabidopsis está compuesto de un estigma apical, un estilo corto y un ovario basal que contiene los óvulos. El estigma está formado por numerosas células epidérmicas alargadas denominadas papilas estigmáticas, especializadas en la adherencia del polen y la inducción de su germinación. En el estigma comienza el tracto transmisor, un tejido rico en polisacáridos que dirige el crecimiento del tubo polínico y continúa a lo largo del estilo y del septum del ovario Introducción 25 para facilitar la fecundación de los óvulos. El estilo es una estructura corta, sólida y cilíndrica formada por tejido transmisor rodeado de un anillo de haces vasculares. El ovario consta de dos valvas separadas por el replum, y está dividido internamente en el plano medio por el septum, que origina una cámara bilocular en la que se sitúan los óvulos. El gineceo alcanza su madurez en el estadio de antesis, en el que se produce la apertura de la yema floral y la dehiscencia de las anteras. En este momento, tiene lugar la autopolinización, con lo que se inicia el desarrollo de la silicua, que se distingue del pistilo por la aparición de estomas en la superficie del ovario. Existen indicios de que en la fructificación hay una etapa inicial de divisiones celulares (Martínez et al., 1992), obteniéndose la mayor contribución al tamaño final mediante la elongación de las células (Bowman, 1994). Una vez que la silicua alcanza su longitud final, empieza a diferenciarse la zona de dehiscencia, que consiste en una fina capa de células situada entre la valva y el replum. La rotura de la lámina media situada entre estas células, así como la lignificación de las células del margen de la valva, permite la separación de la valva y el replum, con la consiguiente dispersión de las semillas (Meakin y Roberts; 1990; Spence et al., 1996). Durante los últimos años, se han descrito numerosas mutaciones que afectan específicamente al desarrollo de los carpelos, así como otras que causan fenotipos más pleiotrópicos. El estudio y caracterización de estos mutantes ha permitido la identificación de genes implicados en la determinación de la identidad del carpelo, como AG (véase apartado I.6.3.3), gen de la clase C esencial para la formación de los carpelos (Yanofsky et al., 1990); SPATULA (SPT), un gen Myc cuyo producto se necesita para que se produzca la fusión de los carpelos y la formación de los conductos especializados en la guía del tubo polínico (Heisler et al., 1998; Álvarez y Smyth, 1999), y CRABS CLAW (CRC), un gen de la familia YABBY que especifica un destino celular abaxial en el carpelo (Bowman y Smyth, 1999; Álvarez y Smyth, 1999). Otros genes están implicados en el establecimiento de la información posicional en el primordio del carpelo o en su interpretación para generar las estructuras correctas. ETTIN (ETT) codifica un producto con homología a las proteínas que se unen a elementos de respuesta a auxinas y se ha propuesto que confiere identidad regional en los meristemos florales, afectando entre otros órganos al pistilo (Sessions et al., 1995; 1997). FUL (véase apartado I.6.3.3) se necesita para la diferenciación correcta de las células de las valvas (Gu et al., 1998; Ferrándiz et al., 2000). SHATTERPROOF1 (SHP1) y SHP2, pertenecientes a la familia de genes MADS, actúan de manera redundante en la especificación de la zona de dehiscencia de los frutos (Ferrándiz et al., 2000). En esta última función, participan también los genes INDEHISCENT (IND) y ALCATRAZ (ALC; Rajani y Sundaresan, 2001; Liljegren et al., Introducción 26 2004), que codifican factores de transcripción de tipo básico hélice-bucle-hélice (bHLH). El gen REPLUMLESS (RPL; Roeder et al., 2003) codifica un factor de transcripción con homeodominio que se requiere para el desarrollo del replum. Los genes TOUSLED (TSL; Roe et al., 1993; 1997a; 1997b), STYLISH1 (STY1) y STY2 (Kuusk et al., 2002) participan en la formación de los tejidos apicales del gineceo. Las proteínas STY1 y STY2 poseen un dominio de localización nuclear y un motivo de interacción con otras proteínas C3HC4 RING con dedos de zinc (Zinc binding C3HC4 RING finger motif), y el producto TSL presenta función quinasa de Ser/Thr. A pesar de los extensos escrutinios que se han realizado, se han encontrado muy pocas mutaciones cuyo fenotipo se halle restringido al carpelo. Esto se debe a varias causas, entre las que podemos destacar la redundancia genética, la expresión de un mismo gen en órganos distintos y el hecho de que, al ser los carpelos órganos que derivan de las hojas, un gran número de genes implicados en el desarrollo del carpelo también lo están en el desarrollo foliar (Bolker, 1995). I.6.4.- El establecimiento de la polaridad en los órganos laterales. Los órganos laterales, las hojas y los órganos florales, muestran un crecimiento lateral y un desarrollo asimétrico. La relación entre el órgano lateral y el meristemo apical a partir del cual se forma es la base para la definición de los tres ejes primordiales. El eje próximo-distal está claramente definido por un borde proximal unido al tallo y otro distal libre. La asimetría a lo largo del eje próximo-distal es patente en las hojas, las cuales presentan un pecíolo proximal y una lámina foliar distal. Los primordios también presentan un eje izquierda-derecha cuya relación posicional con el meristemo no está clara, aunque puede tener relación con la filotaxia. El tercer eje, el adaxial-abaxial, queda definido por la relación posicional entre el meristemo y el primordio, que presenta una cara adaxial próxima al meristemo y otra abaxial más alejada de éste. Los primordios de los órganos laterales están inicialmente formados por unas pocas células con histología uniforme y con una expresión génica aparentemente homogénea. En estadios posteriores, cuando el primordio emerge de los bordes del meristemo, la polaridad se hace evidente en términos de patrones de expresión de genes y diferenciación morfológica. A pesar de que los órganos laterales tienen más de dos tipos celulares, el establecimiento de la polaridad requiere tan sólo la formación de dos poblaciones celulares distintas. Las interacciones posteriores entre estas dos poblaciones generan los diferentes tipos celulares (Bowman et al., 2002). Sussex (Sussex, 1954; 1955) y otros investigadores (Snow y Snow, 1959; Hanawa, 1961) llevaron a cabo elegantes experimentos en los que practicaron Introducción 27 incisiones que separaban el primordio emergente y el meristemo apical. El primordio aislado del meristemo se desarrollaba con una simetría radial, aparentemente abaxializado. Este resultado sugiere que el meristemo apical produce una señal necesaria para la especificación correcta del eje adaxial-abaxial de los órganos laterales. Una interpretación de este dato es que la señal que emana del meristemo apical promueve la identidad adaxial en las células del primordio más cercanas a él. En ausencia de esta señal, la identidad abaxial se diferencia como un estado por defecto. Sussex también mostró que los primordios aislados que ya habían comenzado su diferenciación morfológica eran capaces de desarrollarse autónomamente como hojas fenotípicamente normales. El desarrollo de los órganos separados del meristemo como estructuras con simetría radial también implica que el establecimiento de la polaridad adaxial-abaxial es un requerimiento para el crecimiento lateral de la lámina foliar (Sussex, 1954; 1955). Recientes estudios en Arabidopsis y Antirrhinum, recogidos en varias revisiones recientes (Eshed et al., 2001; Bowman et al., 2002), han aportado datos acerca de los mecanismos genéticos y moleculares por los que se establece la polaridad en los órganos laterales. Waites y Hudson describieron el primer gen que formaba parte de la maquinaria que controla la polaridad adaxial-abaxial, el gen PHANTASTICA (PHAN) de Antirrhinum (Waites y Hudson, 1995). Se interpretó que las hojas radializadas de los mutantes de pérdida de función phan estaban abaxializadas, en base a la morfología de las células epidérmicas y a la posición del xilema respecto al floema. Esta interpretación sugiere que la función de PHAN es la de promover la identidad adaxial. El gen codifica un factor de transcripción de tipo MYB y su actividad es, al menos, parcialmente redundante con la de HANDLEBARS (HB; Waites y Hudson, 2001), ya que el doble mutante phan hb presenta hojas y cotiledones completamente abaxializados y carece de meristemo apical. En contraste con las mutaciones phan de Antirrhinum, las mutaciones semidominantes, de ganancia de función, en los genes PHABULOSA (PHB) y PHAVOLUTA (PHV) de Arabidopsis causan la adaxialización dependiente de dosis de los órganos laterales (McConnell y Barton, 1998; McConnell et al., 2001). Los órganos laterales adaxializados de los homocigotos para el alelo semidominante phb-1d son filamentosos y presentan simetría radial, lo que apoya la hipótesis formulada por Sussex de que la yuxtaposición de los dominios adaxial y abaxial es necesaria para el crecimiento lateral. PHB y PHV codifican miembros de la clase III de una familia de factores de transcripción específicos de plantas que contienen un homeodominio y una cremallera de leucina (factores de transcripción HD-ZIP III). Introducción 28 PHB se expresa de forma homogénea en etapas muy tempranas de la formación del primordio de la hoja y, con posterioridad, su expresión queda restringida al dominio adaxial, cuando el primordio se distingue morfológicamente del meristemo. McConnell y colaboradores sugirieron que PHB codifica un receptor de la señal que emana del meristemo apical y establece el destino adaxial en los órganos laterales (McConnell et al., 2001). En este escenario, la señal consistiría en un ligando cuya concentración dependería de la proximidad al meristemo, que daría lugar a la activación de la proteína PHB al unirse a ésta. La detección del mRNA de PHB en un gradiente en el órgano lateral, con una concentración más elevada en las regiones más adaxiales, sugiere que la acción del ligando es dependiente de dosis y que la expresión del gen debería mantenerse mediante un bucle de retroalimentación positiva. Otra característica de los mutantes phb-1d es que presentan meristemos axilares, que normalmente se sitúan en la axila adaxial de la hoja, alrededor de toda la circunferencia de la base de las hojas adaxializadas. La presencia de estos meristemos sugiere que su formación está asociada con el destino adaxial (Mc Connell y Barton, 1998). La ausencia de meristemos axilares en mutantes de pérdida de función en el gen REVOLUTA (REV), otro gen de la familia HD-ZIP III, puede, por tanto, interpretarse como una pérdida parcial de la identidad adaxial (Talbert et al., 1995; Ratcliffe et al., 2000; Otsuga et al., 2001). Este modelo basado en una señal meristemática capaz de polarizar a los órganos laterales predice una supresión, dependiente de concentración, de los factores que promueven el destino celular abaxial por parte de los receptores de dicha señal. En ausencia de la señal, por ejemplo cuando el primordio es separado del meristemo, no se produce la activación de los factores adaxiales, lo que implica que los factores que promueven el destino celular abaxial permanecen activos durante todo el desarrollo del órgano lateral, con lo que la hoja se desarrolla con características abaxiales uniformes. Los miembros de las familias génicas YABBY y KANADI son candidatos a ser genes cuya función es la de promover la identidad abaxial, dados los fenotipos de adaxialización que presentan los mutantes con alelos nulos de estos genes y la abaxialización producida por la activación ectópica de varios de estos genes (Eshed et al., 1999; 2001; Sawa et al., 1999; Siegfried et al., 1999; Villanueva et al., 1999; Kerstetter et al., 2001; Fig. I.11). La familia YABBY de Arabidopsis está formada por 5 genes que codifican proteínas que probablemente actúan como factores de transcripción (Bowman y Smyth, 1999; Eshed et al., 1999; Sawa et al., 1999a; 1999b; Siegfried et al., 1999; Villanueva et al., 1999). Cada miembro de la familia se expresa de forma polar en uno Introducción 29 o más órganos laterales. Tres de sus miembros −FILAMENTOUS FLOWER (FIL), YABBY2 (YAB2) y YAB3− se expresan de forma polar en los órganos laterales producidos por los meristemos apical y floral (Siegfried et al., 1999; Sawa et al., 1999). Por el contrario, CRABS CLAW (CRC) e INNER NO OUTER (INO) están más especializados, ya que su expresión se restringe a los carpelos y nectarios o a los integumentos externos de los óvulos, respectivamente. Los genes KANADI, miembros de la familia génica GARP, codifican reguladores transcripcionales. Aunque la familia génica GARP es muy numerosa, sólo tres de sus miembros −KANADI1 (KAN1), KAN2 y KAN3− parecen estar implicados en promover el destino celular abaxial (Eshed et al., 1999; 2001; Kerstetter et al., 2001). Se ha demostrado la participación de KAN1 y KAN2 en la inducción de la identidad abaxial en los órganos laterales y en el integumento externo de los óvulos (Eshed et al., 2001). Tanto los factores que promueven la identidad adaxial como la abaxial se expresan inicialmente en todo el primordio del órgano (McConnell et al., 2001; Siegfried et al., 1999; Sawa et al., 1999a; 1999b; Kerstetter et al., 2001). Posteriormente, conforme el primordio emerge del meristemo, los patrones de expresión se restringen a sus respectivos dominios complementarios (McConnell et al., 2001; Siegfried et al., 1999; Sawa et al., 1999a; 1999b; Kerstetter et al., 2001), lo que es consistente con la adquisición temporal de la polaridad que se determinó en los experimentos quirúrgicos (Sussex, 1954; 1955). Una posible hipótesis es que mientras que PHB y otros genes HD-ZIP III se activan en la zona más cercana al meristemo por señales derivadas de éste, la expresión de los genes KANADI y YABBY queda reprimida en estas células. La formación de regiones complementarias se fundamentaría en el antagonismo mutuo de los genes HD-ZIP III y KANADI, lo que permitiría el establecimiento de los dominios adaxial y abaxial en los órganos en desarrollo (Eshed et al., 2001; Kerstetter et al., 2001; McConnell et al., 2001; Fig. I.11). Se ha observado en Arabidopsis que el mismo programa genético que establece la polaridad adaxial-abaxial en los órganos laterales se encarga también de generar el patrón que adopta el tejido vascular formado a partir del procámbium de un órgano con simetría radial como el tallo, de tal forma que la posición interna que ocupa el xilema equivale a identidad adaxial y la posición periférica del floema a identidad abaxial (Tasaka 2001; Emery et al., 2003; Fig. I.11). Así, la señal derivada del meristemo podría activar a los genes HD-ZIP III tanto en la región adaxial de la hoja como en la región central del tallo (Emery et al., 2003). Introducción 30 señal meristemática (esterol?) REV, PHB, PHV, CNA KANADI miRNA adaxial, xilema abaxial, floema Figura I.11.- Establecimiento de los ejes adaxial-abaxial y central-periférico. Una señal que emana del meristemo activa a los genes de la clase HD-ZIP III, que antagonizan con los genes de la familia KANADI. Tanto los genes KAN como los microRNA 165/166 (miR165/166; véase el apartado I.6.5.2) regulan negativamente a los genes HD-ZIP III, que promueven la identidad adaxial en los órganos laterales y el xilema en los haces vasculares. Los genes KAN promueven identidad abaxial en los órganos laterales y floema en los haces vasculares. Tomado con modificaciones de Emery et al., 2003. I.6.5.- Los genes HD-ZIP. Se denomina homeobox a una secuencia génica de 180 pares de bases que codifica el homeodominio, un dominio proteico de unión a DNA que consta de 60 aminoácidos. El homeodominio está presente en muchas proteínas que participan en el control genético del desarrollo de los organismos pluricelulares, actuando como factores de transcripción (Gehring, 1992; Lawrence y Morata, 1994). La homeobox se identificó por primera vez en los genes homeóticos de Drosophila melanogaster, de ahí su denominación, que están implicados en conferir la identidad precisa a los segmentos de la mosca (McGinnis et al., 1984; Scott y Weiner, 1984). El primer gen con homeobox identificado en las plantas fue Knotted-1 (Kn1) de maíz (Vollbrecht et al., 1991), que desempeña una función importante en el mantenimiento del meristemo apical durante el desarrollo de la planta (Smith et al., 1992), al igual que sus ortólogos en Arabidopsis, los genes KNOX de la clase I (véase el apartado I.6.2.1). Para aislar los primeros genes con homeobox en Arabidopsis (genes ATHB, de Arabidopsis thaliana homeobox genes), se llevaron a cabo escrutinios en genotecas de cDNA, empleando sondas degeneradas derivadas de secuencias conservadas en los homeodominios animales (Ruberti et al., 1991; Mattson et al., 1992; Schena y Davis, 1992). Los genes obtenidos en estos escrutinios contenían, además de la homeobox, secuencias que codificaban una cremallera de leucina, de ahí el nombre de genes HD-ZIP. En el genoma de Arabidopsis se han identificado 42 genes con estas características (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000), que se agrupan en cuatro familias, HD-ZIP I-IV, en base a criterios de secuencia (Sessa et al., Introducción 31 1994). Parece que los genes pertenecientes a las familias I y II tienen un origen común, mientras que las familias III y IV están más alejadas evolutivamente. Poco tiempo después de haberlos hallado en Arabidopsis, se aislaron genes HD-ZIP en especies vegetales como el tomate (Meissner y Theres, 1995), girasol (Chan y González, 1994) y arroz (Meijer et al., 1997). Actualmente, conocemos la presencia de estos genes en todas las plantas en las que se han buscado; y, por el momento, no se han identificado en los animales, lo que parece indicar que los genes HD-ZIP son específicos de las plantas. Las cremalleras de leucina permiten la formación de dímeros, lo que sugiere que las proteínas HD-ZIP podrían unirse al DNA como homo o heterodímeros. Esta hipótesis se ha confirmado mediante experimentos in vitro con ATHB1 (HD-ZIP I) y ATHB2 (HD-ZIP II). Con elevada probabilidad, estas proteínas son capaces de formar homodímeros, ya que se unen al DNA a través de los sitios de unión pseudopalindrómicos, CAAT(A/T)ATTG y CAAT(C/G)ATTG), respectivamente (Sessa et al., 1993). Asimismo, se ha demostrado que ATHB9 (HD-ZIP III) se une específicamente a la secuencia pseudopalindrómica GTAAT(G/C)ATTAC (Sessa et al., 1998). I.6.5.1.- Función de los genes HD-ZIP de Arabidopsis thaliana. Los genes HD-ZIP participan en un gran número de procesos relacionados con el crecimiento y el desarrollo vegetales. El gen ATHB1 participa en el desarrollo foliar (Aoyama et al., 1995), y ATHB7, ATHB12 y ATHB6 son activados transcripcionalmente en condiciones de estrés hídrico, así como cuando aumentan los niveles de ácido abcísico (ABA; Söderman et al., 1996; 1999; Lee y Chun, 1998). La expresión del gen ATHB2 se induce intensamente por longitudes de onda pertenecientes al intervalo rojo-lejano del espectro luminoso (Carabelli et al., 1993; 1996). Este dato, junto con la evidencia del análisis de plantas transgénicas, sugiere que ATHB2 participa en la respuesta dependiente de auxina que se desarrolla bajo condiciones de sombra (Steindler et al., 1999). Los genes de la familia HD-ZIP III regulan aspectos críticos del desarrollo vegetal como el establecimiento de la polaridad de los órganos laterales, la formación de los meristemos apical y lateral y el desarrollo vascular (véase el apartado I.6.5.2). Perteneciente a la familia HD-ZIP IV, el gen ATHB10, también conocido como GLABRA2 (GL2; Rerie et al., 1994; Di Cristina et al., 1996), se requiere para la correcta diferenciación de los tricomas y los pelos radiculares (Masucci et al., 1996). Otro gen de la familia HD-ZIP IV, ANTHOCYANINLESS2 (ANL2), afecta a la acumulación de antocianinas y al desarrollo de la raíz en Arabidopsis (Kubo et al., 1999). Introducción 32 I.6.5.2.- La familia de genes HD-ZIP III. La familia de los genes HD-ZIP III está formada por cinco miembros: REVOLUTA/INTERFASCICULAR FIBERLESS1 (REV/IFL1), PHABULOSA (PHB; ATHB14) y PHAVOLUTA (PHV; ATHB9), que forman un clado, siendo PHB y PHV más parecidos entre sí, y ATHB8 y CORONA (CNA; ATHB15), que forman otro clado (Fig. I.12). Hay un gran parecido en la secuencia de estos genes entre las distintas especies vegetales, siendo un dato a destacar que más del 50% de la secuencia aminoacídica está conservada entre la proteína PpHB10 del briófito Physcomitrella patens y cada una de las proteínas HD-ZIP III de Arabidopsis (Sakakibara et al., 2001). Figura I.12.- Filograma de los miembros de la familia HD-ZIP III de Arabidopsis. PpHB10 es un gen del briófito Physcomitrella patens que pertenece a la familia HD-ZIP III. La barra de escala representa 50 cambios. Tomado de Emery et al., 2003 Las proteínas de la familia HD-ZIP III contienen un dominio HD-ZIP, implicado en la unión a DNA y en la dimerización (Sessa et al.,1998), cerca del extremo terminal amino; un dominio START de unión a esteroles y lípidos (steroidogenic acute regulatory related lipid transfer; Ponting y Aravind, 1999), y un dominio conservado de función desconocida cerca del terminal carboxilo (Green et al., 2005). Se han aislado mutantes tanto de pérdida como de ganancia de función en algunos de estos genes. Las mutaciones de pérdida de función rev causan defectos en el desarrollo foliar y en la especificación de las células totipotentes, y alteran el desarrollo vascular y el transporte de auxinas (Talbert et al., 1995; Zhong et al., 1997; Zhong y Ye, 1999; Otsuga et al., 2001). Los mutantes homocigóticos para alelos de pérdida de función athb8, phb, phv y cna no muestran fenotipos alterados, debido a la redundancia funcional de estos genes (Baima et al., 2001; Prigge et al., 2005). Como se ha mencionado en el apartado I.6.4, las mutaciones semidominantes, de ganancia de función, en los genes PHB y PHV resultan en defectos en la polaridad adaxial-abaxial de los órganos laterales y en la formación de meristemos en posiciones ectópicas (McConnell y Barton, 1998; McConell et al., 2001; Tang et al., 2003). Mutaciones similares en el gen REV causan defectos de polaridad Introducción 33 en los haces vasculares y en las hojas (Zhong et al., 1999; Emery et al., 2003; Zhong y Ye, 2004). La sobreexpresión de ATHB8 en plantas transgénicas que contienen una construcción con el cDNA del gen tiene como resultado una producción excesiva de xilema (Baima et al., 2001). Todas las mutaciones de ganancia de función descritas en los genes de esta familia consisten en sustituciones de un solo nucleótido, que dan lugar a un cambio de aminoácido o a una perturbación del procesamiento de los intrones que resulta en la adición de unos pocos aminoácidos. Las mutaciones se sitúan en la región del dominio START más cercana al extremo terminal amino, y producen la expresión ectópica de los genes. Este dato llevó a la especulación de que los fenotipos de ganancia de función observados eran debidos a la alteración en la percepción por el dominio START de un ligando de tipo lipídico. Según esta hipótesis, las proteínas HD-ZIP III podrían actuar como receptores de una hipotética señal adaxializante emanada del meristemo. La unión del ligando lipídico al dominio START daría lugar a la activación de estas proteínas y, mediante su autorregulación, a un mantenimiento de la expresión de los genes específicamente en el dominio adaxial. La reciente identificación de una secuencia complementaria a dos microRNA (miRNA), los miRNA 165/166, justo en la región donde se localizan todas las mutaciones semidominantes sugiere que los fenotipos mutantes generados por ellas pueden deberse a la alteración de un proceso de regulación post-transcripcional de los genes HD-ZIP III mediado por interferencia con miRNA (Reinhart et al., 2002; Rhoades et al., 2002; Tang et al., 2003). Diversos trabajos demuestran que, en efecto, hay una regulación post-transcripcional in vivo de los genes HD-ZIP III mediante miRNA (Emery et al., 2003; Floyd y Bowman, 2004; Zhong y Ye, 2004; Kim et al., 2005). I.6.6.- La regulación post-transcripcional mediada por microRNA. Los miRNA son pequeños RNA no codificantes, de 18 a 25 nucleótidos de longitud, que tienen la capacidad de regular post-transcripcionalmente la expresión génica. Se forman a partir de precursores de mayor longitud que adoptan estructuras secundarias complejas y son procesados por una ribonucleasa de tipo III que recibe el nombre de Dicer en los animales (Bernstein et al., 2001) y DICER-LIKE1 (DCL1; Jacobsen et al., 1999; Golden et al., 2002) en las plantas. La cadena antisentido del miRNA maduro, que es la complementaria al mRNA diana, interacciona con un complejo de gran tamaño (RISC, RNA-induced silencing complex) para regular negativamente la expresión de su diana. Al contrario que en los animales, en las plantas la complementariedad de la secuencia del miRNA y del mRNA diana es casi perfecta y, generalmente, se produce la degradación del mRNA diana. No obstante, en Introducción 34 el caso del mRNA del gen AP2 se ha descrito que el mecanismo inhibe la traducción, y también se ha demostrado para los genes HD-ZIP III la metilación de regiones situadas en la mitad de su secuencia que incluye el extremo 3’, que si bien se desconoce con exactitud cuál es su efecto, se supone pueda tener incidencia sobre la transcripción de los genes (Bao et al., 2004). Recientemente, se han aislado varios miRNA en Arabidopsis, muchos de los cuales regulan la expresión de genes que codifican factores de transcripción implicados directa o indirectamente en aspectos concretos del desarrollo vegetal, como el control de la floración, el mantenimiento de los meristemos y la especificación de la polaridad de los órganos laterales. Entre estos miRNA se encuentran los miRNA165 y miRNA166, que regulan la expresión de los genes HD-ZIP III (Rhoades et al., 2002; Aukerman y Sakai, 2003; Emery et al., 2003; Palatnik et al., 2003; Tang et al., 2003; Chen, 2004; Floyd y Bowman, 2004; Juarez et al., 2004a; Kidner y Martienssen, 2004; Laufs et al., 2004; Mallory et al., 2004a; McHale y Koning, 2004; Zhong y Ye, 2004; Vaucheret et al., 2004; Kim et al., 2005). La regulación mediante miRNA de los genes HD-ZIP III opera en una gran cantidad de especies vegetales, desde briófitos a monocotiledóneas, lo que indica que el mecanismo surgió hace más de 400 millones de años (Floyd y Bowman, 2004). Se han aislado varios genes de Arabidopsis que participan en el metabolismo de los miRNA. DCL1 se requiere para la acumulación de los miRNA maduros y tiene una función importante en diferentes estadios del desarrollo, desde la embriogénesis a la floración y la formación de los órganos laterales (Robinson-Beers et al., 1992; Jacobsen et al., 1999; McElver et al., 2001). HUA ENHANCER1 (HEN1) codifica una proteína de pequeño tamaño, sin ningún dominio funcional conocido, que se requiere también para la acumulación de los miRNA maduros, para lo cual colabora con DCL1 (Park et al., 2002). Mutaciones de pérdida de función en HEN1 causan la disminución general del tamaño de la planta y de todos sus órganos, la alteración de la morfología foliar, la reducción de la fusión de los carpelos y transformaciones homeóticas en los órganos florales en un fondo genético mutante hua1-1 hua2-1 (Chen y Meyerowitz, 1999; Chen et al., 2002). El gen HYPONASTIC LEAVES1 (HYL1; Lu y Fedoroff, 2000) codifica una proteína de unión a RNA de doble cadena que también colabora con DCL1 en la producción de los miRNA maduros. La pérdida de función de este gen produce un fenotipo muy pleiotrópico, que incluye un incremento de la sensibilidad al ácido abscísico, la reducción de la sensibilidad a auxinas y citoquininas y anomalías en el desarrollo, como la simplificación del patrón vascular y la presencia de hojas con los márgenes foliares curvados hacia el haz. Estos dos últimos fenotipos pueden deberse a la disminución en la cantidad de miR165/166, lo que conlleva un aumento Introducción 35 en la expresión de genes HD-ZIP III (Yu et al., 2005). ARGONAUTE1 (AGO1) y PINHEAD (PNH) pertenecen a una familia génica muy conservada, cuyos miembros están implicados en el silenciamiento génico mediante miRNA en diferentes organismos. Las mutaciones de pérdida de función en estos genes tienen como resultado la formación de órganos laterales parcialmente abaxializados y la disminución de la formación o la actividad de los meristemos (McConnell y Barton 1995; Bohmert et al., 1998; Moussian et al., 1998; Lynn et al., 1999). Aunque se duda de la participación del producto PNH en el metabolismo de los miRNA, la proteína AGO1 es un componente esencial del complejo RISC. HASTY (HST) es el ortólogo en Arabidopsis del gen que codifica la Exportina 5 de mamíferos, la proteína encargada de exportar los precursores de los miRNA del núcleo al citoplasma y de la estabilización de los mismos (Telfer y Poethig, 1998; Bohnsack et al., 2002; Calado et al., 2002; Bollman et al., 2003; Yi et al., 2003; Bohnsack et al., 2004; Zeng y Cullen, 2004). Las mutaciones de pérdida de función en este gen reducen la acumulación de miRNA (Park et al., 2005), y afectan a la morfología del meristemo apical del tallo, alteran la filotaxia de la inflorescencia, adaxializan los órganos laterales y adelantan el cambio de la fase juvenil a la adulta (Telfer y Poethig, 1998; Bollman et al., 2003). Un trabajo reciente indica que, en Arabidopsis, los miRNA maduros se producen en el núcleo, de forma que la proteína HST no exportaría los precursores de los miRNA, sino los productos ya maduros (Park et al., 2005). II.- Antecedentes y objetivos Antecedentes y objetivos 37 II.- Antecedentes y objetivos El objetivo de los estudios sobre el desarrollo de los organismos pluricelulares es el de dar respuestas a cuestiones del tipo de cómo, partiendo de un primordio con un número limitado de células, se establecen patrones concretos de división, expansión y diferenciación que dan lugar a la producción de órganos en posiciones precisas. Estos fenómenos están controlados genéticamente, por lo tanto, una cuestión clave a resolver es la de la identidad de los genes que dirigen y llevan a cabo tales procesos. Los estudios de desarrollo en las plantas, antaño limitados a la mera descripción de las estructuras y a determinadas pruebas bioquímicas y fisiológicas, también han hecho suyas estas mismas preguntas y estrategias, e incluyen actualmente la utilización de herramientas genéticas y moleculares. El análisis genético de los fenómenos de desarrollo tiene como punto de partida la búsqueda de mutantes morfológicos, que se distinguen de las estirpes silvestres por presentar formas anormales. Estos mutantes nos permitirán identificar los genes que regulan la división y la diferenciación coordinada de células durante el proceso de desarrollo en estudio, así como inferir la función de los alelos silvestres a partir de la visualización de los fenotipos causados por los alelos alterados. En nuestro laboratorio, se está realizando un esfuerzo para contribuir a la comprensión de los fenómenos de desarrollo implicados en la formación del fruto de la planta modelo Arabidopsis thaliana. El fruto se forma a partir del pistilo, tras la polinización, como vía alternativa a la senescente que tiene lugar en ausencia de fertilización. Posiblemente, se trata del más complejo de los órganos de Arabidopsis, tanto en su función como en su anatomía, habiéndose descrito numerosos elementos de patrón a lo largo de los ejes apical-basal y adaxial-abaxial cuyos procesos de desarrollo son susceptibles de ser analizados mediante estrategias genéticas y moleculares. El programa complejo que da lugar a la producción de los frutos los convierte, por tanto, en sistemas de gran potencial para el estudio de los fenómenos básicos de morfogénesis en las plantas. Por otro lado, conocido el indudable valor agrícola de estos órganos en muchas especies, cabe esperar que el establecimiento de la base genética y molecular de los procesos implicados en el desarrollo del fruto permita sentar los cimientos de futuros experimentos de manipulación genética, encaminados a la modificación controlada de la forma y el tamaño de frutos de interés. Los trabajos recogidos en dos revisiones evidencian la excelencia de Arabidopsis para el análisis de los mecanismos de desarrollo que conducen a la Antecedentes y objetivos 38 formación del pistilo y el fruto (Bowman et al., 1999; Ferrándiz et al., 1999). La obtención de mutantes ha permitido la identificación de varios genes maestros, muchos de ellos ya clonados y caracterizados molecularmente. Éstos codifican factores de transcripción, implicados en la regulación transcripcional de otros genes, proteínas que funcionan en procesos de regulación post-transcripcional, o quinasas, que posiblemente participan en rutas de señalización y transducción de señales. No obstante, a pesar del notable esfuerzo realizado hasta la fecha, se supone que son muchos los genes aún sin caracterizar y, en todo caso, todavía quedaría por determinar de qué forma estarían interaccionando los genes implicados. En una publicación realizada unos meses antes del comienzo del trabajo recogido en esta memoria (Serrano-Cartagena et al., 2000), se describía como sinérgico el fenotipo del doble mutante hasty-5 incurvata4-1 (hst-5 icu4-1). HST es el ortólogo en Arabidopsis del gen que codifica la Exportina 5 de mamíferos, que se encarga de exportar los microRNA (miRNA) del núcleo al citoplasma (véase apartado I.6.6; Telfer y Poethig, 1998; Bollman et al., 2003). INCURVATA4 (ICU4) era un gen de naturaleza molecular desconocida, cuyo locus se situó en el cromosoma 1, 31,5 ± 7,0 cM por debajo del marcador T27K12-Sp6 y 16,9 ± 4,5 cM sobre el marcador nga128 (Serrano-Cartagena et al., 2000). El fenotipo de este doble mutante consistía en la extrema curvatura de sus hojas vegetativas, una reducción muy acusada del tamaño de la planta, un retraso del tiempo de floración y la formación eventual de rosetas aéreas (Serrano-Cartagena et al., 2000). Al ser los carpelos órganos que derivan de las hojas, un gran número de genes implicados en el desarrollo del carpelo también lo están en el desarrollo foliar (Bolker, 1995). De hecho, los mutantes de pérdida de función para el gen HST, además de mostrar hojas curvadas hacia el haz, un fenotipo que ha recibido la denominación de Incurvata (Berná et al., 1999; Serrano-Cartagena et al., 2000), muestran alteraciones evidentes en el desarrollo de los carpelos y los frutos formados a partir de éstos (Serrano-Cartagena et al., 2000; Bollman et al., 2003). Por lo tanto, teniendo en cuenta que los mutantes con los alelos semidominantes icu4-1 e icu4-2 comparten el fenotipo Incurvata con los homocigotos para alelos nulos en el gen HST, así como las características previamente descritas del doble mutante, nos planteamos como primer objetivo determinar si se observaba también sinergia respecto al fenotipo de los carpelos y los frutos de los dobles mutantes; y, en tal caso, intentar dilucidar la naturaleza de la alteración y la posible función del gen ICU4 en el desarrollo de estos órganos, en particular, y en el de los órganos laterales, en general. Una vez establecido el proceso concreto de desarrollo afectado en los órganos laterales de los mutantes icu4, un segundo objetivo era el de realizar una Antecedentes y objetivos 39 caracterización fenotípica exhaustiva de los mutantes, desde la embriogénesis al tiempo de floración, así como la filotaxia y la formación de patrones vasculares, lo que sin duda contribuiría a una mayor comprensión de la implicación del gen ICU4 en el desarrollo de Arabidopsis. El tercer objetivo que nos planteamos fue la clonación e identificación molecular del gen ICU4, y su posible inclusión dentro de alguna familia génica conocida cuyos miembros pudieran participar en los mismos procesos en los que estuviera implicado ICU4. La verificación de la identidad de un posible gen candidato con ICU4 se realizaría mediante la identificación de las mutaciones presentes en los alelos icu4-1 e icu4-2, comparando sus secuencias con las del ecotipo silvestre En-2, y mediante la obtención de plantas transformantes portadoras de construcciones moleculares para el gen candidato. Una vez caracterizado el gen, la determinación del patrón de expresión aportaría información adicional sobre su función. Finalmente, como cuarto objetivo, se asumió el análisis de interacciones adicionales entre el gen ICU4 y otros genes ya descritos que participaran en los procesos de desarrollo afectados en los mutantes icu4. Con ello, se pretendía profundizar en el conocimiento de la función del gen y, eventualmente, poder incluirlo en algún modelo que permitiera explicar la participación de ICU4 y otros genes en el desarrollo de Arabidopsis. III.- Materiales y Métodos Materiales y Métodos 41 III.- Materiales y Métodos III.1.- Organismos utilizados en este trabajo. III.1.1.- Estirpes de Arabidopsis thaliana. III.1.1.1.- Estirpes silvestres. Las estirpes silvestres de Arabidopsis thaliana utilizadas en esta Tesis son Enkheim-2 (En-2, N1138), Columbia-0 (Col-0, N1092), Landsberg erecta (Ler, NW20) y Nossen-0 (No-0, N1394). Todas ellas se han obtenido del centro de distribución de semillas existente en Europa (NASC, Nottingham Arabidopsis Stock Center, Norwich, Reino Unido). III.1.1.2.- Estirpes mutantes. III.1.1.2.1.- Nomenclatura utilizada en la denominación de genes, mutaciones y fenotipos. Durante la realización del presente trabajo se han seguido las directrices propuestas por Meinke y Koornneef (1997) para Arabidopsis respecto a la denominación de genes, mutantes y fenotipos. De forma continua, podemos encontrar actualizaciones de esta normativa en la dirección de Internet http://mutant.Lse.okstate.edu/genepage/namerule.html. Los genes se nombran con su nombre completo en mayúscula y con letra cursiva, o con una abreviatura de tres letras mayúsculas y cursivas. Los alelos de un gen se indican mediante el nombre completo del gen o una abreviatura de tres letras de éste, siempre en letra cursiva, con mayúsculas en el caso del alelo silvestre y minúsculas si se trata de un alelo mutante. Los distintos alelos mutantes de un gen se denotan utilizando números separados por un guión, que indican habitualmente el orden de aislamiento. La proteína codificada por el gen se expresa mediante la misma abreviatura con letras mayúsculas y en tipografía normal. Para referirnos a un fenotipo mutante, se escribe la abreviatura del gen en tipografía normal y con la letra inicial en mayúsculas. La anotación de los genes en el genoma de Arabidopsis se ajusta a la nomenclatura determinada por el AGI (The Arabidopsis Genome Initiative, 2000). Por ejemplo, At1g52150 hace referencia al gen numerado como 52.150 en el cromosoma I Materiales y Métodos 42 de Arabidopsis. Versiones actualizadas de las anotaciones se pueden encontrar en http://www.arabidopsis.org/info/guidelines.jsp#alia. III.1.1.2.2.- Procedencia de las estirpes mutantes. Todas las estirpes mutantes utilizadas en este trabajo se describen en la Tabla III.1, con indicación de su fondo genético, del mutágeno utilizado para provocar la mutación y de su procedencia. Como se puede ver en esta tabla, la mayoría de las estirpes mutantes proceden del NASC y el resto nos han sido suministradas directamente por el autor que publicó dicha estirpe, excepto athb8-6 que pertenece a la colección GABI-Kat de líneas de inserción de T-DNA (línea GABI_256E07). Tabla III.1.- Estirpes mutantes utilizadas durante el desarrollo de esta Tesis. Alelo Fondo genético Código NASC Mutágeno Referencia as1-1 Col-1 N3374 Rayos-X Redei, 1965 athb8-6 Col-0 - T-DNA bp-1 Ler NW30 EMS Koornneef et al., 1983 crc-1 Ler N3814 EMS Álvarez y Smyth, 1999 fil-3 Ler - EMS Chen et al., 1999 hst-1 Ler N3811 Diepoxibutano Telfer y Poethig, 1998 icu4-1 En-2 N400 ? Serrano-Cartagena et al.,2000 icu4-2 En-2 N401 ? Serrano-Cartagena et al.,2000 icu4-4 Col-0 N513134 T-DNA Alonso et al., 2003 icu4-5 Col-0 N545175 T-DNA Alonso et al., 2003 kan1-2 Ler - EMS Eshed et al., 1999 pkl-1 Col N3840 EMS Ogas et al., 1997 phb-1d Ler N3761 EMS McConnell y Barton, 1998 pnh-2 Ler N3853 EMS McConnell y Barton, 1995 pny-40126 Col-0 N540126 T-DNA Smith et al., 2003 rev-1 No-0 N3826 EMS Talbert et al., 1995 rev-6 Col-0 - EMS Pogany et al., 1998 Rosso et al., 2003; Sthrizov et al., 2003; Li et al., 2003 Materiales y Métodos 43 III.1.2.- Estirpes de Escherichia coli. Se utilizaron las estirpes DH10β (Choi et al., 1995) y DH5α (Hanahan et al., 1983) de E. coli. Ambas dan lugar a complementación α (Φ80dlacZ∆M15), lo que permite la selección de colonias blancas/azules para la identificación de las bacterias portadoras de plásmidos recombinantes, y son incapaces de recombinar (recA-). Los experimentos de transformación se llevaron a cabo mediante choque térmico (DH5α) o electroporación (DH10β). La estirpe DH10β es portadora de clones PAC (P1 Artificial Chromosome) procedentes de la genoteca IGF (Institut für Genbiologische Forschung, Berlin GMBH), depositadas en el ABRC. El clon F5F19, que contiene el gen ATHB15 (At1g52150), se generó utilizando el vector pBeloBAC-Kan (Mozo et al., 1998) que confiere resistencia al antibiótico kanamicina. III.1.3.- Estirpes de Agrobacterium tumefaciens. Se han utilizado en este trabajo dos estirpes de Agrobacterium tumefaciens: C58C1 (Zambrisky et al., 1983; Koncz et al., 1986) y LBA4404 (Hoekeman et al., 1983). La primera carece de plásmido Ti, mientras que la segunda presenta modificaciones respecto a la estructura original del mismo. Dado que ambas estirpes tienen resistencia cromosómica a la rifampicina, siempre se cultivaron en presencia de este antibiótico, impidiendo así la proliferación de otro tipo de microorganismos. Se generaron células competentes de ambas estirpes para someterlas a transferencia de DNA mediante electroporación. III.2.- Vectores. Plásmidos y construcciones. En este apartado se incluyen los vectores utilizados en los trabajos rutinarios de clonación y los empleados en experimentos de transformación de plantas, tanto en la creación de las distintas colecciones de mutantes por mutagénesis insercional de TDNA (generadas en otros laboratorios) como en los experimentos llevados a cabo durante esta Tesis. En todos los experimentos de subclonación o transcripción in vitro se han empleado los plásmidos pGEM-3Zf(+) y pGEM-T (Promega, USA). El plásmido pROK2 (Baulcombe et al., 1986) fue la herramienta elegida en la obtención de la colección SALK de líneas de plantas con inserciones de T-DNA (Alonso et al., 2003). La inserción confiere a las plantas portadoras resistencia a la kanamicina, propiciada por el gen nptII. Materiales y Métodos 44 El cDNA completo del gen ATHB15 se obtuvo a partir de la colección de clones de cDNA de Arabidopsis thaliana generada en el Instituto RIKEN Genomics Sciences Center (Seki et al., 1998; 2002). Este cDNA estaba clonado en el plásmido RAFL7, una modificación a partir del plásmido bluescript 2, que confiere resistencia a ampicilina. Para los experimentos de sobreexpresión génica en las plantas hemos utilizado el vector pBIN-JIT (Ferrándiz et al., 2000; Fig. III.1), un vector de 13 Kb derivado del pBIN19, que contiene tanto el T-DNA como los genes necesarios para su integración. También presenta dos copias del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35S CaMV). Para la obtención de la construcción de interferencia se ha utilizado el plásmido pCF6 (Cristina Ferrándiz), obtenido mediante la clonación del sexto intrón del gen FUL en el plásmido pGEM-T. pBIN-JIT (13 Kb) Figura III.1.- Plásmido pBIN-JIT. Incorpora un T-DNA modificado que presenta dos copias del promotor 35S del virus del mosaico de la coliflor (35SCaMV) y el terminador del gen de la nopalina sintetasa (nosT) flanqueando el sitio clonación (recuadro). El gen nptII (neomicina fosfotransferasa II) confiere resistencia a la kanamicina. Se indica como RB y LB los bordes derecho e izquierdo del T-DNA, respectivamente. III.3.- Oligonucleótidos empleados como cebadores. Todos los oligonucléotidos empleados en esta Tesis han sido sintetizados en la empresa TIB-MOL-BIOL (Alemania) en la escala 0,01 µM, con grado de purificación máximo (HPR3), y se indican en la tabla III.2. Materiales y Métodos 45 Tabla III.2.- Oligonucleótidos empleados durante el desarrollo de esta Tesis. Plásmido o BAC Posición en el BAC (nucleótidos) Enzima GGAACTTCTTCCATCTCGGTG F5F19 33914-33935 - CER452458R GTTGTTGTTGGTAAGACTGTC F5F19 34053-34034 - F5F19-1 TGATACATGTTATGTTTTCAGAC F5F19 104674-104651 - F5F19-2 CTTCAACAGCTCGACATTCG F5F19 104217-104237 - F5F19-3 TACAGGTTGCAGAGATTGTC F5F19 104260-104280 - F5F19-4 CCACTGGAAAGCATCTCTGC F5F19 103828-103848 - F5F19-5 TGGTCCTAGTATGCCACTGG F5F19 103884-103864 - F5F19-6 CCCCACCCATTAACACTAC F5F19 103443-103462 - F5F19-7 TTGATGCGTATCTAGCAGCAGCAG F5F19 102968-102944 - F5F19-8 GCAAACGAAGCATCGATTGGAGC F5F19 102531-102554 - F5F19-9 GCATGTCAAGTCCCACCTGG F5F19 101731-101751 - F5F19-10 TAGTCGACTGTGATTTGTGAAGCTACTCC F5F19 105670-105656 SalI F5F19-11 TAGGATCCCTTCGGTTCTGAAACCACAC F5F19 105241-105251 BamhI F5F19-12 TACTCGAGTGTGATTTGTGAAGCTACTCC F5F19 105670-105656 XhoI F5F19-13 TAAGATCTCTTCGGTTCTGAAACCACAC F5F19 105241-105251 BglII F5F19-14 ATGTCGACGCCAGCTCGAATTCGTCGAG - SalI F5F19-15 GGCCCTTATGGCCGGATCCAAGAGC - - F5F19-16 ATGGAATGAAGCCTGATCCGGATTCCATTGG - - F5F19-17 CCAATGGAATCCGGATCAGGCTTCATTCCAG - - F5F19-20 TGGACTAAGAAGCTCTCTGTC F5F19 105596-105575 - F5F19-21 ACATGACCGTTTTACAATACAGC F5F19 101334-101357 - F5F19-22 CACAGCTTGAACAACTACC F5F19 105606-105615 - F5F19-24 GTTGCCATGAACGAGCTAGAGG F5F19 106264-106242 - F5F19-27 TTGTCGACACAGAATCACCGAGTTGACTCAGC F5F19 105979-105956 SalI F5F19-28 TTGGGCCCCGACGAGCTTTGAGATCATTAGAG F5F19 108069-108046 ApaI F5F19-R1 CATGTAACCACTGGTAAGACTC F5F19 100459-100481 - M13F GTAAAACGACGGCCAGTG Universal - - M13R GGAAACAGCTATGACCATG Universal - - SALKLBb1 AACCAGCGTGGACCGCTTGCTG pBIN-ROK - - Nombre Secuencia (5’-3’) CER452458F a RAFL0935-K18 RAFL0935-K18 RAFL0935-K18 RAFL0935-K18 A algunos cebadores se les ha añadido la secuencia diana de una enzima de restricción. a Materiales y Métodos 46 III.4.- Medios de cultivo, disoluciones y tampones. Para la preparación de las distintas soluciones se ha empleado agua desionizada, obtenida con una resistividad de 15 MΩ mediante un purificador Millipore (MilliRX). Para la esterilización se ha utilizado un autoclave Presoclave 75 (Selecta), sometiendo las soluciones a una presión de 1 atmósfera y 121ºC durante 20 min. Para la esterilización de las soluciones termolábiles se empleó filtración mediante filtros Millipore de 0,45 µm, 0,22 µm y 0,025 µm. III.4.1.- Medios de cultivo. III.4.1.1- Medios de cultivo para Arabidopsis thaliana. III.4.1.1.1.- Medio de cultivo líquido. Los cultivos en maceta se irrigaron con medio mínimo ATM (Arabidopsis thaliana Medium), cuya composición es la siguiente: KNO3 5mM; KH2PO4 2,5 mM; MgSO4 2 mM; Ca(NO3)2 2 mM; FeNaEDTA 51 mM; H3BO3 70 mM; MnCl2 14 mM; CuSO4 0,5 mM; ZnSO4 1 mM; NaMoO4 0,2 mM; NaCl 10 mM; CoCl2 0,01 mM (Kanz y Kirchheim, 1987). III.4.1.1.2.- Medio de cultivo sólido. Para la preparación de medio de cultivo sólido, se añadió agar bacteriológico europeo (Scharlau, concentración final de 0,8% m/v) al resto de los componentes ya disueltos en agua (medio GM). Tras su esterilización en autoclave, se dejó atemperar el medio a 55ºC, se agregaron los antibióticos en aquellos casos en los que fue necesario, y se realizó el vertido en placas de Petri. Las placas se almacenaron precintadas a 4ºC. Medio GM: NH4NO3 10,3 mM; H3BO3 50,1 mM; CaCl2 1,5 mM; CoCl2·6H2O 50 nM; Na2EDTA 55,4 µM; MgSO4 0,75 mM; MnSO4·H2O 50 µM; NaMoO4·2H2O 0,5 µM; KNO3 9,4 mM; KH2PO4 0,62 mM; ZnSO4·7H2O 15 µM; sacarosa 29,2 mM; MES [ácido 2-(N-morfolino)-etanosulfónico] 2,3 m; pH 5,7; agar 0,8% (m/v). Materiales y Métodos 47 III.4.1.2.- Medios de cultivo para microorganismos. III.4.1.2.1.- Medio de cultivo líquido. LB (Luria-Bertani): NaCl 1% (m/v), extracto de levadura 0,5% (m/v, Scharlau), bacto-triptona 1% (m/v, Scharlau), pH 7,5. Para el cultivo de Agrobacterium tumefaciens, se enriqueció el medio con glucosa 0,5% (m/v). III.4.1.2.2.- Medio de cultivo sólido. Para la elaboración de medios de cultivo sólidos se agregó agar bacteriológico europeo (Scharlau) a una concentración final del 1,5% (m/v) al medio líquido LB. Las placas se almacenaron precintadas a 4ºC. III.4.1.3.- Medios de cultivo con antibióticos. En determinadas ocasiones, se añadió antibiótico a los medios de cultivo anteriormente descritos. Los antibióticos que se han utilizado en esta Tesis se muestran en la Tabla III.3. Tabla III.3.- Antibióticos utilizados durante el desarrollo de esta Tesis. Antibiótico Solvente Concentración de la solución madre (mg/ml) Concentración final (µg/ml) Temperatura de almacenamiento (ºC) Ampicilina H2O 100 100 -20 Carbenicilina H2O 50 50 -20 Higromicina H2O 20 20 4 Kanamicina H2O 50 50 -20 Rifampicina DMSO 50 50 -20 Tetraciclina H2O 12,5 12,5 -20 III.4.2.- Disoluciones y tampones. III.4.2.1.- Disoluciones de uso común. SDS 20% 20X SSC: NaCl 3 M, citrato sódico 0,3 M y ajustando el pH a 7,0. TE pH 8: Tris-HCl 10 mM pH 8, Na2EDTA 1 mM, pH 8. Materiales y Métodos 48 III.4.2.2.- Disoluciones para el aislamiento de DNA genómico de Arabidopsis thaliana. Tampón de lisis 10X: NaCl 3,5 M, Tris-HCl 10 mM pH 7,6, Na2EDTA 10 mM pH 8. Tampón de extracción: Tampón de lisis 1X, Na2EDTA 50 mM pH 8, urea 7 M, sarkosyl (N-dodecanoil-N-metilglicina, sal sódica) 2%. Se prepara inmediatamente antes de su uso. III.4.2.3.- Disoluciones empleadas en el aislamiento de DNA plasmídico. STE: NaCl 0,1 M, Tris-HCl 10 mM (pH 8) y Na2EDTA 1 mM (pH 8). Solución I o de resuspensión: glucosa 50 mM, Tris-HCl 25 mM, Na2EDTA 10 mM. Solución II o de lisis: Preparada en el momento de su utilización. SDS 1% (v/v), NaOH 0,2 M. Solución III o de neutralización: acetato potásico 3 M, ácido acético 11,5 % (v/v). III.4.2.4.- Disoluciones utilizadas en electroforesis. 50X TAE: Tris-HCl 2 M, ácido acético 5,71%, EDTA 50 mM, pH 8,0. 10X TBE: Tris-HCl 0,89 M, BO3H3 0,89 M, Na2EDTA 20 mM, pH 8,0. Tampón de carga para electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes: glicerol al 30% (v/v), azul de bromofenol 0,25% (m/v), xilene de cianol 0,25% (m/v), formamida desionizada 50% (v/v). Tampón de carga para electroforesis en geles de agarosa y poliacrilamida en condiciones no desnaturalizantes: glicerol al 30% (v/v), azul de bromofenol 0,25% (m/v), xilene de cianol 0,25% (m/v). III.4.2.5.- Disoluciones empleadas en la identificación de clones bacterianos mediante hibridación. Solución de lavado: 2X SSC, SDS 0,1%. Solución de desnaturalización: NaCl 1,5 M, NaOH 0,5 M. Solución de neutralización: NaCl 1,5 M, Tris-HCl 0,5 M, pH 7,5. Solución de prehibridación: Na2HPO4 250 mM, SDS 7%, EDTA 1 mM, agente bloqueante 0,5% (m/v, Roche Diagnostics), pH 7,2. Solución de hibridación: solución de prehibridación junto a una sonda de DNA a una concentración de 20 ng/ml. Materiales y Métodos 49 Tampón maleico: ácido maleico 150 mM, NaCl 125 mM, Tween 20 0,3% (v/v, Sigma-Aldrich), pH 8. Solución bloqueante: agente bloqueante 0,5% (m/v, Roche Diagnostics) en tampón maleico. Tampón de detección colorimétrica: Tris-HCl 0,1 M, NaCl 0,1 M, MgCl2 50 mM, pH 9,5. III.4.2.6.- Disoluciones utilizadas en la hibridación in situ de tejidos. 20X SSC. Solución para el anticuerpo y los lavados: 1X TBS, BSA 5% (m/v), Tritón X-100 0,3% (v/v). Solución de prehibridación: 6X SSC, SDS 1,5% (m/v), formamida 50% (v/v), tRNA de levadura (100 µg/ml). Solución de hibridación: Solución de prehibridación junto a una ribosonda a una concentración particular. 20X PBS: NaCl 2,75 M, KCl 50 mM, Na2HPO4 200 mM y KH2PO4 35 mM (pH 7,4). Tampón para proteinasa K (5X): Tris-HCl 0,5 M, Na2EDTA 250 mM, pH 8,0. 10X TBS: Tris-HCl 1 M, NaCl 4 M, pH 7,5. Solución bloqueante con TBS: 1X TBS y agente bloqueante 0,5% (m/v, Roche Diagnostics). Tampón de detección A 10X: Tris-HCl 1 M, NaCl 1M, pH 9,5. Tampón de detección B 10X: MgCl2 0,5 M. Tampón de detección: tampón A 1X + tampón B 1X. III.4.2.7.- Disolución para la infiltración de plantas con Agrobacterium tumefaciens. Se resuspendieron los cultivos bacterianos en sacarosa 5% (m/v, preparada inmediatamente antes de su uso) hasta alcanzar una A600 de 0,8 y se añadió el detergente Silwet-L77 0,035% (v/v, Lehle Seeds). III.4.2.8.- Disolución de esterilización de semillas de Arabidopsis thaliana. NaClO 5% (v/v, a partir de lejía comercial), Tritón X-100 0,003% (v/v). Materiales y Métodos 50 III.4.2.9.- Sustrato para cultivo de Arabidopsis thaliana en maceta. Perlita (granulometría de 1 a 3 mm; 105-125 kg/m3; Asfaltex S.A.), vermiculita (granulometría de 0 a 3 mm; 80-100 kg/m3; Asfaltex S.A.), y turba no fertilizada (turba rubia de musgo Sphagnum de estructura gruesa; Kekkilä OY, Tuusula, Finlandia) en proporción 2:2:1. La mezcla se esterilizó en el autoclave. III.5.- Condiciones y métodos de cultivo. III.5.1.- Condiciones y métodos de cultivo para Arabidopsis thaliana. III.5.1.1.- Cultivos en placas de Petri. Tras esterilizar las semillas, mediante 8 min en la solución de esterilización reseñada en el apartado III.4.2.8 y tres enjuagues con agua estéril, éstas se dispusieron regularmente en placas de Petri de 150 mm con medio sólido GM estéril (véase el apartado III.4.1.1.2). Las semillas se estratificaron a 4ºC durante 24 h y se trasladaron a incubadores Sanyo MLR-350H, en unas condiciones de 18, 20 ó 25±1ºC, 60-70% de humedad relativa y con iluminación continua de 7.000 lux (tubos fluorescentes Toshiba FL40SS·W/37). Después de un periodo de entre 15 y 22 días, las plantas se trasplantaron a macetas o bandejas completando su ciclo de vida en la cámara climática. III.5.1.2.- Cultivos en maceta. Se utilizaron bandejas de plástico de 28 x 50 cm con 42 alvéolos de 5 x 5 cm (altura x diámetro) y con un orificio en la parte inferior, o macetas cuadradas de 12 x 12 x 5 cm con pequeños orificios, dispuestas en el interior de cubetas de plástico. En los alvéolos se colocaron cestillos de plástico con rejilla rellenos de la mezcla de sustrato (véase el apartado III.4.2.9). En las macetas cuadradas, el sustrato se dispuso directamente en su interior. Como solución nutritiva se utilizó ATM (véase el apartado III.4.1.1.1) mediante subirrigación. A cada cestillo se trasplantó una sola planta procedente de las placas de Petri. En el caso de las macetas, se trasplantaron entre 25 y 40 plantas por maceta. En ocasiones, se sembraron semillas directamente sobre el sustrato. En ambos casos, se taparon las cubetas con plástico transparente de uso alimentario agujereado en varios puntos, con el fin de evitar la vitrificación de las plantas por un exceso de humedad. El plástico se eliminó a los 3 días de incubación en la cámara climática o bien a los 12 días tras la siembra directa en el sustrato. En el caso de la siembra en Materiales y Métodos 51 cestillo, tras eliminar el plástico se colocaron soportes y cilindros de plástico del sistema aracon (Arabidopsis condom, Beta Tech, Bélgica), que separan unos individuos de otros. En el caso de la siembra directa en maceta, las semillas fueron estratificadas a 4ºC durante las 48 h iniciales. Las plantas se mantuvieron en la cámara climática a una temperatura de 20ºC±1ºC, 60-70% de humedad relativa y 7.000 lux de iluminación continua generada por tubos fluorescentes Philips F72T12/D/VHO 160 W 1.500 SF (luz blanca fría), y bombillas incandescentes de filamento de tungsteno de 60 W (luz roja). Durante las dos primeras semanas de crecimiento en la cámara climática, se regaron las plantas con solución nutritiva ATM, y posteriormente con agua potable de la red. III.5.1.3.- Realización de cruzamientos. En la realización de los cruzamientos entre distintas estirpes de Arabidopsis, inmediatamente antes del estadio de antesis, a las flores de las plantas que actuaron como parental femenino se les retiraron sépalos, pétalos y estambres con ayuda de pinzas de cirugía y una lupa de 2,5 aumentos con iluminación, o bien una lupa binocular (Leica Zoom 2000). Posteriormente, se pusieron en contacto las anteras maduras del donante de polen (parental masculino) con el pistilo de la planta receptora. Las semillas resultantes se almacenaron a 4ºC. III.5.2.- Condiciones y métodos de cultivo para Escherichia coli y Agrobacterium tumefaciens. Los cultivos se efectuaron a 28ºC en el caso de Agrobacterium tumefaciens, o a 37ºC para Escherichia coli, y se mantuvieron en agitación continua (Escherichia coli a 225 rpm; Agrobacterium tumefaciens a 270 rpm) en un incubador con agitación orbital Sanyo MIR222-RL. Para la realización de microcultivos (de 200 µl a 1 ml de cultivo), se utilizó un agitador para tubos eppendorf con control de temperatura (Thermomixer Compact, Eppendorf, Alemania). El cultivo en presencia de antibióticos se realizó con las concentraciones reflejadas en la Tabla III.3. Para la conservación de las estirpes bacterianas, a 1 ml de cultivo en medio líquido con LB (y el correspondiente antibiótico, en caso de ser necesario) se le añadieron 500 µl de glicerol al 80% (v/v) y se almacenó a –80ºC. Materiales y Métodos 52 III.6.- Estudio de las características morfológicas e histológicas. En este apartado se describen las técnicas utilizadas en la realización de los estudios fenotípicos, tanto macro como microscópicos, de las plantas de Arabidopsis analizadas. III.6.1.- Fotografía a bajo aumento. Para obtener imágenes a bajo aumento de los distintos rasgos fenotípicos se han utilizado las cámaras digitales Mavica FD-877 (Sony) y CoolPix 5400 (Nikon). En los exámenes preliminares de las características fenotípicas, se utilizó una lupa binocular Leica Zoom 2.000. Para los análisis pormenorizados de las características fenotípicas de particular interés, nos servimos de las lupas binoculares Nikon SMZ 800 y Nikon SMZ 1500, provistas de una unidad de iluminación externa de luz blanca fría (Volpi Intralux 5000-1) y conectadas a una cámara digital DXM1200F (Nikon) para la captura de imágenes. III.6.2.- Microscopia óptica. III.6.2.1.- Inclusión en resina JB4. Para la inclusión en resina se ha utilizado el sistema denominado JB4 (Polyscience), compuesto de tres elementos: A, la resina; B, un agente polimerizador, y C, el catalizador. La resina es miscible en agua, lo que permite el procesado completo de la muestra sin su total deshidratación. Las muestras se trataron con el fijador FAA/Tritón-X100 (ácido acético glacial 5%, formalina 1,75%, etanol 50%, Tritón-X100 1%) y se sometieron a vacío (500 mb, 45 min). Se reemplazó el fijador por otro recién preparado y se dejó a temperatura ambiente durante 1 h. Para la deshidratación, se eliminó el fijador y se trató inicialmente con etanol 70% durante toda la noche a 4ºC. Se prosiguió la deshidratación sometiendo las muestras a series de 2 h en etanol en concentraciones crecientes (80%, 90% y 95%). Para poder visualizar la muestra, se añadió safranina (0,5% m/v, Sigma-Aldrich) al etanol 95%, dejando de nuevo a 4ºC durante toda la noche. Al día siguiente, para eliminar la sobretinción, se lavaron las muestras con etanol 95% durante 2 h a temperatura ambiente. Con posterioridad, se preparó la solución de la resina activa, disolviendo 1,25 g del catalizador C (peróxido de benzoilo, Polyscience) en 100 ml de la solución de la resina (A), con agitación. A continuación, se elaboró una mezcla 1:1 de etanol 95% y solución de resina, añadiéndola a las muestras tras eliminar el etanol 95%. Se incubó a temperatura ambiente durante 3 h, se sustituyó esta mezcla por solución de resina Materiales y Métodos 53 activa y se mantuvo de nuevo a temperatura ambiente durante 3 h adicionales. Se mezclaron 25 ml de resina activa con 1 ml de solución de polimerización (B) en un tubo falcon de 50 ml, y se añadió a los moldes (molding cup tray, Polyscience) en los que se encontraba la muestra tras ser incubada con la resina activa. Los moldes se incubaron, envueltos en plástico transparente de uso alimentario, a 55ºC en un horno de hibridación, favoreciendo así la polimerización, y se pegaron, en la orientación adecuada, a cilindros de aluminio con un adhesivo instantáneo (Loctite, Henkel). Las secciones histológicas de 3-4 µm obtenidas en el microtomo (2050 Supercut, ReichertJung, Cambridge Instruments Gmbh) se tiñeron con azul de toluidina (Sigma-Aldrich) al 1% y ácido bórico al 0,6%. Para la visualización, se utilizó un microscopio Nikon Eclipse E-800, realizando el montaje con una gota de Eukitt (O.Kindler GMBH & Co.). Las imágenes correspondientes se obtuvieron con una cámara digital COLORVIEW-III (Nikon) acoplada al microscopio. III.6.2.2.- Inclusión en parafina. Tras la fijación inicial de las muestras, mediante tratamiento con vacío a 100 mb durante 10 min en la solución de fijación (etanol 50%, ácido acético glacial 5%, formaldehído 3,7%), se reemplazó la solución por otra recién preparada y se incubó a temperatura ambiente durante 2 h. Se deshidrataron las muestras (etanol 70%, 30 min; etanol 95%, 30 min) y se efectuó la tinción con Eosina Y 0,2% (m/v, SigmaAldrich) en etanol 95% durante 2 h a temperatura ambiente, y a continuación toda la noche a 4ºC. La aclaración o diafanización del tejido (imbibición del tejido en una sustancia miscible en parafina para facilitar su inclusión), se llevó a cabo con Histoclear (National Diagnostics) que, esencialmente, se compone de limoneno. Durante la diafanización se incubaron a temperatura ambiente las muestras en las siguientes soluciones durante 2 h: 1) Etanol 100% de gran pureza (dos incubaciones sucesivas). 2) Histoclear 25% y etanol 75%. 3) Histoclear 50% y etanol 50%. 4) Histoclear 75% y etanol 25%. 5) Histoclear 100% (dos incubaciones sucesivas). Una vez realizados estos pasos, se vaciaron a la mitad los recipientes con las muestras y se añadió parafina Paraplast-Plus (Sherwood Medical) fundida a 58ºC, dejando las muestras toda la noche a dicha temperatura. Al día siguiente, se realizaron varios cambios de parafina para permitir su penetración en el tejido y la eliminación del Histoclear. Materiales y Métodos 54 Se confeccionaron bloques de parafina con las muestras. En una placa calefactora (Plactronic, Selecta) a 55ºC, se realizó el montaje empleando moldes metálicos con una zona cóncava (Selecta) rellena de parafina fundida, en la que se depositaron las muestras en la orientación deseada. Tras enfriarse la parafina, se desmontaron los bloques. Se efectuaron cortes de 8 µm en el microtomo y las secciones se dispusieron en un baño con agua desionizada estéril a 42ºC antes de colocarlas en los portaobjetos. Las secciones se desparafinaron con Histoclear y se montaron añadiendo una gota de Eukitt. Para la visualización, se utilizó el microscopio Nikon Eclipse E-800 con iluminación de campo claro, con una cámara digital acoplada COLORVIEW-III (Nikon) para la obtención de imágenes. III.6.3.- Microscopía electrónica de barrido (SEM). Las muestras se trataron con la solución fijadora FAA/Tritón X-100, sometiéndolas a vacío (90 min, 500 mb). Se sustituyó el fijador por otro fresco, incubando a temperatura ambiente durante 1 h. Tras decantar el fijador, se incubó en etanol 70% toda la noche a 4ºC. Las muestras se deshidrataron en series crecientes de etanol (80%, 90%, 95% y 100%) durante 2 h en cada una. Tras la deshidratación, se realizó el punto crítico (critical point drying), consistente en la desecación completa de la muestra mediante la sustitución del etanol por CO2 con un aparato EM5850 (Electron Microscopy Sciences). Para la colocación de las muestras en los pedestales metálicos, se utilizó cinta de carbono adhesiva por ambas caras (Electron Microscopy Sciences). Posteriormente, las muestras se recubrieron con oro utilizando un recubridor Sputter Coater SCDOO4 (Balzers). Las muestras se observaron y se fotografiaron en un microscopio electrónico de barrido JEOL modelo JSM-840 conectado a un ordenador para el almacenamiento de la captura de las imágenes. III.7.- Aislamiento y manipulación de ácidos nucleicos. III.7.1.- Preparaciones de DNA genómico de Arabidopsis thaliana. Hemos seguido el método de obtención de DNA genómico de Arabidopsis desarrollado por Dean y colaboradores (1992) y modificado por Li y colaboradores (1999). El material vegetal se congeló con nitrógeno líquido y se homogeneizó en presencia de tampón de extracción (véase el apartado III.4.2.2). Se incubó durante 10 min a 37ºC y 225 rpm. A continuación, se añadió 1/2 volumen de fenol:cloroformo:alcohol isoamílico (24:25:1) y, de nuevo, se incubó 10 min a 37ºC y Materiales y Métodos 55 225 rpm, tras lo cual se centrifugó durante 10 min a 13.000 rpm. A la fase acuosa se le añadió aproximadamente un volumen de isopropanol y 1/10 de volumen de NaOAc 3M. Tras precipitar unos minutos en hielo, se centrifugó la muestra durante 15 min a 13.000 rpm. El precipitado se lavó con etanol absoluto y se resuspendió en 40 µl de agua estéril. A continuación, se dializaron las muestras durante 15 min utilizando un filtro de nitrocelulosa (Millipore) de 0,025 µm de diámetro de poro dispuesto en la superficie de un volumen de unos 50 ml de agua desionizada y estéril, sobre el que se depositaron las muestras. Tras la diálisis se cuantificó el DNA en un espectrofotómetro Biophotometer (Eppendorf, Alemania), midiendo una dilución 1:50 de cada preparación. III.7.2.- Preparaciones de DNA plasmídico. Para la obtención de preparaciones a pequeña escala (minipreps) de DNA plasmídico de pequeño tamaño, se partió de cultivos bacterianos de 3-10 ml de medio líquido LB. Empleamos el kit Concert Rapid Plasmid Miniprep System (Gibco BRL), basado en el método clásico de la lisis alcalina, siguiendo las instrucciones del fabricante. Se verificó el rendimiento de la extracción mediante electroforesis en un gel de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio. En los aislamientos de DNA plásmídico a mayor escala y en la obtención de PAC de estirpes de Escherichia coli, se empleó el método de lisis alcalina, realizando la precipitación con polietilénglicol y NaCl de acuerdo con Sambrook y Russell (2001). Finalmente, se resuspendió el precipitado en 200 µl de TE pH 7,6 o en agua. La integridad de los PAC se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8%. Las preparaciones obtenidas se almacenaron a –20ºC. III.7.3.- Tratamiento de DNA con enzimas de restricción. Se procuró utilizar una relación de 2 U de enzima por cada microgramo de DNA a digerir, durante un tiempo que varió de 2 h a toda la noche. Las enzimas se inactivaron por incubación a 70ºC durante 15 min y se verificó el resultado de la digestión mediante electroforesis en gel de agarosa. III.7.4.- Reacciones de ligación de DNA. Las reacciones se llevaron a cabo en un volumen de 10 a 15 µl usando de 1 a 2,5 U de enzima ligasa del bacteriófago T4 (Fermentas). En los ensayos de clonación Materiales y Métodos 56 de un inserto en un plásmido se utilizó un relación molar vector:inserto de entre 1:3 a 1:6. Los tubos de reacción se incubaron durante toda la noche a 16ºC. III.7.5.- Técnicas electroforéticas. III.7.5.1.- Electroforesis en geles de poliacrilamida (PAGE) en condiciones desnaturalizantes. Este tipo de electroforesis se utilizó en el análisis de las reacciones de transcripción in vitro para la obtención de ribosondas. Se emplearon geles del 6% de acrilamida (Pronadisa; acrilamida:bisacrilamida, 29:1) en presencia de 0,5X TBE y urea 8 M. Las bandas de los ácidos nucleicos se observaron mediante tinción convencional con bromuro de etidio e iluminación con luz ultravioleta (312 nm). Para la obtención de fotografías, se utilizó una lámpara ultravioleta acoplada a un documentador de geles GeneDOC con cámara digital (Vilmer Lourmat). III.7.5.2.- Electroforesis en geles de agarosa en condiciones no desnaturalizantes. Se prepararon geles con agarosa de punto medio de electroendósmosis (Ecogen) y un rango de concentración comprendido entre 0,8% y 2,5% (m/v), empleando como electrolito 1X TAE. Los geles contenían bromuro de etidio (0,5 µg/ml), lo que permitió la visualización inmediata de los ácidos nucleicos tras iluminación con luz ultravioleta. La obtención de fotografías se realizó de igual forma a la comentada en el apartado anterior. III.7.6.- Recuperación de DNA a partir de geles de agarosa. Para este fin se siguió un procedimiento basado en la fusión de la agarosa, cromatografía en una matriz de sílice y posterior elución siguiendo las instrucciones proporcionadas por el fabricante (GENE-CLEAN, BIO-101). El éxito del procedimiento se verificó mediante electroforesis en gel de agarosa (véase el apartado III.7.5.2). III.7.7.- Amplificación de DNA mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Las amplificaciones mediante PCR (Mullis et al., 1986) se llevaron a cabo partiendo de una cantidad de DNA molde comprendida entre 5 ng y 40 ng, en presencia de 0,3 µM de cada uno de los oligonucleótidos y 0,8 mM de una mezcla equimolar de los cuatro desoxirribonucleósidos trifosfato (dNTP; 0,2 mM de cada uno de ellos). Se añadió 0,05 U/µl de reacción de la polimerasa Taq (EcoGen). En aquellas Materiales y Métodos 57 situaciones en las que se requería una elevada fidelidad de copia se utilizó una mezcla de polimerasas con actividad correctora de prueba (High Fidelity, Roche Diagnostics). En cada uno de los casos se siguieron las condiciones indicadas por el proveedor. Se usaron tubos eppendorf de pared fina (0,2 ml y 0,5 ml). Los perfiles de reacción se programaron en termocicladores Eppendorf Mastercycler y Eppendorf Mastercycler Personal. Las muestras se sometieron a 2 min de desnaturalización inicial a 93-95ºC, 20-35 ciclos de 20-45 s de desnaturalización a 93-95ºC, 20-30 s de apareamiento de los cebadores a 45-70ºC y un periodo de extensión a 72ºC de 20 s a varios minutos. La temperatura de hibridación utilizada fue siempre 5-10ºC inferior a la temperatura de fusión (Tm, melting temperature) resultante de aplicar la siguiente fórmula con cada oligonucleótido empleado como cebador: Tm = 69,3 + 0,41·[%(G + C) del cebador] – (650/L) L= longitud del cebador en nucleótidos En aquellos casos en los que se añadió una diana para endonucleasa de restricción en el extremo 5’ del cebador, la secuencia correspondiente no computó en el cálculo de la Tm. Las reacciones se visualizaron mediante electroforesis en geles de agarosa o poliacrilamida no desnaturalizantes. III.7.8.- Secuenciación de DNA. Las reacciones de secuenciación se efectuaron en un termociclador Eppendorf MasterCycler aplicando las condiciones propuestas en el kit ABI PRISM BigDye Terminator Cycle Sequencing v2.0 Ready Reaction (Perkin Elmer). Las electroforesis de los productos de reacción se realizaron en un secuenciador automático ABI PRISM 377 (Perkin Elmer). III.7.9.- Análisis y tratamiento informático de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas. El análisis de las secuencias de ácidos nucleicos y proteínas se realizó, de forma interactiva a través de Internet, en los distintos bancos de datos internacionales utilizando los programas BLAST (Altschul et al., 1997; Tatusova y Madden, 1999) de las siguientes direcciones http://www.ebi,ac.uk/blast2/index.html (EBI, European Bioinformatic Institute del European Molecular Biology Laboratory, EMBL; RodríguezTome, 2001), http://www.arabidopsis.org/wublast/index2.jsp (TAIR, The Arabidopis Resource) y http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/ (NCBI, National Center for Materiales y Métodos 58 Biotechnology Information, Benson et al., 2002). También se usó el programa FASTA (Pearson, 1994) a través de la dirección http://www.ebi.ac.uk/fasta/index.html (EBI). Para los alineamientos de secuencia se utilizó el programa CLUSTALW (Thompson et al., 1994; Higgins et al., 1996) a través del servidor del EMBL. Para el alineamiento de las secuencias de aminoácidos se utilizó el programa CLUSTALX 1.5b (Thompson et al., 1997). El análisis de los posibles dominios proteicos se realizó a través de la dirección http://www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/, donde se encuentra alojada la base de datos Pfam (Bateman et al., 2004). III.8.- Técnicas de hibridación molecular de ácidos nucleicos. III.8.1.- Identificación de clones bacterianos mediante hibridación en colonia. III.8.1.1.- Obtención de la sonda marcada. En todos los casos se utilizaron sondas de DNA generadas por PCR. Como molécula trazadora se utilizó la digoxigenina en forma de digoxigenina-11-dUTP presente en la mezcla de desoxinucleósidos trifosfato (7 TTP:1 DIG 11-UTP). Una vez comprobada la reacción, el producto de la amplificación se precipitó en presencia de etanol y cloruro de litio 0,4 M, y una vez centrifugado, se resuspendió en el volumen deseado. III.8.1.2.- Transferencia del DNA a una membrana de nailon. Las colonias a estudiar se repicaron de forma uniforme en placas de Petri de 90 mm, utilizando una plantilla patrón a fin de colocar al menos 60 clones por placa, y se dejaron crecer durante 12 h. Tras poner en contacto la superficie de la placa con una membrana de nailon (Hybond-N, Amersham Biosciences), ésta quedó impregnada con las colonias. Las membranas se incubaron 5 min. sobre varias capas de papel GB002 (Schleicher & Schuell), equivalente al 3MM, saturadas en solución de desnaturalización (véase el apartado III.4.2.5) durante 5 min. A continuación, otros 5 min en varias capas saturadas en solución de neutralización; y, por último, 5 min adicionales en capas de papel saturadas en 20X SSC. Posteriormente, se inmovilizó el DNA mediante irradiación con luz UV (crosslinker, UniEquip Research, 120mJ/cm2) y se eliminaron los residuos bacterianos incubando la membrana en una solución 2X SSC y 0,1% de SDS a temperatura ambiente. Materiales y Métodos 59 III.8.1.3.- Tratamientos de prehibridación, hibridación con la sonda y lavado de la membrana. La prehibridación tuvo lugar con la membrana sumergida en solución de prehibridación (véase el apartado III.4.2.5) durante 2 h a 65ºC. Para la hibridación, se sustituyó la solución de prehibridación por otro volumen de la misma conteniendo la sonda, previamente desnaturalizada por calentamiento a 90ºC durante 10 min. La concentración de sonda fue de 40 ng/ml. La hibridación tuvo lugar durante 12 h a 65ºC. Tras la hibridación, para eliminar el exceso de sonda, la membrana se lavó dos veces con 2X SSC y 0,1% SDS a temperatura ambiente, seguidas de otros dos lavados con una solución 0,1X SSC y 0,1% SDS a 65ºC. III.8.1.4.- Detección colorimétrica de la señal. La fosfatasa alcalina, conjugada al anticuerpo anti-DIG, es capaz de desfosforilar al compuesto 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato de toluidino, que se comercializa con el nombre de BCIP (Roche Diagnostics) y que, en presencia de NBT (cloruro de azul nitro-tetrazoilo, Roche Diagnostics), da lugar a la formación de un precipitado de color ocre fácilmente visible. Para la detección, se siguieron los pasos que a continuación se detallan: 1) Equilibrado de la membrana con tampón maleico (véase el apartado III.4.2.5) durante 5 min. 2) Tratamiento de la membrana con la solución bloqueante (véase el apartado III.4.2.5) durante 1 h. 3) Incubación de la membrana con una dilución 1:5000 (150 mU/ml) del anticuerpo en tampón maleico durante 45 min. 4) Tres lavados de 20 min con tampón maleico para eliminar el exceso de anticuerpo. 5) Equilibrado de la membrana con el tampón para detección colorimétrica (véase el apartado III.4.2.5) durante 5 min, e incubación con esta misma solución y el sustrato (0,375 ng/ml de NBT y 0,19 ng/ml de BCIP) durante 1 h en oscuridad. La aparición de manchas de color ocre indica la posición de los clones positivos. Materiales y Métodos 60 III.8.2.- Análisis de la expresión mediante hibridación in situ en tejidos vegetales. III.8.2.1.- Obtención de ribosondas marcadas con digoxigenina. El plásmido pGEM-T posee los promotores para las polimerasas de RNA de los bacteriófagos SP6 y T7, por lo que se usó como molde de transcripción in vitro tras clonar en él el inserto deseado. Se linearizaron 5 µg del plásmido recombinante con la enzima apropiada, se precipitaron con acetato sódico 3,2 M pH 5,2 y etanol, y se resuspendieron en agua. Se usaron 2 µg de plásmido cortado como molde para una reacción de 20 µl en presencia de digoxigenina-11-dUTP de la mezcla DIG-RNA labelling mix (Roche Diagnostics), 1 µl (40 U) de inhibidor de RNasas, 2 µl de la polimerasa de RNA (T7 o SP6 10U/µl, Roche Diagnostics) y 2 µl del tampón 10X de la enzima correspondiente (Roche Diagnostics). La reacción tuvo lugar a 37ºC durante 90 min. Paralelamente, se realizaron reacciones control en las mismas condiciones pero sin digoxigenina. Tras la incubación, se añadió 1 µl de DNasaI libre de RNasas (10 U/µl, Roche Diagnostics) a la mezcla de reacción, y se mantuvo 15 min a 37ºC. Se analizó una alícuota mediante electroforesis en un gel desnaturalizante de poliacrilamida (PAGE, 6%, véase el apartado III.7.5.1). Se precipitó la sonda con tRNA de levadura (1 µg/µl, Roche Diagnostics), acetato amónico 0,6 M y 220 µl de etanol absoluto, y se almacenó a –20ºC hasta el momento de cuantificar el rendimiento del marcaje de la sonda. III.8.2.2.- Cuantificación del rendimiento del marcaje. Se centrifugó la sonda a 4ºC y 13.000 rpm durante 15 min, se eliminó el sobrenadante, se lavó el precipitado con etanol 70%, se dejó secar al aire y se resuspendió en 10 µl de agua tratada con DEPC. Con 1 µl de esta disolución se prepararon las diluciones a emplear en la cuantificación: 1/20, 1/250, 1/1000 y 1/2500. De cada una de las diluciones anteriores se aplicó 1 µl a una membrana de nailon (dot blot) que, tras secarse, se irradió con luz UV. El revelado de esta membrana se realizó junto con una tira control con distintas concentraciones de RNA marcado con digoxigenina (RNA scripts Test, Roche Diagnostics), lo que permitió la determinación empírica de la concentración de sonda a utilizar en cada caso. Materiales y Métodos 61 III.8.2.3.- Obtención y procesamiento histológico de las muestras. Se fijaron muestras de tallos tomadas a 1 cm del meristemo, donde se están formando los haces vasculares, y en la parte media de tallos de inflorescencia, con el fin de observar entrenudos que han dejado de elongarse. Los procedimientos histológicos para la inclusión en parafina se detallan en el apartado III.6.2.2, con la salvedad para la hibridación in situ de que, en lugar de portaobjetos convencionales, se emplearon portaobjetos Probe-On-Plus (Fisher), tratados en origen de forma que el tejido queda fuertemente adherido. Los moldes de parafina con las muestras se almacenaron a 4ºC hasta su utilización. III.8.2.4.- Prehibridación e hibridación de la sonda. En esta etapa tiene lugar el acceso de la ribosonda al interior celular. Previamente, se ha procedido a la desparafinización de las muestras, hidratación y permeabilización parcial de la membrana y la pared celular. Se desparafinó el tejido con dos tratamientos sucesivos con Histoclear (10 min cada uno). Se rehidrataron los tejidos con series decrecientes de etanol de 2 min cada una: dos veces en etanol absoluto, una vez en etanol 95%, 70%, 50%, 30%, y dos en agua. En este punto, se realizó la hidrólisis ácida del tejido con HCl 0,2 N durante 20 min a temperatura ambiente. Se prosiguió con un lavado de 5 min con agua, 5 min en 2X SSC y nuevamente 5 min con agua. A continuación, se incubaron los portaobjetos con el tejido en presencia de proteinasa K (1µg/µl) durante 15 min a 37ºC. Se lavaron durante 2 min con 1X PBS y se bloqueó la acción de la proteinasa K incubando 2 min en 1X PBS con glicina (0,2% m/v). Tras dos lavados con 1X PBS de 2 min cada uno, se volvió a fijar el tejido con una solución de 1X PBS y formaldehído (3,7% v/v) a temperatura ambiente durante 10 min, seguido de dos pasos de 5 min con 1X PBS. Se prosiguió con la deshidratación del tejido en series crecientes de etanol de 2 min cada paso hasta llegar al etanol absoluto. Tras secar brevemente los portaobjetos, se sometieron a vacío durante 20 min a una presión de 100 mb. Para la hibridación, se precalentaron los portaobjetos con el tejido en una placa calefactora (Selecta) a 45ºC durante unos minutos. Mientras tanto, se prepararon las diluciones de la sonda en tampón de hibridación, desnaturalizando a 80ºC. Se aplicaron 300 µl de la solución de hibridación a cada portaobjetos con su muestra correspondiente, disponiéndose éstos enfrentados dos a dos. Gracias al sistema Probe-On-Plus, entre los tejidos de ambos portaobjetos se genera un espacio donde Materiales y Métodos 62 discurre la solución de hibridación en contacto con el tejido. Para la hibridación, los portaobjetos emparejados se guardaron en una cámara húmeda toda la noche a 52ºC. III.8.2.5.- Lavados e inmunodetección colorimétrica de la señal. Tras realizar dos lavados de 90 min en una solución 2X SSC y formamida (50% v/v), se desarrolló la inmunodetección. Los portaobjetos se incubaron sucesivamente en 1X TBS durante 5 min; 1 h con solución bloqueante con 1X TBS, y 30 min en 1X TBS, Tritón X-100 (0,3% v/v) y BSA (1% m/v). A continuación, se incubaron 90 min con el anticuerpo anti-DIG (dilución 1:3.000) en esta última solución. Se realizaron tres lavados de 20 min cada uno con la misma solución sin anticuerpo, con el fin de eliminar su exceso. Para alcalinizar el medio, incubamos con el tampón de detección sin sustrato durante 5-10 min (III.4.2.6). Esta solución se reemplazó por el tampón de detección con el sustrato. Por cada 100 ml de solución de detección, se añadieron 150 µl de NBT (III.8.1.4, 100 mg/ml) y 150 µl de BCIP (III.8.1.4, 50 mg/ml). Se incubó en oscuridad durante un periodo que osciló entre 12 y 18 h. La reacción se detuvo reemplazando la solución de detección por agua. En el montaje de los portaobjetos, se deshidrató el tejido en series crecientes de etanol de forma rápida (2 min cada una), tras lo cual se añadió una gota de Eukitt al portaobjetos y se dispuso el cubreobjetos. Las muestras se visualizaron utilizando un microscopio Eclipse E-800 de Nikon con cámara digital COLORVIEW-III (Nikon) conectada a un ordenador con el sistema de análisis de imágenes AnalySiS (Nikon). III.9.- Transformación bacteriana. III.9.1.- Transformación por choque térmico. Para la obtención de células competentes, partimos de la estirpe DH5α de E. coli y se siguió el protocolo descrito en Sambrook y Russell (2001). Las cantidades de DNA empleadas para transformar oscilaron entre 1 y 10 ng. III.9.2.- Transformación por electroporación. Se utilizó esta técnica en aquellos casos en los que se requería un elevado número de transformantes de E. coli, o en el caso de Agrobacterium tumefaciens, donde fue el método rutinario de transferencia. Las cepas bacterianas utilizadas con este procedimiento fueron DH10β (E. coli), y LBA4404 y C58C51 (Agrobacterium Materiales y Métodos 63 tumefaciens). Las muestras de DNA se dializaron con membranas de nitrocelulosa de 0,025 µm de diámetro de poro durante 15 min. Se utilizaron cubetas Eppendorf de 2 mm de paso y se empleó un electroporador modelo Electroporator 2510 (Eppendorf, Alemania) con los siguientes parámetros: 2.500 V de descarga, 10 µF y 330 Ω de resistividad. III.10.- Transformación de Arabidopsis thaliana. Hemos transformado plantas con estirpes de Agrobacterium tumefaciens portadoras de T-DNA modificados como vehículo de introducción de construcciones exógenas. III.10.1.- Obtención de las construcciones de sobreexpresión. El cDNA completo del gen At1g52150 de Arabidopsis thaliana se obtuvo a partir de la colección de clones de cDNA de Arabidopsis thaliana generada en el Instituto RIKEN Genomics Sciences Center (clon RAFL09-35-K18; Seki et al., 1998; 2002). Se amplificó mediante PCR con la mezcla de polimerasas High Fidelity (Roche Diagnostics) utilizando los cebadores F5F19.21-14 y F5F19-15 (véase la tabla III.2). El cDNA mutante se ha generado mediante la mutagénesis in vitro del cDNA silvestre tras la amplificación por PCR a partir del clon RAFL09-35-K18 con dos parejas de cebadores: la pareja F5F19.21-16 y F5F19-15, y la pareja F5F19.21-17 y F5F19.21-14 (véase la tabla III.2). Los cebadores F5F19.21-16 y F5F19.21-17 se han diseñado para crear una transición G→A en la quinta posición del quinto exón del gen At1g52150. El cDNA mutante se obtuvo amplificando con los cebadores F5F19.21-14 y F5F19.21-15, utilizando los fragmentos generados con las dos parejas anteriores como molde. Tanto el cDNA silvestre como el mutante, se digirieron con las enzimas SalI y BamHI, presentes en los cebadores F5F19.21-14 y F5F19-15, respectivamente, para su clonación en el plásmido pBINJIT (véase el apartado III.2) en la orientación adecuada para su expresión (Fig. III.2). Estas construcciones, denominadas 35S:ICU4 y 35S:ICU4-G189D, respectivamente, se introdujeron en la estirpe C58C1 de Agrobacterium tumefaciens (véase el apartado III.1.3) mediante electroporación (véase el apartado III.9.2). Materiales y Métodos 64 III.10.2.- Obtención de la construcción de interferencia. Para la obtención de la construcción 35S:ICU4-RNAi, se amplificó una porción genómica de la región codificante del gen At1g52150 con las dos parejas de cebadores idénticas F5F19.21-10 y F5F19.21-11, y F5F19.21-12 y F5F19.21-13, pero que contienen dianas para las enzimas de restricción SalI y BamHI, y XhoI y BglII, respectivamente (véase la tabla III.2). Ambos fragmentos se clonaron en el vector pCF6 (véase el apartado III.2) en orientaciones opuestas, quedando separados por el sexto intrón del gen FUL. Esta combinación se transfirió al plásmido pBIN-JIT (Fig.III.2) y, posteriormente, se introdujo en la estirpe C58C1 de Agrobacterium tumefaciens (véase el apartado III.1.3) mediante electroporación (véase el apartado III.9.2). III.10.3.- Infiltración con Agrobacterium tumefaciens. El presente protocolo está basado en el de Clough y Bent (1998) que es, a su vez, una modificación simplificada del desarrollado por Bechtold (1993). Este procedimiento no requiere la utilización de hormonas ni de vacío para llevar a cabo la infiltración. A una bolsa de sustrato esterilizada, se le añadió medio ATM hasta humedecerlo completamente. El sustrato se dispuso en macetas cuadradas de 12 x 12 x 12 cm (largo x ancho x alto), que se envolvieron por completo con plástico transparente de uso alimentario al que se le practicaron de 25 a 30 agujeros, donde se trasladaron plántulas de 15 días previamente cultivadas en placas de Petri. Se cultivaron las plantas hasta que se desarrollaron las inflorescencias y aparecieron las primeras flores en antesis y algún fruto en desarrollo, los cuales se eliminaron previamente a la infiltración. Se prepararon cultivos de Agrobacterium tumefaciens de 10 ml con masilla bacteriana del clon de interés, cultivado recientemente en placa de Petri, y se incubó a 28ºC y 270 rpm durante 24-48 h. Se tomó un 1 ml de este cultivo para la inoculación de 500 ml de LB enriquecido con glucosa al 0,5% (m/v). Se incubó a 270 rpm y 28ºC hasta llegar a una A600 de entre 0,8 y 1,2. En este momento, se centrífugo el cultivo a 7.500 rpm durante 15 min a 4ºC. El precipitado resultante se resuspendió en solución de infiltración (III.4.2.7) hasta obtener una A600 de 0,8. A continuación, se añadió Silwet L-77 (Lehle Seeds). Esta solución se dispuso en bandejas de 15 x 20 x 5 cm (largo x ancho x alto) sumergiendo y agitando las inflorescencias de las plantas unos segundos (floral dipping). Las plantas infiltradas se trasladaron a la cámara climática hasta completar su ciclo y recoger las semillas. Materiales y Métodos 65 G>A A B SalI BamHI SalI BamHI C Intrón 6 de FUL SalI BamHI BglII XhoI F5F19.21-10 F5F19.21-11 F5F19.21-12 F5F19.21-13 F5F19.21-14 F5F19.21-15 F5F19.21-16 F5F19.21-17 Figura III.2.- Esquemas de las construcciones transgénicas. (A) Esquema de la construcción de sobreexpresión del cDNA silvestre del gen ATHB15, a la que hemos denominado 35S:ICU4. (B) Esquema de la construcción 35S: ICU4-G189D de sobreexpresión del cDNA del gen ATHB15 en el que hemos generado la misma mutación presente en el alelo icu4-1, una transición G→A en la quinta posición del quinto exón, mediante los cebadores F5F19.21-16 y F5F19.21-17. (C) Esquema de la construcción de interferencia, 35S:ICU4-RNAi, que contiene una porción genómica de la región codificante del gen ATHB15 (azul) clonada en orientaciones opuestas, quedando ambos fragmentos separados por el sexto intrón del gen FUL. Las flechas negras indican el sentido de la transcripción. Materiales y Métodos 66 III.10.4.- Selección de los transformantes. Con el fin de identificar los individuos transformantes, las semillas resultantes de las plantas infiltradas se sembraron de forma masiva en placas de Petri (1.0001.500 semillas por placa) que contenían medio de cultivo GM (véase el apartado III.4.1.1.2) y kanamicina, el antibiótico al cual el T-DNA confería resistencia. III.11.- Cartografía génica mediante análisis de ligamiento a marcadores SSLP. La cartografía génica se realizó a partir de muestras de DNA genómico correspondientes a individuos de la progenie F2 de cruzamientos entre el mutante y un ecotipo distinto de su ancestro silvestre, que deben ser polimórficos para los marcadores empleados. Se obtuvo una población cartográfica integrada por 50 plantas F2, procedentes del cruzamiento entre el mutante icu4-1 (ecotipo En-2) y el ecotipo silvestre Ler, que manifestaban el fenotipo recesivo, en nuestro caso el fenotipo silvestre. Las plantas se recolectaron 21 días después de la siembra para proceder a la extracción de su DNA genómico (véase apartado III.7.1). Se ha empleado el marcador molecular de tipo SSLP (Simple Sequence Lenght Polymorphism) CER452458 (Cereon Genomics, Monsanto Company), situado en el BAC F5F19 del cromosoma I, tras comprobar que se trata de un marcador que muestra polimorfismo entre En-2 y Ler, de tal forma que con los oligonucleótidos CER452458F y CER452458R (véase la tabla III.2) se obtiene un producto de amplificación de 140 pb en el caso de En-2 y de 113 pb en el de Ler. Una vez comprobado esto, procedimos al genotipado para este marcador de los 50 individuos de la población cartográfica. III.12.- Genotipado molecular de los alelos icu4. Como consecuencia de las inserciones de T-DNA en los alelos icu4-4 e icu45, se generaron polimorfismos moleculares de tipo SSLP. Con el objetivo de poder genotipar estos alelos, se diseñaron dos cebadores que flanquean el punto de inserción, y otro situado en el borde izquierdo del T-DNA, de manera que en el alelo silvestre y en el mutante se amplifican bandas de diferente tamaño (Tabla III.4). Materiales y Métodos 67 Tabla III.4.- Genotipado molecular de los alelos icu4. Alelo icu4-4 icu4-5 Cebadores genómicos F5F19.21-R1; F5F19.21-7 F5F19.21-22; F5F19.21-24 Cebador en el T-DNA Tamaño de los producto de amplificación en pb (silvestre/mutante) SALKLBb1 2500/1000 SALKLBb1 610/720 III.13.- Tratamientos con auxinas y con inhibidores de su transporte. Se prepararon disoluciones madre del inhibidor del transporte polar de auxinas NPA (Naphthylphthalamic acid, Duchefa Biochemie) y de la auxina sintética NAA (1-Naphtalene acetic acid, Duchefa Biochemie) de 400 mM y 10 mM, respectivamente, en DMSO. Se sembraron las semillas en medio sólido GM en las condiciones anteriormente descritas (véase apartado III.5.1.1). Las plántulas fueron trasplantadas 12 días después de la siembra a macetas cuadradas y subirrigadas con medio ATM al que se le había añadido 10, 20 ó 40 µM NPA, ó 0.1, 0.5 ó 1 µM NAA. Como control, se subirrigaron plantas con ATM que contenía la misma cantidad de DMSO añadida junto al NPA o el NAA. III.14.- Análisis estadístico mediante χ2. El valor de χ2 se obtuvo tras contrastar los datos obtenidos en las segregaciones con las hipótesis de partida. No se rechazaron las hipótesis cuyo valor de χ2 fue inferior al existente con un grado de significación del 95%. En la Tabla III.5 se muestran los valores del estadístico para distintos grados de libertad, correspondiendo éstos al número de clases fenotípicas menos uno. Materiales y Métodos 68 Tabla III.5.- Valores del estadístico χ2 con distintos grados de libertad (GL). Grados de Libertad χ20,95 1 2 3 3,84 5,99 7,82 IV.- Resultados Resultados 70 IV.- Resultados IV.1.- Caracterización fenotípica de los mutantes icu4-1 e icu4-2. Con el fin de poder inferir la función del gen INCURVATA4 (ICU4) y la naturaleza de las alteraciones ocasionadas por los alelos icu4-1 e icu4-2, se ha realizado la caracterización fenotípica exhaustiva de los distintos órganos de los dos mutantes. Ambos presentan exactamente el mismo fenotipo, observándose que éste es sensible a la temperatura, ya que es más severo a 25ºC que a 20ºC o 18ºC (esta Tesis; José Luis Micol, comunicación personal), y muy pleiotrópico, viéndose afectados procesos tan diversos como el establecimiento del eje adaxial-abaxial en los órganos laterales, la filotaxia, el tiempo de floración, el establecimiento del patrón vascular y la embriogénesis. IV.1.1.- Morfología foliar. El rasgo fenotípico más conspicuo de los mutantes icu4-1 e icu4-2 se observa en las hojas, cuyos márgenes están curvados hacia el haz, un fenotipo que ha recibido la denominación de Incurvata (Serrano-Cartagena et al., 2000). El fenotipo resulta evidente tanto en las hojas embrionarias, los cotiledones, como en las hojas de la roseta basal y las caulinares, siendo más acusado en los primeros pares de hojas postembrionarias (Fig. IV.1). La curvatura foliar es más fuerte en los homocigotos icu41/icu4-1 (Fig. IV.1 B, F) que en los heterocigotos ICU4/icu4-1 (Fig. IV.1 C, G), si bien éstos también se distinguen claramente de las plantas silvestres En-2 (Fig. IV.1 A, E), principalmente en las etapas iniciales de la expansión foliar. Hay varias posibles interpretaciones que permiten explicar el comportamiento semidominante de los alelos icu4-1 e icu4-2. La semidominancia podría deberse a la haploinsuficiencia de una mutación de pérdida de función o, alternativamente, a una mutación de ganancia de función. Una aproximación para distinguir entre estas dos alternativas es la realización de un análisis de dosis del gen en triploides portadores de una única dosis del alelo mutante y dos dosis del correspondiente alelo silvestre (Timpte et al., 1994). Esta estrategia se llevó a cabo mediante el cruzamiento del homocigoto icu4-1/icu4-1 con la línea tetraploide LC611, de fenotipo silvestre, lo que permitió obtener una F1 triploide con dos copias del alelo silvestre y una copia del mutante (genotipo ICU4/ICU4/icu4-1). El fenotipo de estas plantas (Fig. IV.1 D, H) es similar al del heterocigoto ICU4/icu4-1, lo que sugiere que se trata de un alelo de ganancia de función. De haberse tratado de un caso de haploinsuficiencia, se habría esperado que las dos dosis del alelo silvestre presentes en el triploide hubieran sido Resultados 71 suficientes para conferir un fenotipo normal. Así mismo, este resultado sugiere que el alelo mutante tampoco es del tipo antimorfo o dominante negativo, ya que en tal caso se habría esperado una cierta reducción del fenotipo mutante del triploide respecto al del heterocigoto. A B C D E F G H Figura IV.1.- Fenotipo de las rosetas basales y de las hojas vegetativas de plantas En-2 e icu4-1. Rosetas y hojas del silvestre En-2 (A, E), del homocigoto icu4-1/icu4-1 (B, F), del heterocigoto ICU4/icu4-1 (C, G) y del triploide ICU4/ICU4/icu4-1 (D, H). Las imágenes fueron tomadas 20 días después de la germinación. En las ampliaciones (E-H), todas las hojas pertenecen al segundo nudo. Las barras de escala equivalen a 50 mm (A-D) y a 25 mm (E-H). Se han obtenido cortes histológicos de cotiledones y de hojas juveniles silvestres y mutantes, no observándose ninguna perturbación evidente en las estructuras internas de los órganos mutantes que permita explicar la curvatura observada (Fig. IV.2), tal y como se había descrito previamente para las hojas (Serrano-Cartagena et al., 2000), salvo una ligera disminución del tamaño de las células tanto de la epidermis adaxial como de la abaxial. A B Figura IV.2.- Cortes transversales de cotiledones de plántulas de 3 días. Los cortes se realizaron aproximadamente en la parte central del limbo de los cotiledones de En-2 (A) e icu4-1 (B). La barra de escala equivale a 100 µm. Resultados 72 No obstante, se observan alteraciones que afectan a la superficie abaxial de las hojas vegetativas de los mutantes icu4-1 e icu4-2. Una de dichas alteraciones es la ausencia de tricomas en la superficie abaxial de las hojas de la roseta basal, hasta la quinta o sexta hoja. Por el contrario, hemos comprobado que en el ecotipo En-2, el ancestro silvestre del mutante icu4-1, sólo las tres primeras hojas carecen de tricomas en la superficie abaxial, al igual que sucede en los ecotipos Wassilewskija (Ws-2) y Landsberg erecta (Ler; Telfer y Poethig, 1994; Telfer et al., 1997). Además, ocasionalmente, los mutantes presentan crecimientos anómalos en esta superficie, cerca del margen foliar (Fig. IV.3). A B Figura IV.3.- Crecimientos anómalos en la superficie abaxial de hojas vegetativas del mutante icu4-1. Las imágenes fueron obtenidas 20 días después de la germinación. Ambas hojas pertenecen al tercer nudo. Las barras de escala equivalen a 50 mm. IV.1.2.- Estructura corporal. La filotaxia de las hojas de la roseta también está alterada en los mutantes icu4-1 e icu4-2. Mientras que los individuos silvestres presentan para el primer y el segundo par de hojas una filotaxia decusada, es decir, con un ángulo de divergencia de 180º, y el resto se dispone según un patrón de filotaxia espiral con un ángulo de divergencia que oscila alrededor de 137,5º (Kang et al., 2003; Fig. IV.1 A), las plantas homocigotas mutantes mantienen la filotaxia decusada (ángulo de divergencia de 180°) hasta el cuarto o quinto par de hojas (Fig. IV.1 B). Así mismo, las inflorescencias principales de los mutantes también muestran fallos en la filotaxia, observándose ocasionalmente el desarrollo de dos hojas caulinares, con sus ramas axilares asociadas, partiendo del mismo nudo o de dos nudos separados por un entrenudo muy corto y siguiendo un patrón decusado (Fig. IV.4 A, B). Además, la longitud de los entrenudos entre silicuas, un rasgo relativamente constante en los individuos silvestres, presenta una mayor variabilidad en todas las inflorescencias de las plantas mutantes (Fig. IV.4 C, D, E). Resultados 73 B A D C E 35 5 30 0 25 5 20 0 15 5 10 0 5 5 0 0 En-2 icu4-1 <1 1-5 6-10 11-15 16-20 21-25 >26 Longitud de los entrenudos Figura IV.4.- Alteración de la filotaxia de los mutantes icu4-1. (A) Plantas En-2 (izquierda) e icu4-1 (derecha), 50 días después de la siembra. En el mutante icu4-1 se aprecian dos hojas caulinares surgiendo del mismo nudo o de dos nudos muy próximos y mostrando una filotaxia decusada (flecha). (B) Fallo en la filotaxia en una planta icu4-1. La longitud de los entrenudos es bastante constante en el silvestre (C), lo que no sucede en el mutante, en el que además se observa el reducido tamaño de las silicuas (D). La barra de escala equivale a 1 cm. (E) En la gráfica se representa la longitud de los entrenudos (mm) entre las 11 primeras silicuas de 10 plantas En-2 y de 10 plantas icu4-1. Estas alteraciones en el patrón de filotaxia podrían deberse a una malformación en la estructura del meristemo. No obstante, no parece ser esto lo que ocurre en los homocigotos icu4-1 e icu4-2, ya que no se observa ninguna diferencia apreciable, ni en el tamaño ni en la morfología, entre los cortes longitudinales de los meristemos de plántulas En-2 e icu4-1, tres días después de la germinación (Fig. IV.5). Resultados 74 B A Figura IV.5.- Meristemo apical del tallo de plántulas En-2 e icu4-1, 3 días después de la germinación. (A) Sección longitudinal de una plántula En-2. (B) Sección longitudinal de una plántula icu4-1. Las barras de escala equivalen a 50 µm. Los mutantes icu4-1 e icu4-2 florecen más tarde que su ancestro silvestre En2 (Fig. IV.6). Para verificar esta observación con mayor precisión, se determinó el tiempo de floración en las plantas mutantes icu4-1 y en las silvestres En-2 (día después de la siembra en el que se observan las yemas florales). Los resultados obtenidos, que se recogen en la Tabla IV.1, permiten afirmar que los mutantes icu4-1 son de floración tardía, lo que se traduce en que tardan más que el silvestre en sufrir la transición floral y acumulan, por tanto, un mayor número de hojas en la roseta basal (Fig. IV.6). Este último rasgo es un parámetro ampliamente aceptado para cuantificar el tiempo de floración, ya que las plantas de floración tardía presentan un mayor número de hojas vegetativas (Koornneef, 1991; 1995). A B Figura IV.6.- Retraso en el tiempo de floración en los mutantes icu4-1. Plantas En-2 (A) e icu4-1 (B) 45 días después de la siembra. Esta última acaba de sufrir la transición floral y presenta un mayor número de hojas en la roseta basal. La barra de escala equivale a 1 cm. Resultados 75 Tabla IV.1.- Tiempo de floración y número de hojas que forman la roseta en el silvestre (En-2) y en las plantas mutantes icu4-1. Tiempo de floracióna Nº de hojas en la rosetab En-2 24,9 ± 3,9 14,9 ± 2 icu4-1 39,3 ± 2,6 39 ± 7,7 Cada valor representa la media calculada a partir de los datos obtenidos de 25 plantas En-2 y de 35 plantas icu4-1 ± desviación estándar. a Día después de la siembra, en el que las yemas florales son visibles. b Los datos son de plantas que han sufrido la transición floral. En-2 40 días después de la siembra e icu4-1 50 días después de la siembra. IV.1.3.- Morfología de los órganos florales. Los órganos florales no están afectados en los mutantes icu4-1 e icu4-2, ni en el número ni en la morfología. En las imágenes obtenidas mediante microscopía óptica y de barrido, no se observa ninguna diferencia entre las plantas homocigotas mutantes y las plantas En-2. Sin embargo, los frutos de los mutantes tienen un tamaño menor que los del silvestre (Fig. IV.4 D). Este fenotipo se debe a una disminución en la fertilidad del polen de las plantas mutantes, ya que la polinización de los pistilos de las plantas icu4-1 e icu4-2 con polen silvestre da lugar a la recuperación de este fenotipo. IV.1.4.- Morfología del patrón vascular en la inflorescencia. Para comprobar si los mutantes tienen alterado el patrón vascular del tallo, se realizaron cortes transversales en la parte media de la inflorescencia principal de plantas silvestres de 55 días, y de plantas mutantes de 60 días, o de 75 días en el caso de plantas con floración especialmente tardía. Las secciones de los tallos de los individuos silvestres En-2 constan habitualmente de 7 a 9 haces vasculares, separados por fibras interfasciculares, que se organizan formando una eustela (véase el apartado I.6.3.1). En los haces vasculares, el xilema y el floema adoptan un patrón colateral, es decir, con el xilema dispuesto hacia el interior del tallo y el floema hacia la periferia, estando ambos separados por el procámbium (véase apartado I.6.3.1; Fig. IV.7 A, C). Los haces vasculares en el mutante icu4-1 también adoptan un patrón colateral (Fig. IV.7 B, D). Ocasionalmente, el número de éstos en los tallos mutantes es menor que en los silvestres (Fig. IV.7 B, G), si bien el área media es mayor en el caso de las secciones de los haces vasculares del mutante (Tabla IV.2; Fig. IV.7 B, D). Resultados 76 Los haces del homocigoto icu4-1 contienen más capas de procámbium, y como consecuencia, se observa una producción mucho mayor de floema y algo incrementada en el caso del xilema, así como un mayor tamaño de las traqueidas del metaxilema (Tabla IV.2; Fig. IV.7 B, D). Estas diferencias afectan también a la morfología de los haces vasculares, de manera que las secciones de éstos en el silvestre adoptan la forma de un triángulo isósceles, mientras que en el mutante suelen aparecer con una forma más rectangular o trapezoidal (Fig. IV.7 C, D). A pesar de que el número de haces vasculares en algunos de los tallos del mutante icu4-1 es menor que en el silvestre, el área media total de las secciones de los haces (AHV) mutantes es claramente mayor. Por lo tanto, teniendo en cuenta que el área media de las secciones de los tallos (AT) mutantes y silvestres es aproximadamente la misma, el mutante presenta una relación superficie de haz vascular frente a superficie de tallo claramente mayor que la del silvestre (AHV/AT; Tabla IV.2). En algunas regiones, las fibras interfasciculares de los mutantes icu4-1 no presentan el típico engrosamiento de la pared secundaria que se observa en el silvestre (Fig. IV.7 E, F). Tabla IV.2.- Análisis histológico del tallo del silvestre En-2 y del mutante icu4-1. Área del floemaa (µm²) Área del procámbiuma (µm²) Área del xilemaa (µm²) ATb (µm²) AHVb (µm²) AHV / AT En-2 1.035,53 ± 165,96 456,09 ± 93,46 4.356,5 ± 978,71 454.366,9 ± 162.523,7 68.444,99 ± 22.536,15 0,152 ± 0,018 icu4-1 1.597,96 ± 293,64 1.123,05 ± 277,05 5.920,36 ± 1315,65 451.585,9 ± 131.194,8 84.316,94 ± 18.708,39 0,190 ± 0,018 a Cada valor representa la media calculada a partir de los datos obtenidos de 10 haces vasculares del silvestre En-2 y de 10 del mutante icu4-1, de tres tallos de inflorescencia diferentes ± desviación estándar. b Cada valor representa la media calculada a partir de los datos obtenidos de 6 tallos de inflorescencia del silvestre En-2 y de 6 del mutante icu4-1 ± desviación estándar. AT: Área media de las secciones de tallo. AHV: Área media del total de haces vasculares por sección de tallo. Resultados 77 A e en co B Figura IV. 7.- Efectos de la mutación icu4-1 e en co me hv me Sección transversal de En-2. (B) Sección hv if if en la diferenciación vascular de los tallos. (A) transversal de icu4-1. (C) Haz vascular de En2. (D) Haz vascular de icu4-1. (E) Fibras C D fl tr interfasciculares tr fl de En-2. (F) Fibras interfasciculares de icu4-1. (G) Gráfica en la que se representa el número de haces vasculares de 20 tallos En-2 y de 20 tallos px mx px pc pc E mx icu4-1. co, corteza; e, epidermis; en, endodermis; f, floema; hv, haz vascular; if, fibras interfasciculares; me, médula; mx, F metaxilema; pr, procámbium; px, protoxilema; tr, traqueida. La barra de escala equivale a if 100 µm en (A) y (B) y a 50 µm en (C), (D), (E) co e if co y (F). e G 14 12 10 En-2 icu4-1 8 6 4 2 0 5 6 7 8 9 Número de haces vasculares IV.1.5.- Desarrollo embrionario. La embriogénesis también está afectada en los mutantes icu4-1 e icu4-2, hecho que se pudo constatar a través de la visualización de anomalías en los órganos generados durante esta fase de desarrollo, caso de los cotiledones. Tras la siembra de cualquiera de los dos mutantes, se observó la aparición de plántulas con un número anormal de cotiledones o con una morfología alterada. Aproximadamente, el 3% de las Resultados 78 plantas sembradas presentó tres cotiledones (Fig. IV.8 A), el 1% mostró un solo cotiledón (Fig. IV.8 B) y otro 1% dos cotiledones fusionados (Fig. IV.8 C). B A C Figura IV.8.- La mutación icu4-1 causa defectos en la embriogénesis. Mutante icu4-1 con tres cotiledones (A), un cotiledón (B) o dos cotiledones fusionados (C). IV.2.- Caracterización fenotípica del doble mutante icu4-1 hst-1. Previamente, se describió la interacción sinérgica entre mutaciones semidominantes icu4 y de pérdida de función en el gen HST (véase el apartado I.6.6), basándose principalmente en el fenotipo observado en la roseta de los dobles mutantes icu4-1 hst-5 (Serrano-Cartagena et al., 2000). Para analizar el fenotipo de los dobles mutantes en otros órganos que pudieran aportar mayor información sobre el proceso biológico afectado, obtuvimos el doble mutante de icu4-1 con el alelo nulo hst1, un alelo que había sido caracterizado en detalle previamente (Telfer y Poethig, 1998). El mutante hst-1 presenta un fenotipo muy pleiotrópico que consiste en una aceleración del cambio de fase, un engrosamiento del meristemo apical, una adaxialización parcial de las hojas y de los órganos florales y una reducción del crecimiento general de la planta (Telfer y Poethig, 1998; Bollman et al., 2003; Fig. IV.9 A, C). El doble mutante icu4-1 hst-1 presenta una roseta basal de un tamaño muy reducido, con unas hojas vegetativas más curvadas que las de los mutantes simples e, incluso, algunas de ellas radializadas (Fig. IV.9 B). A diferencia de lo que sucede en el mutante hst-1, el doble mutante es de floración muy tardía y no muestra un adelanto en el cambio de fase, ya que, tal y como sucede en el mutante simple icu4-1 no presenta tricomas en la superficie abaxial de los cuatro o cinco primeros pares de hojas (Fig. IV.9 C, D). Una vez florece, presenta tallos muy finos y, en ocasiones, se forman rosetas aéreas (Fig. IV.9 E). Resultados 79 A B C D E Figura IV.9.- Fenotipo de la roseta basal y las hojas vegetativas de hst-1 y del doble mutante icu4-1 hst-1. Roseta de 20 días de hst-1, que ya ha realizado la transición floral, (A) y de icu4-1 hst-1 (B). Hojas vegetativas del segundo nudo de hst-1 (C), que presenta tricomas en su superficie abaxial, y de icu4-1 hst-1 (D), que carece de los mismos. (E) Roseta aérea de una planta icu4-1 hst-1 50 días después de la siembra. Las barras de escala equivalen a 50 mm (A) y (E), 25 mm (B) y (C) y 10 mm (D). Se han caracterizado los fenotipos de pistilos en estadio 12, antes de la antesis, y de silicuas en estadio 14, después de la antesis (Smyth et al., 1990; Ferrándiz et al., 1999), mediante microscopía óptica y de barrido (Fig. IV.10). En estadio 12, los pistilos de En-2 y los de icu4-1 son indistinguibles, mientras que los de hst-1 están ligeramente aplanados y presentan un estigma de mayor tamaño que el de su ancestro silvestre, el ecotipo Ler (Fig. IV.10 A-C). Además, en hst-1, los pistilos de aparición más tardía en la inflorescencia presentan carpelos incorrectamente fusionados en la parte apical, como se había descrito previamente (Bollman et al., 2003). En las secciones transversales que hemos realizado en silicuas de estadio 14, no se observó diferencia alguna entre En-2 e icu4-1. Sin embargo, las silicuas de hst-1 presentan un septum que no se fusiona completamente (Fig. IV.10 I-K). A pesar del débil fenotipo observado en los pistilos y silicuas de los mutantes simples, el doble mutante presenta un fuerte fenotipo, consistente en una fusión reducida de los carpelos, incompleta formación del septum, producción de tejido del estilo y del estigma en posiciones anormales y la formación de una placenta con óvulos asociados, un tejido de naturaleza adaxial en el silvestre, en lugar del replum abaxial (Fig. IV.10 D, E). Se observa también una alteración en la polaridad de los Resultados 80 óvulos, incluso en los pistilos menos afectados, evidenciada por el fallo del integumento externo para cubrir completamente al integumento interno y la nucela (Fig. IV.10 F). B A C F E D G H I r v r J v K r v s s s s s v v r r r v Figura IV.10.- Fenotipo del pistilo, del fruto y de los estambres de icu4-1, hst-1 y del doble mutante icu4-1 hst-1. Pistilos de En-2 (A), icu4-1 (B), hst-1 (C) e icu4-1 hst-1 (D, E). (F) Óvulos ectópicos adaxializados del doble mutante icu4-1 hst-1. Estambre de icu4-1 (G), indistinguible del silvestre (no mostrado), y del doble mutante (H), que en ocasiones muestra los sacos polínicos en posiciones laterales. Cortes transversales de ovarios de icu4-1 (I), idéntico al silvestre (no mostrado), hst-1 (J) e icu4-1 hst-1 (K). Las imágenes fueron tomadas en estadio 12 (A-E, G, H) o 14 (F, I-K). Las barras de escala equivalen a 50 µm (I-K), 100 µm (A-H) Resultados 81 Otros órganos florales mostraron asimismo un desarrollo anormal. Mientras que los estambres del silvestre y los de los mutantes icu4-1 y hst-1 son indistinguibles y presentan los sacos polínicos en posición normal, en la superficie adaxial, en los estambres del doble mutante se observa ocasionalmente un desplazamiento de los sacos polínicos hacia posiciones laterales (Fig. IV.10 G, H). Estas fuertes transformaciones de estructuras abaxiales en adaxiales en las que está implicado icu4-1, un alelo de ganancia de función, sugieren que el gen ICU4 codifica un producto con función adaxial. IV.3.- Obtención de dobles mutantes con otros genes implicados en el establecimiento del eje adaxial-abaxial. Fenotipos similares al observado en los pistilos del doble mutante icu4-1 hst1, de transformación del replum abaxial hacia placenta, ya se habían descrito en los dobles mutantes que implicaban a alelos de pérdida de función en los genes KAN1 y KAN2 (véase el apartado I.6.4), CRC (véase el apartado I.6.4), HST y genes como PICKLE/GYMNOS (PKL/GMN; Ogas et al., 1997; 1999), un factor remodelador de la cromatina. Estos fenotipos se pueden interpretar como el resultado de una adaxialización parcial del replum y de los óvulos (Eshed et al., 1999; 2001). Con el fin de identificar nuevas interacciones genéticas con los alelos semidominantes del gen ICU4, obtuvimos dobles mutantes de icu4-1 con los alelos de pérdida de función kan12, pkl-1 y crc-1. Los dobles mutantes icu4-1 kan1-2 e icu4-1 pkl-1 mostraron un fenotipo meramente aditivo, observándose una ligera interacción en el caso del doble mutante icu4-1 crc-1. Las silicuas de las plantas homocigotas para el alelo nulo crc-1 son cortas, ensanchadas, aplanadas, abiertas por el ápice, con un septum incorrectamente fusionado y muy ocasionalmente presentan un óvulo sobre la superficie del replum abaxial (Fig. IV.11A, B, F; Alvarez y Smyth, 1999). El fenotipo es ligeramente más fuerte en las silicuas del doble mutante icu4-1 crc-1, que suelen mostrar una fisura de gran tamaño en la parte apical por la que se pueden ver claramente los óvulos, y una mayor frecuencia de óvulos ectópicos (Fig. IV.11 C−E). Tras la observación de 30 frutos procedentes de tres dobles mutantes diferentes se pudo constatar la presencia de 8 óvulos ectópicos, en el replum abaxial, mientras que ninguno de los 30 frutos crc1 observados presentaron este fenotipo. Además, las silicuas del doble mutante son más anchas y aplanadas, y muestran una menor fusión del septum que la observada en las silicuas crc-1 (Fig. IV.11 F, G). Estos resultados indican que el fenotipo mutante Resultados 82 causado por la homocigosis de crc-1 se ve incrementado por el alelo de ganancia de función icu4-1. También se obtuvieron dobles mutantes con el alelo icu4-1 y alelos de pérdida de función de otros genes implicados directa o indirectamente en el establecimiento del eje adaxial-abaxial, como AS1 (véase el apartado I.6.2.1) y PNH (véase el apartado I.6.6). El gen AS1 participa en el establecimiento de la identidad adaxial en la hoja (Xu et al., 2003), y PNH promueve la actividad del meristemo apical y la especificación de algunos rasgos adaxiales en la hoja (McConnell y Barton, 1995; Newman et al., 2002). Los dobles mutantes entre icu4-1 y los alelos as1-1 y pnh-2 mostraron fenotipos meramente aditivos. D C B A E r F G v r s s s v s v r v Figura IV.11.- Fenotipo de pistilos y silicuas de crc-1 y del doble mutante icu4-1 crc-1. Pistilos de crc-1 (A, B) y de icu4-1 crc-1 (C, D). (E) Óvulo ectópico de un doble mutante. Cortes transversales de ovarios de crc1 (F) y de icu4-1 crc-1 (G). Las imágenes fueron tomadas en estadio 13 (A-E) y 14 (F, G). Las barras de escala equivalen a 50 µm (F, G), 100 µm (B, D, E) y 200 µm (A, C). IV.4.- Caracterización molecular del gen ICU4. Previamente, se situó el locus en el que se localizaban las mutaciones icu4-1 e icu4-2 en una amplia región del cromosoma 1. La cartografía de baja resolución Resultados 83 realizada dio una posición para el gen a 31,5 ±7,0 cM por debajo del marcador T27K12-Sp6 y 16,9 ±4,5 cM sobre el marcador nga128 (Serrano-Cartagena et al., 2000). El análisis de los datos indicó que en la amplia región comprendida entre los marcadores T27K12-Sp6 y nga128, o cerca de ella, se localizan dos genes candidatos potenciales a ser los responsables de los fenotipos producidos por los dos alelos semidominantes del gen ICU4. Uno de ellos es KAN2, un gen del que ya se habían descrito mutaciones de pérdida de función causantes de transformaciones adaxiales, esto es, la sustitución de elementos de naturaleza abaxial por estructuras de tipo adaxial (Eshed et al., 2001). El otro gen, At1g52150, codifica un miembro de la familia de factores de transcripción HD-ZIP III (véase el apartado I.6.5.2), a la que pertenecen los genes PHB, PHV y REV, de los que se ha publicado la existencia de diversas mutaciones semidominantes responsables de transformaciones adaxiales (McConnell y Barton, 1998; McConell et al., 2001; Emery et al., 2003; Zhong y Ye, 2004). Durante la realización de este trabajo el gen At1g52150 ha recibido los nombres de ATHB15 y CNA (Prigge et al., 2005; Green et al., 2005; véase el apartado I.6.5.2). Dada la naturaleza semidominante de los alelos icu4-1 e icu4-2, una característica comparable a la de muchos alelos de genes de la familia HD-ZIP III, adoptamos el gen At1g52150 como el principal candidato. Con el fin de determinar si el gen ICU4 está localizado en la misma posición genética que el At1g52150, se utilizó el marcador CER452458 (Cereon Genomics, Monsanto Company), que es polimórfico entre los ecotipos En-2 y Ler y está situado en el PAC F5F19, el mismo en el que está el propio gen At1g52150. Se obtuvo una población cartográfica F2 a partir de un cruzamiento entre el mutante icu4-1 y el ecotipo silvestre Ler (véase el apartado III.11). Tras el genotipado de 50 individuos de fenotipo silvestre para el marcador CER452458, los 100 cromosomas analizados mostraron el rasgo polimórfico correspondiente a Ler, no observándose por tanto recombinación entre el gen y el marcador. En conclusión, con la resolución de mapeo empleada, el gen ICU4 muestra un ligamiento absoluto a CER452458. Este resultado indica que ambos ocupan loci muy cercanos, hecho que es compatible con que ICU4 sea, en efecto, el gen At1g52150 (ATHB15). A continuación, se secuenció en los mutantes icu4-1 e icu4-2 la región del gen ATHB15 con homología a la que presenta las mutaciones semidominantes en otros genes HD-ZIP III (véase el apartado I.6.5.2). En ambos, se identificó la misma mutación puntual, una transición G→A en la quinta posición del exón 5, correspondiente en el mRNA al presunto sitio de unión del miRNA165/166 (Fig. IV.12 A, D), un cambio idéntico al que se produce en algunos alelos semidominantes de los Resultados 84 genes PHB y PHV (McConnell et al., 2001) y similar al de los alelos semidominantes de REV (Emery et al., 2001; Zhong y Ye, 2004; Fig. IV.12 D). La mutación causa un cambio del aminoácido glicina por aspártico en la posición 189 de la proteína, en el dominio START, una posición muy conservada en las proteínas de la familia HD-ZIP III de Arabidopsis (McConnell et al., 2001; Rhoades et al., 2002; Fig. IV.12 C). La secuenciación del resto del gen en el mutante icu4-1 no permitió encontrar ninguna alteración adicional potencialmente causante de un fenotipo semidominante. Al mismo tiempo, también se secuenció toda la región codificante el gen KAN2 (At1g32240), no observándose ninguna mutación, lo que parecía descartar la posibilidad de que icu4-1 e icu4-2 fueran dobles mutantes. Esto supone un dato adicional que señala a ATHB15 como el único gen causante de los fenotipos observados en los mutantes icu4-1 e icu4-2. IV.4.1.- Estructura del gen ICU4. El gen ATHB15/ICU4 está incluido en el clon F5F19 del cromosoma 1, entre las posiciones 101.401 y 105.449. Tiene una longitud de 4.049 pb y está formado por 18 exones (Fig IV.12 A). Su cDNA consta de 3.437 pb, lo que incluye un líder 5’ no traducido de 716 pb, una pauta de lectura abierta de 2.511 pb y una cola 3’ no traducida de 210 pb. En las bases de datos hay depositadas secuencias de 6 cDNA obtenidos en el ecotipo Col-0, entre las que se distinguen dos transcritos diferentes, que corresponden a dos proteínas que difieren en un solo aminoácido, NP_175627.1 y NP_849795.1, de 836 y 837 aminoácidos, respectivamente (NCBI, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). La proteína ICU4 contiene los tres dominios característicos de los miembros de la familia HD-ZIP III: un homeodominio (HOX), entre el residuo 15 y el 75 (Pfam, http:// www.sanger.ac.uk/Software/Pfam/); una cremallera de leucina (BRLZ), del aminoácido 56 al 116, y un dominio START, entre las posiciones 160 y 370 (Fig. IV.12 B). La proteína ICU4 tiene un porcentaje de identidad con sus parálogos ATHB8, PHB, REV y PHV del 76, 65, 64 y 63%, respectivamente, y un 86, 78, 77 y 77% de similitud. ICU4 también tiene un gran parecido con las proteínas pertenecientes a la familia HD-ZIP III de otras especies vegetales como Zinnia elegans o el maíz. Con las proteínas de Zinnia, presenta una identidad del 80, 79, 74, 65, 64, 64, y 64%, con ZeHB-13, ZeHB2, ZeHB-10, ZeHB-1, ZeHB-3, ZeHB-11 y ZeHB-12, respectivamente, y una similitud del 88, 87, 85, 78, 77, 77 y 77%; y con la del maíz ROLLED LEAF1 (RLD1), muestra una identidad y una similitud del 64 y 78%, respectivamente. En principio, los únicos ortólogos potenciales descritos de ICU4 son los genes ZeHB-13 y ZeHB-2 de Zinnia elegans, con los cuales comparte exactamente la misma secuencia diana para los Resultados 85 miRNA165/166 (Fig. IV.12 D). Como puede apreciarse en la Figura IV.12 D, las dianas de los mRNA de estos tres genes son completamente complementarias al miRNA166, mientras que las dianas de los mRNA del resto de los genes HD-ZIP III muestran complementariedad total con el miRNA165. A Transición G→A en icu4-1 e icu4-2 500 pb Región codificante Región no codificante B HOX C ATHB15 ATHB8 PHB PHV REV SIAEETLAEFLSKATGTAVEWVQMPGMKPGPDSIGIIAISHGCTGVAARACGLVGLEPTR SIADETLTEFISKATGTAVEWVQMPGMKPGPDSIGIVAISHGCTGIAARACGLVGLDPTR SIAEEALAEFLSKATGTAVDWVQMIGMKPGPDSIGIVAISRNCSGIAARACGLVSLEPMK SIAEETLAEFLCKATGTAVDWVQMIGMKPGPDSIGIVAVSRNCSGIAARACGLVSLEPMK SIAEETLAEFLSKATGTAVDWVQMPGMKPGPDSVGIFAISQRCNGVAARACGLVSLEPMK ***:*:*:**:.*******:**** ********:**.*:*: *.*:********.*:* : 60 60 60 60 60 ATHB15 ATHB8 PHB PHV REV VAEIVKDRPSWFRECRAVEVMNVLPTANGGTVELLYMQLYAPTTLAPPRDFWLLRYTSVL VAEILKDKPCWLRDCRSLDIVNVLSTANGGTLELIYMQLYAPTTLAPARDFWMLRYTSVM VAEILKDRPSWLRDCRSVDTLSVIPAGNGGTIELIYTQMYAPTTLAAARDFWTLRYSTCL VAEILKDRPSWFRDCRCVETLNVIPTGNGGTIELVNTQIYAPTTLAAARDFWTLRYSTSL IAEILKDRPSWFRDCRSLEVFTMFPAGNGGTIELVYMQTYAPTTLAPARDFWTLRYTTSL :***:**:*.*:*:**.:: ..::.:.****:**: * *******..**** ***:: : 120 120 120 120 120 ATHB15 ATHB8 PHB PHV REV EDGSLVVCERSLKSTQNGPSMPLVQNFVRAEMLSSGYLIRPCDGGGSIIHIVDHMDLEAC EDGSLVICERSLNNTQNGPSMPPSPHFVRAEILPSGYLIRPCEGGGSILHIVDHFDLEPW EDGSYVVCERSLTSATGGPTGPPSSNFVRAEMKPSGFLIRPCDGGGSILHIVDHVDLDAW EDGSYVVCERSLTSATGGPNGPLSSSFVRAKMLSSGFLIRPCDGGGSIIHIVDHVDLDVS DNGSFVVCERSLSGSGAGPNAASASQFVRAEMLSSGYLIRPCDGGGSIIHIVDHLNLEAW ::** *:*****..: **. . ****:: .**:*****:*****:*****.:*: 180 180 180 180 180 ATHB15 ATHB8 PHB PHV REV SVPEVLRPLYESPKVLAQKTTMAALRQLKQIAQEVT SVPEVLRSLYESSTLLAQRTTMAALRYLRQISQEIS SVPEVMRPLYESSKILAQKMTVAALRHVRQIAQETS SVPEVLRPLYESSKILAQKMTVAALRHVRQIAQETS SVPDVLRPLYESSKVVAQKMTISALRYIRQLAQESN ***:*:*.****..::**: *::*** ::*::** . 216 216 216 216 216 Resultados 86 D miR165 miR166 Arabidopsis thaliana ATHB15 icu4-1,2 ATHB8 PHB phb-3d, 4d, 5d REV rev-10d, avb-1 rev-σmiRNA PHV phv-1d, 2d, 3d, 4d Zinnia elegans ZeHB-13 ZeHB-2 ZeHB-10 ZeHB-1 ZeHB-3 ZeHB-12 ZeHB-11 Zea mays RLD1 Rld1-O Physcomitrella patens PpHB10 3’ CCCCCUACUUCGGACCAGGCU 5’ 3’ CCCCUUACUUCGGACCAGGCU 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ CUGGAAUGAAGCCUGGUCCGG CUGGAAUGAAGCCUGAUCCGG CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG UUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG UUGGGAUGAAGCCUGAUCCGG CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG CUGGGAUGAAGCCUGGUCUGG CUGGGAUGAAGCCUGGACCAG UUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG UUGGGAUGAAGCCUGAUCCGG 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ 5’ CUGGAAUGAAGCCUGGUCCGG CUGGAAUGAAGCCUGGUCCGG CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 3’ 5’ CUGGGAUGAAGCCUGGUCCGG 3’ 5’ CUGAGAUGAAGCCUGGUCCGG 3’ 5’ CUGGUAUGAAGCCUGGUCCGG 3’ Figura IV.12.- Estructura del gen ICU4. (A) Esquema del gen ICU4 en el que se muestra el sitio mutado en icu4-1 e icu4-2. Los exones están representados por rectángulos y los intrones por las líneas que los separan. La transcripción tiene lugar de izquierda a derecha. (B) Esquema en el que se representa la proteína ICU4, con sus dominios conservados. (C) Alineamiento de las secuencias del dominio START de las proteínas ATHB15, ATHB8, PHB, PHV y REV. Los aminoácidos idénticos a ATHB15 están sombreados. “*”, residuos idénticos; “:”, sustituciones conservadas; “.” , sustituciones semiconservadas. (D) Alineamiento de las secuencias de miRNA165, miRNA166 y de sus secuencias diana. Se sombrean en gris los nucleótidos diferentes a ATHB15 y en rojo las mutaciones descritas. IV.4.2.- Obtención de plantas transgénicas. IV.4.2.1.- Sobreexpresión de los cDNA silvestre y mutante del gen ICU4 en las plantas silvestres En-2. Para demostrar la implicación del gen ATHB15 en el fenotipo Incurvata4, se han generado varios tipos de plantas transgénicas, en las que se ha dispuesto el cDNA silvestre o el cDNA con la mutación presente en los alelos semidominantes, la mutación de cambio de sentido G189D, bajo el control de una repetición en tándem del promotor constitutivo 35S del CAMV presente en el vector pBIN-JIT (véase el apartado III.2; Ferrándiz et al., 2000). Las construcciones han recibido las denominaciones de 35S:ICU4 y 35S:ICU4-G189D. El cDNA silvestre se obtuvo del Riken Genomic Sciences Center (clon RAFL09-35-K18; Seki et al., 1998; 2002). El cDNA mutante se ha generado mediante la mutagénesis in vitro del cDNA silvestre tras la amplificación Resultados 87 por PCR a partir del clon RAFL09-35-K18 con dos parejas de cebadores (véase el apartado III.10.1). Dos de estos cebadores se han diseñado para crear una transición G→A en la quinta posición del quinto exón del gen ATHB15. Estas construcciones se emplearon para la transformación de células de E. coli, realizándose la identificación de los clones positivos mediante la técnica de hibridación en colonia (véase el apartado III.8.1), utilizando como sonda la región del cDNA comprendida entre los cebadores F5F19.21-7 y F5F19.21-8 (véase la tabla III.2). El DNA plasmídico de los transformantes se empleó para transformar células competentes de la estirpe C58C1 de Agrobacterium tumefaciens. La integridad de las construcciones en los transformantes se verificó mediante la secuenciación de los segmentos clonados. Se emplearon entre 100 y 250 plantas En-2 para la transformación mediante inmersión floral (floral dipping; véase apartado III.10.3). Las semillas resultantes de la autofecundación de las plantas infiltradas se sembraron en placas de Petri con una densidad media de 2.500 semillas por placa. Para la selección de las plantas transgénicas se añadió al medio el antibiótico kanamicina (véase el apartado III.10.4). Todas las plantas transgénicas que sobreexpresan el cDNA silvestre de ICU4 muestran floración muy tardía, fallos en el patrón de filotaxia y tallos muy gruesos (Fig. IV.13 A). Ocasionalmente, aparece también alguna hoja vegetativa con los márgenes foliares ligeramente curvados hacia el haz (Fig. IV.13 B), hojas caulinares sin rama axilar asociada (Fig. IV.13 C) y pérdida de la dominancia apical (Fig. IV.13 A). En contraste, se identificaron dos clases de plantas portadoras de la construcción 35S:ICU4-G189D. Una de ellas incluye individuos fenotípicamente silvestres, que deben ser el resultado del silenciamiento del transgén, y la otra comprende una clase con varias plantas que cubren un amplio rango de fenotipos alterados. A esta última clase pertenecen plantas con las hojas desde moderadamente curvadas (Fig. IV.14 C) a plantas severamente afectadas (Fig. IV.14 A, B), con hojas radializadas −aparentemente adaxializadas, ya que presentaban tricomas en toda su superficie−, sépalos y pétalos también radializados (Fig. IV.14 E, F), y pistilos muy anormales, con múltiples óvulos y tejidos carpeloides ectópicos, así como disminución de la fusión de las valvas y falta de diferenciación de la región apical (Fig. IV.14 G, H). Las plantas con los fenotipos más extremos (Fig. IV.14 A) no llegaron a florecer, mientras que el resto presentaron una floración muy tardía, por lo que mostraron rosetas basales con un gran número de hojas vegetativas (Fig. IV.14 E). En estas últimas plantas se observó también una acusada pérdida de la dominancia apical (Fig. IV.14 E). Las aberraciones morfológicas mostradas por las plantas transgénicas que expresan de forma constitutiva el cDNA mutante son del tipo de las transformaciones adaxiales producidas por los alelos semidominantes icu4-1 e icu4-2, aunque mucho Resultados 88 más fuertes, lo que constituye una prueba adicional de que el gen ICU4 codifica un producto con función adaxial. A B C Figura IV.13.- Fenotipo de las plantas En-2 portadoras de la construcción 35S:ICU4. (A) Planta transgénica que muestra gran cantidad de hojas vegetativas, tallos muy gruesos, fallos en el patrón de filotaxia y pérdida de la dominancia apical. (B) Roseta basal que presenta una hoja juvenil con los márgenes curvados hacia el haz (flecha). (C) Hojas caulinares sin rama lateral asociada. La barra de escala equivale a 1cm. Las imágenes fueron tomadas 70 (A y C) y 30 (B) días después de la siembra. IV.4.2.2.- Sobreexpresión de una construcción de interferencia en las plantas homocigotas icu4-1/icu4-1. La construcción 35S:ICU4-RNAi se ha diseñado para interferir con el mRNA endógeno de la planta. Incluye una porción genómica de la región codificante del gen ICU4 en las dos posibles orientaciones, sentido y antisentido. Para su elaboración, se amplificaron por PCR dos fragmentos que contenían el mismo segmento genómico y diferían en las dianas de restricción de sus extremos. Los productos de la amplificación se ligaron en el vector pCF6 (Cristina Ferrándiz; véase el apartado III.2) en orientaciones opuestas, quedando separados por el sexto intrón del gen FUL (véase el apartado I.6.3.3). La posterior transferencia de esta combinación al plásmido pBIN-JIT, dio lugar a la obtención de la construcción 35S:ICU4-RNAi (véase el apartado III.10.2). Tras la transformación de células competentes de E. coli, se identificaron los clones positivos mediante hibridación en colonia (véase el apartado III.8.1), empleando como sonda la región del cDNA comprendida entre los cebadores F5F19.21-10 y F5F19.21-11, que amplifican el segmento genómico utilizado para la obtención de la construcción (véase la tabla III.2). El DNA plasmídico de los transformantes se introdujo en la estirpe C58C1 de Agrobacterium tumefaciens, Resultados 89 empleándose las bacterias con los plásmidos recombinantes para la transformación de plantas mutantes icu4-1, que se realizó de igual forma a la comentada en el apartado anterior para las plantas silvestres, una vez que se verificó la integridad de la construcción mediante secuenciación. A B C D E F G H Figura IV.14.- Fenotipo de las plantas En-2 portadoras de la construcción 35S:ICU4-G189D y de una planta icu4-1 con la construcción de interferencia. Plantas En-2 portadoras de la construcción 35S:ICU4G189D con la mayoría de sus hojas radializadas (A), con un fenotipo menos severo (B) y con un fenotipo Incurvata moderado (C). (D) Planta icu4-1 con la construcción de interferencia, mostrando hojas aplanadas. La planta B, después de la transición floral, presentó órganos florales radializados (E-F) y pistilos anormales (G-H). Las barras de escala indican 1mm (A-D), 1 cm (E), 0,5 cm (F) y 0,5 mm (G-H). Las imágenes fueron tomadas 40 (A), 35 (B), 25 (C), 15 (D) y 90 (E-F) días después de la siembra. Los pistilos están aproximadamente en estadio 13 (G-H). Se observaron dos tipos de fenotipos entre las plantas transformantes. Plantas transgénicas con rosetas de fenotipo moderadamente Incurvata y resistencia parcial a la kanamicina, probablemente debidas al silenciamiento parcial del transgén, y plantas con rosetas de fenotipo silvestre (Fig. IV.14 D). Esta supresión del fenotipo mutante en los homocigotos icu4-1 es consistente con las hipótesis de que el alelo semidominante se debe a una mutación de ganancia de función y de que el gen ATHB15 es el responsable del fenotipo observado en los mutantes icu4-1 e icu4-2. Las plantas En-2 Resultados 90 portadoras de la construcción 35S:ICU4-RNAi no mostraron ningún fenotipo mutante observable. IV.4.3.- Análisis de la expresión del gen ICU4. Analizamos la expresión de ICU4 mediante hibridación in situ en tallos de inflorescencia de En-2 e icu4-1 a 1 cm del meristemo apical, zona en la que se están formando los haces vasculares, y en la parte media de la inflorescencia, en entrenudos que ya han alcanzado su longitud final (véase el apartado III.8.2). El resultado parece confirmar datos que indican que el gen se expresa con mayor intensidad en el mutante (José Luis Micol, comunicación personal). Además, tal y como se ha visto para el alelo semidominante phb-1d (McConnell et al., 2001), la expresión del alelo icu4-1 persiste en regiones en las que se detecta normalmente ICU4 en el silvestre durante estadios tempranos y deja de hacerlo a lo largo del desarrollo, lo que implica la expresión ectópica del gen en el mutante. A B C D Figura IV.15.- Análisis de la expresión del gen ICU4 en tallos de inflorescencia de En-2 y de icu4-1 mediante hibridación in situ. Cortes transversales de tallos de inflorescencia de En-2 (A) e icu4-1 (B), a 1 cm del meristemo apical y en la parte media de tallos de inflorescencia de En-2 (C) e icu4-1 (D) en los que se observa el patrón de expresión de ICU4 . Las barras de escala equivalen a 100 µm (A-B) y 250 µm (CD). En las secciones transversales obtenidas a 1 cm del meristemo apical, es decir, durante una etapa inicial del desarrollo del tallo, ICU4 se expresa en un dominio amplio que incluye principalmente la epidermis, el tejido vascular en formación y la médula, tanto en el silvestre como en el mutante icu4-1 (Fig. IV.15 A, B). Estos resultados coinciden con los obtenidos por Prigge y colaboradores (2005). En un estadio más avanzado del desarrollo del tallo, como son los entrenudos que han dejado de elongarse, la expresión en el silvestre parece restringirse a una débil señal en la epidermis y a la eustela, observándose la tinción en el procámbium y el xilema de los haces vasculares y en las fibras interfasciculares. La señal en el mutante icu4-1 es algo diferente, ya que ésta es mucho más fuerte que en el silvestre, observándose además un cierta expresión en la región del floema y la persistencia de la tinción en la médula (Fig. IV.15 C, D). Resultados 91 IV.5.- Análisis de las interacciones genéticas entre ICU4 y otros miembros de la familia HD-ZIP III. IV.5.1.- Obtención de alelos de pérdida de función. Con el fin de obtener alelos de pérdida de función, se realizó una búsqueda de líneas de inserción de T-DNA en las colecciones de dominio público. Se encontraron dos líneas de la colección Salk Institute T-DNA insertion collection (Alonso et al., 2003) con inserciones en el gen ICU4, las líneas SALK_045175 y SALK_013134. La primera contiene una inserción de T-DNA a 755 pb del codón de inicio, muy cerca del punto en el que comienza la transcripción, y la segunda contiene una inserción en la región 3’ no traducida, a 107 pb del codón de parada (Fig. IV.16 A; base de datos SIGnal). Se ha confirmando la presencia y la posición de las inserciones mediante amplificación por PCR (véase el apartado III.12). Las líneas SALK_045175 y SALK_013134 son, por tanto, posibles portadoras de alelos nulos que hemos denominado icu4-5 e icu4-4, respectivamente. En el laboratorio de J.L. Micol se ha descrito un alelo adicional de pérdida de función (icu4-3), que corresponde a la línea de T-DNA SALK_017186, que lleva una inserción en el segundo exón del gen. Ninguno de estos tres alelos causa fenotipo mutante en homocigosis. Este dato es similar a las descripciones anteriormente publicadas de homocigotos para los alelos de pérdida de función de otros miembros de la familia HD-ZIP III, como athb8-1, athb8-2, cna-2, phb-6 y phv-5 (Baima et al., 2001; Emery et al., 2003; Prigge et al., 2005), que no mostraron ningún fenotipo mutante, hecho que se ha explicado aduciendo la existencia de redundancia funcional entre los distintos genes de la familia. Entre éstos, el gen REV es el único cuyos alelos de pérdida de función muestran un fenotipo alterado en homocigosis (véase el apartado I.6.5.2). IV.5.2.- Análisis de los dobles mutantes icu4 athb8. Como se ha mencionado en el apartado anterior, se ha argumentado que la ausencia de fenotipos mutantes en los individuos homocigotos para los alelos de pérdida de función de los miembros de la familia HD-ZIP III se debe a la redundancia funcional de estos genes (Emery et al., 2003; Prigge et al., 2005). El gen ATHB8 (At4g32880) es el parálogo más cercano a ICU4 en Arabidopsis. Con el propósito de obtener dobles mutantes para alelos de pérdida de función de los dos genes, se realizó también una búsqueda de líneas con inserciones de TDNA en ATHB8. Una línea de la colección GABI-Kat (Rosso et al., 2003; Sthrizov et al., 2003; Li et al., 2003), la línea GABI_256E07, contiene una inserción de T-DNA en la región 3’ no traducida del gen ATHB8, a 11 pb del codón de parada (Fig. IV.16 B), Resultados 92 que le confiere resistencia al antibiótico sulfadiacina. La línea es, por lo tanto, portadora de un posible alelo nulo del gen ATHB8 al que hemos llamado athb8-6. La homocigosis de este alelo tampoco causa fenotipo mutante. Así mismo, las plantas homocigotas dobles icu4-5 athb8-6, obtenidas en la F2 de un cruzamiento entre parentales que eran homocigotos simples para los dos alelos, tampoco muestran fenotipo mutante alguno. A icu4-5 icu4-4 500 pb Región codificante Región no codificante B athb8-6 500 pb Región codificante Región no codificante Figura IV.16.- Localización de las inserciones de T-DNA de los alelos icu4 y athb8. (A) Esquema del gen ICU4 en el que se muestra el sitio de la inserción en icu4-4 e icu4-5 (triángulo rojo). Los exones están representados por rectángulos y los intrones por las líneas que los separan. La trancripción tiene lugar de izquierda a derecha. (B) Esquema similar del gen ATHB8, en el que se marca el sitio de la inserción en el alelo athb8-6. IV.5.3.- Análisis de los dobles mutantes icu4-1 rev. La homocigosis para los alelos de pérdida de función del gen REV produce un fenotipo mutante que consiste fundamentalmente en la carencia de meristemos axilares y de fibras interfasciculares, defectos en el desarrollo de los meristemos florales y un mayor tamaño general de la planta y de todos sus órganos (Fig. IV.17 A; Talbert et al., 1995; Zhong y Ye, 1999; Otsuga et al., 2001; véase el apartado I.6.5.2). Se han obtenido dobles mutantes entre el alelo de ganancia de función icu4-1 y los alelos de pérdida de función del gen REV, rev-1 y rev-6 (Fig. IV.17; Talbert et al., 1995). Los dobles mutantes rev-1 icu4-1 y rev-6 icu4-1 muestran una sorprendente recuperación del fenotipo mutante Revoluta hacia un fenotipo más parecido al silvestre en varios de sus rasgos. A diferencia de los mutantes rev de pérdida de función, los dobles mutantes presentan meristemos axilares asociados a la mayoría de las hojas Resultados 93 caulinares, formándose ramas laterales a partir de ellos, y un desarrollo normal de las flores (Fig. IV.17 A). Además, muestran una floración muy tardía, dando lugar a rosetas basales con gran cantidad de hojas vegetativas de bordes aserrados (Fig. IV.17 B). Ocasionalmente, también se forman rosetas aéreas (Fig. IV.17 C). A B C Figura IV.17.- Fenotipos del doble mutante icu4-1 rev-1. (A) Plantas rev-1 (izquierda) e icu4-1 rev-1 (derecha). Las plantas rev-1 presentan meristemos florales que no son capaces de formar flores (flecha roja) y carecen de meristemos axilares (flecha azul). Estos fenotipos se recuperan en el doble mutante, que produce flores que se desarrollan de forma normal (flecha roja) y ramas axilares (flecha azul). (B) Roseta basal de un doble mutante que presenta gran cantidad de hojas aserradas. (C) Roseta aérea formada en el tallo principal de inflorescencia de un doble mutante. Las barras de escala equivalen a 1 cm. Las imágenes fueron tomadas 60 (A y C) y 40 días después de la siembra (B). IV.5.4.- Análisis de los dobles mutantes icu4-1 phb1-d. El alelo semidominante phb-1d se debe a una mutación de ganancia de función en el gen PHB que produce la transformación de los tejidos abaxiales de los órganos laterales en adaxiales (McConnell y Barton, 1998; véase los apartados I.6.4 y I.6.5.2). Las plantas heterocigotas PHB/phb-1d exhiben un grado variable de simetría radial en todos los sus órganos laterales y tienen un porte arbustivo, debido a la formación de yemas axilares ectópicas cercanas a las regiones de las hojas con identidad adaxial (Fig. IV.18 A; McConnell y Barton, 1998). Dada la elevada similitud en las secuencias de los productos ICU4 y PHB, así como el parecido entre los alelos semidominantes phb-1d e icu4-1, esperábamos una intensificación mutua de los fenotipos mutantes en los dihíbridos ICU4/icu4-1;PHB/phb-1d. Sorprendentemente, estas plantas no mostraron el fuerte fenotipo que se esperaba. Por el contrario, los dobles heterocigotos presentan un fenotipo más débil. Son plantas menos arbustivas, debido a la formación de un número menor de meristemos ectópicos, y con los órganos laterales menos Resultados 94 adaxializados que en el heterocigoto PHB/phb-1d, lo que implica que el alelo icu4-1 suprime parcialmente el fenotipo causado por la mutación phb-1d (Fig. IV.18 B). Para descartar la posible influencia del fondo genético En-2 en la expresividad de la mutación phb-1d, se cruzaron plantas heterocigotas PHB/phb-1d por En-2, observándose que los individuos heterocigotos de la F1 presentaban un fenotipo similar al de sus parentales mutantes. A B Figura IV.18.- Disminución del fenotipo causado por la mutación phb-1d en el doble heterocigoto ICU4/ icu4-1;PHB/phb-1d. (A) Heterocigoto PHB/phb-1d. (B) Doble heterocigoto ICU4/icu4-1;PHB/phb-1d. Las barras de escala equivalen a 5 mm. Las imágenes fueron tomadas 60 días después de la siembra. IV.6.- Análisis de los dobles mutantes icu4-1 fil-3. FILAMENTOUS FLOWER (FIL), un gen perteneciente a la familia de genes YABBY (véase el apartado I.6.4), se expresa en el dominio abaxial de todos los órganos laterales, y regula el tiempo de floración, el desarrollo de los meristemos de inflorescencia y florales y el establecimiento de la identidad abaxial en los órganos laterales (Chen et al., 1999; Sawa et al., 1999a; 1999b). Con el fin de estudiar la existencia de una posible interacción génica entre los genes ICU4 y FIL, se han obtenido dobles mutantes para icu4-1 y el alelo débil de pérdida de función fil-3. Las plantas homocigotas fil-3 presentan floración temprana, órganos florales parcialmente adaxializados y débiles defectos en la formación de las flores (Fig.IV.19 A). El doble mutante icu4-1 fil-3 tiene floración tardía, fallos en la filotaxia, pérdida de la dominancia apical y pedicelos y entrenudos muy largos. Este último fenotipo se debe probablemente a una disminución respecto al mutante simple fil-3 en la capacidad de formar flores (Fig. IV.19 B), característica que presentan también los alelos nulos de Resultados 95 FIL, como fil-5 (Chen et al., 1999). Además, las transformaciones adaxiales son también más fuertes en el doble mutante. Por lo tanto, el alelo icu4-1 parece incrementar el fenotipo alterado debido a la pérdida parcial de la función FIL de los homocigotos fil-3. A B Figura IV.19.- Fenotipo de fil-3 y del doble mutante icu4-1 fil-3. (A) Planta fil-3 y (B) planta icu4-1 fil-3 que presenta pérdida de la dominancia apical, entrenudos y pedicelos muy largos y fallos de filotaxia. Las imágenes fueron tomadas 60 días después de la siembra. La barra de escala equivale a 1 cm. IV.7.- Estudio de la función del gen ICU4 en la filotaxia. El mutante icu4-1 presenta fallos en la filotaxia (véase el apartado IV.2.2), rasgo que se ve incrementado en algunos de los dobles mutantes obtenidos, casos de los dobles icu4-1 hst-1, icu4-1 rev-1 e icu4-1 fil-3. Para estudiar en qué procesos implicados en la formación del patrón correcto de filotaxia fallan los mutantes con alelos semidominantes de ICU4, se han analizado las interacciones génicas entre ICU4 y otros genes necesarios para la especificación del patrón de filotaxia, como los genes PENNYWISE (PNY) y BREVIPEDICELLUS (BP; Smith y Hake, 2003). PNY codifica una proteína con homeodominio similar al producto BEL1 (proteínas BELL) y BP, también conocido como KNAT1, es un gen KNOX de clase I (Douglas et al., 2002; Venglat et al., 2002; véase el apartado I.6.2.1). Las proteínas KNOX interaccionan con las BELL para unirse con elevada afinidad a una secuencia diana de DNA, actuando como factores de transcripción y regulando así diversos procesos. Los mutantes de pérdida de función en ambos genes presentan anomalías en el patrón de filotaxia, Resultados 96 mostrando una gran variación en la longitud de los entrenudos. Estos defectos se ven fuertemente incrementados en el doble mutante pny-40126 bp-9 (Smith y Hake, 2003). IV.7.1.- Análisis del patrón de filotaxia de los dobles mutantes icu4-1 pny-40126. El alelo pny-40126 contiene una inserción de T-DNA en el primer intrón del gen PNY (At5g02030). Los individuos homocigotos para este alelo presentan una inflorescencia de menor estatura que la de su ancestro silvestre, el ecotipo Col-0, la pérdida parcial de la dominancia apical y una variabilidad notable en la longitud de los entrenudos, lo que conlleva la colocación de varias hojas caulinares o de varias silicuas en el mismo punto (Fig. IV.20 A). Este fenotipo se ve incrementado en el doble mutante icu4-1 pny-40126, en el que la longitud de los entrenudos es mucho más variable que en los mutantes simples, llegándose a formar rosetas aéreas de las que parten varias ramas laterales (Fig. IV.20 B). A B Figura IV.20.- Fenotipo de pny-40126 y del doble mutante icu4-1 pny-40126. (A) Planta pny-40126 y (B) planta icu4-1 pny-40126 que presenta una roseta aérea y una longitud anormal de los entrenudos. Las imágenes fueron tomadas 50 días después de la siembra. La barra de escala equivale a 1 cm. Resultados 97 IV.7.2.- Análisis del patrón de filotaxia de los dobles mutantes icu4-1 bp-1. El alelo bp-1 se obtuvo mediante mutagénesis con EMS en fondo Ler (Koornneef et al., 1983). Los individuos homocigotos para este alelo se caracterizan por una disminución en la estatura de la inflorescencia, fenotipo causado por un menor crecimiento de los entrenudos. Los pedicelos también son más cortos y las flores están orientadas hacia abajo debido a un mayor crecimiento de la región adaxial del pedicelo respecto a la abaxial (Fig. IV.21 A; Douglas et al., 2002). Todos estos fenotipos se ven intensificados en el doble mutante icu4-1 bp-1, que presenta unos entrenudos y unos pedicelos más cortos que los del mutante bp-1, así como una mayor orientación de las flores hacia abajo, de manera que las silicuas formadas tras la polinización adoptan una disposición prácticamente en paralelo con el tallo (Fig. IV.21 B). El doble mutante es también de floración tardía, lo que se traduce en un mayor número de hojas en la roseta basal (Fig. IV.21 B). A B Figura IV.21.- Fenotipo de bp-1 y del doble mutante icu4-1 bp-1. (A) Planta bp-1 y (B) planta icu4-1 bp-1 que presenta un menor crecimiento de los entrenudos y de los pedicelos. Las imágenes fueron tomadas 50 días después de la siembra. La barra de escala equivale a 1 cm. IV.8.- Estudio de la función del gen ICU4 en el desarrollo vascular. Los mutantes icu4-1 presentan un patrón vascular del tallo alterado (véase el apartado IV.3.4). Con el fin de inferir la función del gen ICU4 en la formación del patrón vascular correcto, se ha realizado el análisis de las posibles interacciones génicas entre el alelo icu4-1 y los alelos de genes que intervienen en el establecimiento del patrón vascular y/o el desarrollo correcto de la inflorescencia. Resultados 98 IV.8.1.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes icu4-1 phb-1d. Los individuos homocigotos para el alelo de ganancia de función phb-1d presentan hojas adaxializadas, en muchas de la cuales es posible observar venas con un patrón anfivasal (xilema rodeando al floema) a causa de la adaxialización producida por la expresión ectópica del gen PHB (McConnell y Barton, 1998; McConnell et al., 2001). En las condiciones de cultivo empleadas en nuestro laboratorio, no se ha conseguido que florezca ningún individuo homocigoto phb-1d/phb-1d, por lo que se han obtenido cortes transversales de la parte media del tallo de los individuos heterocigotos PHB/phb-1d. La mayoría de los haces vasculares observados en estos cortes son colaterales, aunque ocasionalmente aparece algún haz total o parcialmente anfivasal (Fig. IV.22 A). En el caso del doble heterocigoto ICU4/icu4-1;PHB/phb-1d, el fenotipo anterior se ve incrementado, ya que todos los haces vasculares adoptan un patrón completa o parcialmente anfivasal (Fig. IV.22 B, C). Este incremento del fenotipo mutante contrasta con el descrito previamente para la adaxialización de los órganos laterales, donde se observaba una reducción del fenotipo del doble heterocigoto con respecto al heterocigoto PHB/phb-1d (véase el apartado IV.6.4). IV.8.2.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes icu4-1 hst-1. Como ya se ha mencionado anteriormente, los mutantes de pérdida de función del gen HST muestran un fenotipo muy pleiotrópico (véase el apartado IV.2), de manera que se han realizado cortes histológicos de los tallos de individuos homocigotos para el alelo nulo hst-1, con el objetivo de comprobar si éstos también presentan un patrón radial alterado. Los tallos de las plantas hst-1 no muestran ninguna anomalía apreciable, con la excepción de que suelen observarse patrones anormales de crecimiento de las células epidérmicas, que son de mayor tamaño que las de los tallos silvestres y, a veces, son de un tamaño similar a las de la corteza (Fig. IV.22 D). A pesar del débil fenotipo mostrado por las plantas hst-1, en los dobles mutantes icu4-1 hst-1 se observa una gran desorganización de todos los tipos celulares que conforman el patrón radial del tallo. Presentan tan sólo dos o tres haces vasculares anfivasales situados en la médula, no siendo posible distinguir la eustela, y en algunas regiones aparecen parches de fibras interfasciculares que no están correctamente lignificadas (Fig. IV.22 E, F). IV.8.3.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes phb-1d hst-1. Con el objetivo de comprobar si hay también sinergia entre las mutaciones semidominantes de PHB y de pérdida de función en HST, se han obtenido plantas PHB/phb-1d;hst-1/hst-1. Éstas presentan una desorganización aún mayor en el patrón Resultados 99 radial del tallo que la observada en los dobles mutantes icu4-1 hst-1. Los tallos muestran un diámetro muy reducido, que se debe al escaso tejido vascular que presentan y a una gran disminución en el número de todos los tipos celulares, y cambios en la morfología de éstos con respecto al silvestre. El tejido vascular no adopta ningún patrón ordenado, estando situado en el centro del tallo rodeado de parénquima medular y sin formar una eustela. Aparecen algunos tipos celulares nunca observados en un tallo silvestre, siendo de destacar las células alargadas de la corteza, justo debajo de la epidermis, y que recuerdan a las células del mesófilo en empalizada característico de las regiones adaxiales de las hojas y los cotiledones (Fig. IV.22 G, H). IV.8.4.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes icu4-1 fil-3. Se han realizado cortes transversales de los tallos de individuos homocigotos para el alelo débil de pérdida de función fil-3. Éstos presentan un fenotipo prácticamente normal, salvo por una reducción en el número de haces vasculares situados en la eustela, que además presentan una cierta distribución espacial irregular (Fig. IV.22 I). Así, mientras que en el silvestre están distribuidos de forma homogénea, siendo aproximadamente igual la separación entre haces vasculares contiguos, en el mutante fil-3 esta separación es más irregular, estando unos haces muy juntos y otros muy separados. El doble mutante icu4-1 fil-3 presenta una separación irregular de los haces vasculares que, asimismo, aparecen en un número menor del observado en los individuos homocigotos icu4-1 (Fig. IV.22 J). IV.8.5.- Análisis del patrón vascular de los dobles mutantes icu4-1 rev. Los individuos homocigotos para los alelos de pérdida de función del gen REV carecen de fibras interfasciculares en algunos fondos genéticos, como Col-0 o No-0, fondos en los que se encuentran los dos alelos de pérdida de función de los que disponemos, rev-6 y rev-1, respectivamente (Fig. IV.22 K; Talbert et al., 1995; Zhong y Ye, 1999; Ratcliffe et al., 2000). El fenotipo de ausencia de las fibras interfasciculares se recupera en los dobles mutantes icu4-1 rev-1 e icu4-1 rev-6, en los que sí se observan estas fibras, aunque con una pared secundaria poco diferenciada, lo que se traduce en un reducido engrosamiento, tal y como sucede en los individuos icu4-1 (Fig. IV.22 L; véase el apartado IV.3.4). Para descartar la posibilidad de que la formación de fibras interfasciculares en los mutantes rev fuera posible en la mezcla de fondos genéticos En-2 y Col-0 o No-0 en los que están los dobles mutantes, hemos cortado tallos de plantas rev obtenidas de las mismas F2 de las que se aislaron los dobles mutantes y que, por tanto, comparten fondos genéticos con éstos, observando Resultados 100 que tampoco se forman las fibras interfasciculares en ellos. Este resultado indica que la mutación de ganancia de función icu4-1 es capaz de recuperar el fenotipo de ausencia de fibras interfasciculares causado por las mutaciones de pérdida de función rev-1 y rev-6. A B C D E F G H I J K L Figura IV.22.- Cortes transversales de tallos de inflorescencia de algunos dobles mutantes que muestran un fenotipo alterado. Tallos del heterocigoto PHB/phb-1d (A) y del doble heterocigoto PHB/phb-1d;ICU4/icu4-1 (B). (C) Haz vascular anfivasal del mismo doble heterocigoto. Tallos del mutante hst-1 (D) y del doble mutante hst-1 icu4-1 (E). (F) Haz vascular anfivasal del doble mutante hst1 icu4-1. Tallo (G) y haz vascular anfivasal (H) de un individuo PHB/phb-1d;hst-1/hst-1. Tallos del mutante fil-3 (I) y del doble mutante icu4-1 fil-3 (J). Secciones transversales que muestran la ausencia de fibras interfasciculares en rev-1 (K), y la presencia de las mismas en el doble mutante icu4-1 rev-1 (L). La barra de escala equivale a 50 µm en (C, F, H), 100 µm en (E, G, J-L) y 250 µm en (A, B, D, I). Resultados 101 IV.8.6.- Análisis del patrón vascular de las plantas transgénicas 35S:ICU4 y 35S:ICU4-G189D. Las plantas transgénicas En-2 que sobreexpresan el cDNA silvestre de ICU4 presentan unos tallos muy gruesos, con un número muy elevado de haces vasculares, que oscila entre 13 y 14, y más filas de fibras interfasciculares que los tallos silvestres. Los haces vasculares de estas plantas transgénicas son, a su vez, de gran tamaño, mostrando capas adicionales de procámbium, xilema y floema (Fig. IV.23 A-C). Las plantas transgénicas En-2 que sobreexpresan el cDNA mutante de icu4-1 presentan haces vasculares con un patrón anfivasal (Fig. IV.23 D, E) y, al igual que ocurre en los homocigotos icu4-1, muestran fibras interfasciculares con defectos en la lignificación (Fig. IV.23 F). Los mutantes de pérdida de función icu4-4 e icu4-5, las plantas que sobreexpresan la construcción de interferencia y los dobles mutantes icu4-5 athb8-6 no muestran fenotipo mutante en el tallo. A D B E C F Figura IV.23.- Cortes transversales de tallos de inflorescencia de plantas transgénicas En-2 que sobreexpresan el cDNA silvestre de ICU4 y el cDNA mutante de icu4-1. (A) Tallo de inflorescencia de una planta En-2 portadora de la construcción 35S:ICU4. (B) Haz vascular de la planta anterior. (C) Fibras interfasciculares de la misma planta. (D) Tallo de inflorescencia de una planta En-2 portadora de la construcción 35S:ICU4-G189D. (E) Haz vascular anfivasal de la misma planta. (F) Fibras interfasciculares, que muestran una lignificación menor en la zona señalada con la flecha. Las barras de escala representan 250 µm (A), 100 µm (B, D) y 50 µm (C, E, F). Resultados 102 IV.8.7.- Efectos de las auxinas y de los inhibidores de su transporte en el desarrollo del patrón vascular. El transporte polar de las auxinas desempeña un papel fundamental en la formación del patrón que adopta el tejido vascular vegetal (Sachs, 1981; 1991; Bennet et al., 1998; Berleth y Mattson, 2000; Ye, 2002; véase el apartado I.6.3.1.2). Con el fin de estudiar la relación existente entre la señalización de auxinas y la función del gen ICU4, se han realizado distintos tratamientos a plantas En-2 e icu4-1 con la auxina sintética NAA o con el inhibidor del transporte de auxinas NPA (véase el apartado III.13). El tratamiento de las plantas En-2 con 1 µM de NAA, la máxima concentración empleada de la auxina sintética, produce una disminución en el número de haces vasculares. Éstos son de mayor tamaño que los controles no tratados, presentando más capas de procámbium y, como consecuencia, una mayor producción de floema y de xilema, especialmente de metaxilema. En algunas zonas localizadas entre los haces vasculares, las fibras interfasciculares se hallan débilmente lignificadas (Fig. IV.24 A, B). Este fenotipo mimetiza el que presentan los homocigotos icu4-1 (véase el apartado IV.3.4). En el caso del mutante icu4-1, este tratamiento intensifica su fenotipo, observándose un número aún menor de haces vasculares, tan sólo 3 o 4, así como un incremento en el número de fibras interfasciculares escasamente engrosadas (Fig. IV.24 C). En los tratamientos con menores concentraciones se observan los mismos efectos, aunque los fenotipos son menos fuertes. Tal y como se ha descrito previamente, el tratamiento de las plantas silvestres con la máxima concentración de NPA utilizada, 40µM, tiene como resultado una gran expansión del tejido vascular, que prácticamente forma un anillo continuo debido al ensanchamiento de los haces vasculares, viéndose muy reducida la región ocupada por el parénquima medular (Gälweiler et al., 1998; Mattsson et al., 1999; Zhong y Ye, 2001). Sin embargo, este tejido vascular está pobremente diferenciado, no siendo posible distinguir claramente el metaxilema (Fig. IV.24 D). En los homocigotos icu4-1, además de esta notable formación de tejido vascular poco diferenciado, se observan algunos haces vasculares anfivasales que, en ocasiones, no se sitúan a la misma altura dentro de la eustela, sino que adoptan posiciones más internas en ésta y más cercanas a la médula, próximas a la zona central del tallo (Fig. IV.24 E, F). Los tratamientos con menores concentraciones de NPA dan lugar a los mismos fenotipos, si bien más débiles que los descritos para la concentración de 40µM. Los fenotipos observados con los tratamientos con NAA o NPA en el silvestre indican que las auxinas participan en la elaboración del patrón radial de los tallos. Las modificaciones que producen estos tratamientos sobre el fenotipo del mutante icu4-1 Resultados 103 sugieren que el efecto de las auxinas sobre el patrón radial de los tallos está modulado por el gen ICU4, de modo que podría existir algún tipo de coordinación entre la señalización por auxinas y la función de los genes HD-ZIP III para el establecimiento de patrones morfogenéticos. A B C D E F Figura IV.24.- Efectos de los tratamientos de plantas En-2 e icu4-1 con NAA 1µM y NPA 40 µM. Cortes transversales de tallos de plantas En-2 (A, B) e icu4-1 (C) tratadas con NAA. Cortes transversales de tallos de plantas En-2 (D) e icu4-1 (E, F) tratadas con NPA. Las barras de escala indican 100 µm. V.- Discusión Discusión 105 V.- Discusión V.1.- icu4-1 e icu4-2 son dos alelos semidominantes del gen ICU4. Los mutantes morfológicos constituyen una herramienta muy valiosa para la identificación de los genes que participan en el desarrollo y para la inferencia de sus funciones. Una de las mayores colecciones disponibles de mutantes morfológicos de Arabidopsis thaliana es la denominada Arabidopsis Information Service Form Mutants, que actualmente está depositada en el NASC (Nottingham Arabidopsis Stock Center). Laibach, en la década de los 30 del siglo pasado, recolectó los primeros especímenes de la colección. Con posterioridad, otros investigadores fueron añadiendo nuevos mutantes, casos de Röbbelen (N300-N420) y de Rattcliffe, Gómez-Campo y Kranz (N430-462; Bürger, 1971; Kranz, 1978). En el laboratorio de J.L. Micol, se ha llevado a cabo un importante estudio de mutantes de esta colección con morfología foliar alterada, los cuales han sido agrupados en 13 clases fenotípicas con el objeto de simplificar el análisis genético (Serrano-Cartagena et al., 1999). Una de estas clases, la denominada Incurvata (Icu), se caracteriza por presentar los márgenes foliares curvados hacia el haz (Berná et al., 1999; Serrano-Cartagena et al., 2000). La clase incluye 22 líneas que pertenecen a 10 grupos de complementación diferentes (Serrano-Cartagena et al., 1999), dos de los cuales, INCURVATA1 (ICU1) e ICU3, corresponden a los genes previamente descritos CURLY LEAF (CLF; Goodrich et al., 1997) y HASTY (HST; Telfer y Poethig, 1998), respectivamente. Todos los alelos mutantes de los genes Icu son recesivos, con la excepción de los dos de ICU4, icu4-1 e icu4-2, que son semidominantes, el de ICU5, que es dominante, y el de ICU6, que se transmite con un patrón de herencia de letalidad recesiva con efecto fenotípico en el heterocigoto (Serrano-Cartagena et al., 2000; Robles, 2000). La semidominancia de los alelos icu4-1 e icu4-2 podría deberse a mutaciones de ganancia de función, a la haploinsuficiencia de mutaciones de pérdida de función o a mutaciones con comportamiento antimorfo (dominante negativo). Para poder interpretar la semidominancia de estos alelos, se llevó a cabo un análisis de dosis (Timpte et al., 1994) en un triploide portador de una única copia del alelo mutante icu41 y dos del silvestre. Si se tratara de mutaciones de ganancia de función, un único alelo mutante debería dar el fenotipo característico del heterocigoto, independientemente del número de alelos silvestres. En el caso de que el locus fuera haploinsuficiente, el fenotipo dependería exclusivamente del número de alelos Discusión 106 funcionales, un mínimo de dos para obtener el fenotipo normal. Finalmente, si los alelos mutantes fueran antimorfos, se debería tener en cuenta que la dominancia de éstos es incompleta, de lo que se deduce que el fenotipo final dependerá tanto del número de alelos mutantes como del número de alelos silvestres. El triploide, de genotipo ICU4/ICU4/icu4-1, mostró una apariencia similar a la del heterocigoto ICU4/icu4-1, lo que es compatible con la hipótesis de que se trata de una mutación de ganancia de función. V.2.- El gen ICU4 codifica un producto con función adaxial. Serrano-Cartagena y colaboradores interpretaron la interacción entre los alelos icu4-1 y hst-5, ambos pertenecientes a la clase fenotípica Icu, como sinérgica por el fenotipo extremo del doble mutante, que presentaba una gran curvatura en las hojas de la roseta basal y un pequeño tamaño (Serrano-Cartagena et al., 2000). Dado que también se había determinado la existencia de un fenotipo anormal en los frutos de las plantas homocigotas para los alelos de pérdida de función de HST (SerranoCartagena et al., 2000; Bollman et al., 2003), nos propusimos estudiar si se observaba asimismo sinergia respecto al fenotipo de los pistilos y los frutos de los dobles mutantes. Para ello, obtuvimos dobles homocigotos para icu4-1 y el alelo nulo hst-1 (Telfer y Poethig, 1998). El aspecto de los pistilos del doble icu4-1 hst-1 es llamativo, ya que presentan una duplicación especular de tejidos adaxiales (placenta con óvulos) en posiciones abaxiales (replum), así como un desarrollo insuficiente del integumento externo de los óvulos maduros, que causa un fenotipo similar al que se observa en los individuos mutados en el gen de naturaleza abaxial INNER NO OUTER (INO; Villanueva et al., 1999), perteneciente a la familia YABBY. Todo ello nos permitió interpretar que las mutaciones icu4-1 y hst-1 tenían un efecto sobre la polaridad adaxial-abaxial (véase el apartado I.6.4), provocando transformaciones adaxiales en los órganos laterales, y que los productos ICU4 y HST podrían estar, por tanto, participando en el establecimiento del eje adaxial-abaxial. De acuerdo con esta interpretación, se ha determinado la función de HST, un gen de gran importancia para la producción de miRNA maduros, en la regulación de la polaridad de los órganos laterales, comprobándose que la pérdida de la función del gen da lugar, en efecto, a transformaciones adaxiales (Bollman et al., 2003; Park et al., 2005). Fenotipos similares al del doble icu4-1 hst-1, de producción de óvulos ectópicos, ya se habían descrito en los dobles mutantes para alelos de pérdida de función en genes miembros de las familias KANADI (KAN1 y KAN2), YABBY (CRC) y Discusión 107 otros genes como PKL/GMN y HST (Eshed et al., 1999; 2001; Bollman et al., 2003). Para obtener datos adicionales acerca de la implicación del gen ICU4 en la adquisición de la polaridad adaxial-abaxial en los órganos laterales, se obtuvieron los dobles mutantes de icu4-1 con los alelos de pérdida de función kan1-2, pkl-1 y crc-1. Los dobles mutantes icu4-1 kan1-2 e icu4-1 pkl-1 mostraron un fenotipo meramente aditivo, mientras que en el doble mutante icu4-1 crc-1 observamos una ligera intensificación del fenotipo causado por la mutación crc-1. Dado que el gen CRC tiene, entre otras funciones en los carpelos, la de conferir identidad abaxial a ciertos tejidos, la interacción observada en el doble icu4-1 crc-1 reforzó nuestra hipótesis acerca de la función adaxial de la proteína ICU4. Respecto a esta serie de resultados, merece la pena resaltar que el alelo nulo kan1-2, al igual que ocurre con icu4-1, no interacciona con pkl-1 y sí lo hace con crc-1 y hst-1 (Eshed et al., 1999; 2001; Bollman et al., 2003), de modo que una posible interpretación a los resultados obtenidos en estos cruzamientos sería que la ganancia de función del gen ICU4, debida al alelo icu4-1, actuara de forma negativa sobre la expresión de algún gen de la familia KANADI, quizá el propio KAN1. Ello permitiría explicar por qué no se produce interacción entre icu4-1 y el alelo kan1-2, y sí la hay entre icu4-1 y los alelos crc-1 y hst-1. Otra prueba adicional sobre la función adaxial de la proteína ICU4 la constituye la interacción sinérgica entre icu4-1 y fil-3, un alelo débil de FILAMENTOUS FLOWER (FIL), otro gen de naturaleza abaxial perteneciente a la familia YABBY (Chen et al., 1999; Sawa et al., 1999a; 1999b). Los alelos fuertes de pérdida de función presentan largos entrenudos en la inflorescencia, debido a defectos en la formación de las flores, y órganos florales filamentosos, a causa de una fuerte adaxialización. El alelo hipomorfo fil-3 causa escasos defectos en la formación de las flores y una débil adaxialización de los órganos florales. Este fenotipo se ve muy incrementado en el doble mutante icu4-1 fil-3, el cual presenta ocasionalmente pérdida de la dominancia apical y, tal y como sucede en los alelos fuertes de FIL, muestra un número de flores muy reducido, una fuerte adaxialización de los órganos florales y pedicelos y entrenudos largos. El aumento en la intensidad del fenotipo, producido por el alelo icu4-1, sobre un alelo que produce transformaciones adaxiales, como fil-3, es un argumento adicional en apoyo de la hipótesis de que el producto ICU4 especifica la formación de estructuras adaxiales. En la superficie abaxial de las hojas de la roseta de los mutantes icu4-1 e icu4-2, cerca del margen foliar, aparecen unas protuberancias similares a las que se observan en las plantas transgénicas que sobreexpresan el gen ASYMMETRIC LEAVES2 (AS2) y en el doble mutante kan1 kan2 (Eshed et al., 2001; Lin et al., 2003). Este fenotipo se ha interpretado como una conversión incompleta de las células Discusión 108 epidérmicas abaxiales en adaxiales, lo que resulta en la formación de parches de células con identidad adaxial adyacentes a células con identidad abaxial. Las protuberancias podrían representar márgenes ectópicos que se forman entre los parches de células adaxiales y abaxiales, en relación con un modelo que explica la expansión lateral de la hoja en función de la yuxtaposición en el margen foliar de un dominio adaxial y otro abaxial (Waites y Hudson, 1995). Este dato también sugiere que los alelos icu4-1 e icu4-2 causan transformaciones adaxiales. V.3.- El gen ICU4 codifica el factor de transcripción ATHB15, perteneciente a la familia HD-ZIP III. La polaridad adaxial-abaxial, una propiedad de los órganos laterales de las plantas, como las hojas y los órganos florales, se admite actualmente que se adquiere a partir de una señal adaxializante que emana del meristemo apical (Sussex, 1954). Los dominios adaxial y abaxial de los primordios de los órganos laterales están definidos por la actividad de los factores adaxializantes, principalmente los factores de transcripción pertenecientes a la clase III de la familia de genes HD-ZIP (HD-ZIP III), y por los factores abaxializantes de las familias KANADI y YABBY (Eshed et al., 1999; Siegfried et al., 1999; Kerstetter et al., 2001; Kumaran et al., 2002; Emery et al., 2003). La cartografía de baja resolución, llevada a cabo en el laboratorio de J.L. Micol, permitió acotar la posición del gen ICU4 a una amplia región del cromosoma 1 (Serrano-Cartagena et al., 2000). En esta región se localizaba el gen ATHB15, también llamado recientemente CORONA (CNA, Green et al., 2005; Prigge et al., 2005), perteneciente a la familia HD-ZIP III. La familia consta de varios miembros de los que se ha publicado la existencia de mutaciones semidominantes responsables de transformaciones adaxiales (McConnell y Barton, 1998; McConell et al., 2001; Emery et al., 2003; Zhong y Ye, 2004). Por lo tanto, el gen ATHB15 se convirtió en nuestro principal candidato. Inicialmente, determinamos el ligamiento completo entre el locus alterado en el mutante icu4-1 y un marcador localizado en el mismo PAC que ATHB15, lo que sugería que, en efecto, podía ser éste el gen afectado en los mutantes icu4-1 e icu4-2. La secuenciación del gen en el ecotipo En-2 y en las plantas icu4-1 e icu4-2 nos permitió detectar, en ambas, el mismo tipo de mutación dentro de ATHB15. Al mismo tiempo, mediante cartografía genética y secuenciación, pudimos descartar la implicación del gen KAN2, también localizado en el mismo intervalo, en el fenotipo mutante. Los resultados expuestos apoyan de forma contundente, aunque no concluyente, que las anomalías observadas en los mutantes icu4-1 e icu4-2 se deben a la mutación observada en el gen ATHB15 Discusión 109 Para demostrar de un modo definitivo la implicación de ATHB15 en el fenotipo Icu4, no tendría sentido llevar a cabo un análisis de complementación en los mutantes con un transgén que contuviera el alelo silvestre, ya que al tratarse icu4-1 e icu4-2 de alelos de ganancia de función nunca se obtendría el rescate fenotípico. Por el contrario, el cDNA del alelo icu4-1 fusionado al promotor constitutivo 35S debería causar fenotipo Icu en un fondo silvestre En-2. Efectivamente, las plantas transformantes que contenían el transgén para el cDNA mutante presentaron diversos grados de adaxialización de los órganos laterales. Este resultado demuestra que la sobreexpresión del alelo mutante da lugar a transformaciones de tipo adaxial y resulta un apoyo muy fuerte a la hipótesis de que ICU4 es el gen ATHB15. Además, al ser icu4-1 un alelo de ganancia de función, el resultado supone una demostración adicional de que el producto ICU4, el factor de transcripción ATHB15, tiene una función adaxial. No obstante, el fenotipo mostrado por las plantas transgénicas fue más severo que el de los homocigotos icu4-1 e icu4-2, lo que tiene dos interpretaciones no excluyentes: a) el promotor 35S causa una transcripción generalizada de los genes que se encuentran bajo su control, mientras que la transcripción del gen ICU4 endógeno está sujeta a la actividad de su promotor, por lo que se halla restringida a órganos y tejidos concretos; b) el promotor del gen ICU4 se expresa en ciertos tejidos con menor intensidad que la del promotor 35S. La prueba definitiva de que ICU4 y ATHB15 son el mismo gen fue la obtención de transformantes icu4-1 que contenían una construcción de interferencia para ATHB15. La supresión completa del fenotipo mutante en estos transformantes tan sólo puede explicarse si ICU4 y ATHB15 son el mismo gen, ya que una construcción diseñada para interferir con los transcritos endógenos del gen ATHB15 es capaz de eliminar el fenotipo alterado debido a un alelo mutante de ganancia de función en el gen ICU4. El conjunto de los resultados evidencian, de forma inequívoca, que icu4-1 e icu4-2 son alelos de ganancia de función del gen ICU4/ATHB15/CNA, el cual codifica un producto con función adaxial. La recientemente descrita mutación cna-1, inducida por EMS, se ha identificado en una búsqueda de mutaciones que aumentaban el fenotipo del mutante clavata1-1 (clv1-1). Se ha interpretado que se trata de un alelo dominante negativo del gen ATHB15, ya que presenta dominancia incompleta cuando se combina con alelos fuertes clv. Los individuos homocigotos para la mutación muestran una morfología silvestre, salvo por un ligero aumento en el tamaño del meristemo apical en estadios tempranos del desarrollo de la roseta. Además, la mutación afecta a un dominio carboxilo diferente al alterado en los mutantes icu4-1 e icu4-2 (Green et al., 2005). El distinto comportamiento genético de éstos y del mutante cna-1 constituye un apoyo Discusión 110 adicional a que los alelos icu4-1 e icu4-2 no son dominantes negativos, y está de acuerdo con el hecho de que se trata de alelos de ganancia de función. V.4.- Una mutación puntual en el sitio de unión del miRNA165/166 causa la sobreexpresión del gen ICU4. Todas las mutaciones semidominantes descritas hasta la fecha en los miembros de la familia HD-ZIP III se sitúan en la región que codifica el dominio START de sus productos proteicos, un dominio de unión a esteroles y lípidos (Ponting y Aravind, 1999). Este dato llevó a la especulación de que los fenotipos de ganancia de función observados podrían deberse a la alteración en la percepción por el dominio START de un ligando de tipo lipídico, que sería la hipotética señal adaxializante que emanaba del meristemo apical (McConnell et al., 2001). El descubrimiento en esta región del gen de una secuencia complementaria a dos miRNA que difieren en un solo nucleótido, los miRNA165 y miRNA166 (Rhoades et al., 2002), hizo más factible la explicación de que los fenotipos alterados generados por dichas mutaciones pudieran deberse a la alteración de un proceso de regulación post-transcripcional de los genes HD-ZIP III mediado por interferencia con miRNA (Reinhart et al., 2002; Rhoades et al., 2002; Tang et al., 2003). No obstante, aún no es posible descartar por completo que haya también una activación de los productos proteicos a través de la unión de un ligando de naturaleza lipídica al dominio START, hipótesis que ha seguido contemplándose en algunos modelos de reciente publicación, junto a la regulación por miRNA (Emery et al., 2003; Fig. I.11). Los alelos icu4-1 e icu4-2 son portadores de exactamente la misma mutación puntual, situada en la diana del miRNA165/166, que varios alelos semidominantes de PHABULOSA (PHB) y PHAVOLUTA (PHV, McConnell et al., 2001). Esta diana del miRNA165/166 también está mutada en otros alelos de ganancia de función de miembros de la familia HD-ZIP III, como REVOLUTA (REV) y rld1 (Emery et al., 2003; Juarez et al., 2004a; Zhong y Ye, 2004). Por tanto, la alteración del proceso de regulación post-transcripcional, debida al desapareamiento entre el miRNA y el mRNA de ICU4 provocado por la mutación, nos proporciona una explicación molecular para la ganancia de función de los alelos icu4-1 e icu4-2. Recientemente, se ha demostrado la ruptura in vivo de los transcritos del gen ATHB15 mediada por el miRNA166 (Kim et al., 2005). En el laboratorio de J.L. Micol, se han llevado a cabo experimentos de RTPCR cuantitativa que han permitido comprobar que la alteración producida por los alelos de ganancia de función resultaba en una mayor acumulación de transcritos del Discusión 111 gen ICU4. Todos los tejidos estudiados mostraron mayor cantidad de transcritos en el mutante icu4-1 que en el silvestre En-2. Además, los órganos que exhibían un fenotipo más evidente, como las hojas y los tallos, presentaron los mayores incrementos en el mRNA del gen. Sin poder descartar por completo la existencia de regulación a través del dominio proteico START, el conjunto de resultados se ajusta a que los alelos icu41 e icu4-2 son semidominantes y de ganancia de función debido a la eliminación, total o parcial, del mecanismo de regulación post-transcripcional del gen ICU4 mediado por miRNA. Este comportamiento de los alelos semidominantes permite explicar por qué los transformantes que sobreexpresan el cDNA mutante, que no está sujeto a la regulación post-transcripcional, tienen un fenotipo distinto al de los transformantes que sobreexpresan el cDNA silvestre, cuyo mensajero sí posee una diana activa para los miRNA. La formación de hojas curvadas hacia el haz quedaría explicada por la sobreexpresión del gen en los mutantes, lo que llevaría a una gran acumulación del producto ICU4, de naturaleza adaxial, que causaría la curvatura. El fenotipo producido por los alelos icu4-1 e icu4-2 es termosensible, siendo más acusado a 25ºC que a 20ºC, tal y como sucede con el alelo semidominante phb-1d (McConnell y Barton, 1998), y muy pleiotrópico, ya que afecta no sólo al establecimiento del eje adaxialabaxial, sino también al cambio de fase, a la filotaxia, al patrón radial de los tallos y a la embriogénesis. V.5.- Los alelos de pérdida de función de ICU4 no muestran fenotipo mutante. Hemos identificado dos alelos de pérdida de función del gen ICU4, portadores de inserciones de T-DNA, ninguno de los cuales causa fenotipo mutante en homocigosis. Esto, tal y como se ha publicado recientemente, puede ser atribuible a la redundancia funcional existente entre los miembros de la familia HD-ZIP III (Emery et al., 2003; Prigge et al., 2005). En consonancia con este dato, ninguna de las líneas En2 transgénicas portadoras de la construcción de interferencia y, por tanto, susceptibles de carecer de la función del gen ICU4 presentó fenotipo mutante. Estos resultados están de acuerdo con la ausencia de fenotipo alterado en las plantas homocigotas para el alelo nulo cna-2, que contiene una inserción de T-DNA en el gen ATHB15 (Prigge et al., 2005). Nuestros resultados y los de Prigge y colaboradores (2005) entran en franca contradicción con los de Kim y colaboradores (2005), que recientemente han publicado fenotipos mutantes muy severos, incluyendo la letalidad en algunas líneas, causados por una construcción antisentido del gen ATHB15. Discusión 112 Aunque ATHB8 es el parálogo más cercano a ICU4, los dobles mutantes para alelos de pérdida de función de ambos genes tampoco muestran ninguna alteración en su fenotipo. Este resultado, que también está de acuerdo con lo publicado por Prigge y colaboradores (2005), sugiere que ICU4 podría ser redundante con genes que no pertenecen a su clado, independientemente de que lo sea o no con el propio ATHB8. Los fenotipos de dobles, triples y cuádruples mutantes afectados en diversos genes HD-ZIP III indican que ICU4 presenta redundancia funcional con PHB, PHV y REV durante la embriogénesis, de manera que diversos mutantes múltiples carecen de meristemo apical, y que hay redundancia de ICU4, PHB y PHV en la homeostasis del meristemo apical, ya que triples mutantes que carecen de la función de los tres genes presentan un meristemo apical de gran tamaño, tallos fasciados y anomalías en los haces vasculares (Prigge et al., 2005). Sorprendentemente, los genes ICU4 y ATHB8 mostraron escasa redundancia funcional en estos experimentos, con la salvedad de la supresión de ciertos fenotipos causados por la ausencia de la función de REV cuando se añadían mutaciones de pérdida de función para los dos genes (Prigge et al., 2005). En todo caso, estos experimentos aportan la visión de un comportamiento complejo de los genes HD-ZIP III, tal que, dependiendo del órgano en estudio, se observan relaciones de sinergia o de antagonismo entre ellos (Prigge et al., 2005). V.6.- ICU4 participa en la formación del patrón radial del tallo. V.6.1.- ICU4 promueve la diferenciación de los tejidos vasculares. Nuestros resultados indican que el gen ICU4 promueve el desarrollo vascular, fundamentalmente a través de la estimulación de la proliferación de las células del procámbium. Este dato coincide con un trabajo realizado sobre el gen de Arabidopsis y su ortólogo en Zinnia elegans, ZeHB-13, en el que se demostraba que los dos se expresan en las células del procámbium, y se sugería que desempeñan una función en la diferenciación o el mantenimiento de estas células (Ohashi-Ito y Fukuda, 2003). También se han publicado argumentaciones completamente contradictorias con la anterior, sugiriéndose que su papel sería el de regular negativamente la producción de los tejidos vasculares, de tal forma que el gen estaría implicado en el mantenimiento del estado indiferenciado de las células del procámbium (Kim et al., 2005). Sin embargo, como esta hipótesis surge de la interpretación del fenotipo de las plantas transgénicas para una construcción antisentido del gen (véase el apartado V.5; Kim et al., 2005), cuyo aspecto debe depender de factores adicionales a la mera ausencia de Discusión 113 la función de ICU4, consideramos que el conjunto de datos a favor de nuestra hipótesis es más contundente. La sobreexpresión del gen en el mutante icu4-1 causa que éste produzca más del doble de procámbium que el silvestre y, en consecuencia, que presente más floema y xilema. Por lo tanto, el área total de los haces vasculares en las secciones de los tallos es claramente mayor en el mutante, en apoyo de que ICU4 promueve el desarrollo vascular. No obstante, la cuantificación precisa de un elemento de patrón, como es en este caso la cantidad de haz vascular por sección de tallo, debería ser referida al área o volumen del campo de desarrollo en el que dicho elemento de patrón se ha diferenciado. Por ello, obtuvimos la media de la superficie total de haces vasculares por tallo en relación con la media de las áreas de los tallos, encontrando que este valor es un 25% mayor en el mutante, lo que demuestra que éste produce más tejido vascular que el silvestre. Como los homocigotos icu4-1 presentan las alteraciones en el patrón vascular con penetrancia incompleta, probablemente debido a la termosensibilidad del alelo mutante, se observa que las diferencias en la producción de tejido vascular entre el mutante y el silvestre son incluso mayores cuando sólo se tienen en cuenta los tallos de icu4-1 con seis o menos haces vasculares. V.6.2.- ICU4 participa en la formación del patrón en la eustela. La mayoría de los cortes histológicos realizados en las inflorescencias principales de las plantas del ecotipo En-2 presentaron una eustela con 8 haces vasculares, un número muy común también en otros ecotipos (Ye, 2002; Kang et al., 2003). Este número se redujo a 5 o 6 en algunas inflorescencias del mutante icu4-1, un fenotipo que apareció con una baja penetrancia, de alrededor del 20%. A pesar de la penetrancia incompleta, varios argumentos apoyan que se trata, en efecto, de una alteración en el número de un elemento de patrón en el tallo: a) Las inflorescencias de En-2 nunca muestran menos de 7 haces vasculares; b) el fenotipo se observa siempre, e incluso aumenta en diversas combinaciones dobles mutantes que incluyen el alelo icu4-1, como por ejemplo, en las plantas icu4-1 fil-3 e icu4-1 pny-40126, y c) la reducción en el número de haces vasculares tras tratamiento con la hormona sintética NAA es mayor en el mutante que en el silvestre. Se observa un incremento en el número de haces vasculares en los mutantes que poseen meristemos grandes y tallos muy gruesos, tal y como ocurre en los mutantes clv (Turner y Sieburth, 2002; Green et al., 2005). Así mismo, un meristemo de pequeño tamaño y/o un tallo muy fino podrían ser la causa de que hubiera una reducción en el número de haces vasculares, como sucede en el mutante vein Discusión 114 patterning1 (vep1), que muestra una disminución tanto del número de haces como del área del tallo (Jun et al., 2002). Sin embargo, las variaciones en el número de haces vasculares en los tallos de icu4-1 no parecen deberse a una disminución en el grosor de los tallos, ya que los valores medios para las áreas de los tallos de las plantas mutantes y En-2 son muy similares. Esto sugiere que el fenotipo de icu4-1 no es una mera consecuencia de la reducción en el número de células meristemáticas fundadoras, sino un defecto de formación de patrón que afecta específicamente a la producción o al mantenimiento de los haces vasculares. Teniendo en cuenta que el tratamiento de las plantas con inhibidores del transporte polar de auxinas da lugar a tallos con más tejidos vasculares (Mattson et al., 1999) y que los mutantes auxin resistant1 (axr1), con una respuesta reducida a auxinas, tienen un número incrementado de haces con células pobremente diferenciadas (Lincoln et al., 1990), una posible hipótesis para explicar la formación de un bajo número de haces vasculares muy gruesos en icu4-1 podría ser que el mutante tuviera aumentada alguna de las vías implicadas en la señalización por auxina, ya fuera la percepción o su flujo polar. De hecho, una de las observaciones realizadas en el laboratorio de J.L. Micol ha sido que el mutante icu4-1 sobreexpresa en algo más de 5 veces el gen PINOID (PID), que codifica una quinasa de serina/treonina implicada en la regulación positiva del flujo polar de auxina (Christensen et al., 2000; Benjamins et al., 2001). Además, el mutante polycotyledon de tomate, que presenta un aumento en el flujo polar de auxina, comparte muchos fenotipos con el mutante icu4-1, como la variación en el número de cotiledones, la disminución de la fertilidad de los estambres, el retraso en el tiempo de floración o la formación de un número algo reducido de haces vasculares muy gruesos en los hipocotilos (Al-Hammadi et al., 2003). Resulta, por tanto, factible que algunos de los fenotipos que observamos en el mutante icu4-1 puedan deberse a un aumento del flujo polar de auxina. Así, dado que, según la hipótesis de la canalización, los haces vasculares se inducen a lo largo de las vías principales de flujo de auxina (Sachs, 1981; 1991), la formación de haces vasculares gruesos en el mutante icu4-1 daría lugar a una tasa de flujo muy elevada en cada uno de los haces. Esto produciría la rápida eliminación de las auxinas en los tejidos circundantes a cada haz en formación, que los incapacitaría para dar lugar a la producción de más haces vasculares, lo que resultaría en una disminución de su número. De manera alternativa, si hubiera un mecanismo de inhibición lateral mediante el que un haz en formación impidiera la inducción de haces vasculares adicionales en su proximidad, como sugiere la existencia del mutante continuous vascular ring1 (cov1, Parker et al., 2003), los gruesos haces vasculares de icu4-1 Discusión 115 podrían estar produciendo una señal inhibidora más fuerte que diera lugar a una disminución en el número de los haces. V.6.3.- ICU4 participa en la formación del patrón interno de los haces vasculares. Algunas publicaciones recientes han mostrado la relación entre el eje centralperiférico de los órganos con simetría radial, como los tallos, y el eje adaxial-abaxial de los órganos laterales. Ambos ejes se estarían estableciendo mediante un mecanismo común que actuaría en los órganos que derivan tanto del meristemo apical como de los meristemos vasculares (Tasaka, 2001; Emery et al., 2003). Los alelos mutantes de ganancia de función en los genes HD-ZIP III descritos hasta el momento dan lugar a un fenotipo considerado de pérdida de polaridad en los haces vasculares. Éstos, en las estirpes silvestres de Arabidopsis, tienen un patrón colateral, es decir, hay una zona del haz con xilema y, en paralelo a ésta y separada de ella por procámbium, otra región con floema. Así, en las hojas, el xilema ocupa una posición adaxial y el floema una posición abaxial, mientras que en los tallos, el xilema se sitúa hacia el centro y el floema hacia la periferia (véase el apartado I.6.3.1.1; Ye et al., 2002). El alelo semidominante phb-1d produce, en ocasiones, la transformación en las hojas radializadas (adaxializadas) del patrón colateral en otro anfivasal (McConnell y Barton, 1998), esto es, el floema ocupa una posición central en el haz y está rodeado por xilema (véase el apartado I.6.3.1.1; Ye et al., 2002). Aunque este fenotipo no se ha podido observar en los tallos, debido a que las plantas homocigotas para phb-1d no llegan a producir la transición floral, hemos podido comprobar que las plantas heterocigotas para este alelo dan lugar a algunos haces vasculares con un patrón parcialmente anfivasal. La formación de haces anfivasales es más acusada, tanto en las hojas como en los tallos, en las plantas portadoras de alelos semidominantes del gen REV (Zhong et al., 1999; Emery et al., 2003; Zhong y Ye, 2004). Consistente con estos resultados, la pérdida de función de tres genes de la familia KANADI, en el triple mutante kan1-2 kan2-1 kan3-1, también determina la formación de haces vasculares anfivasales (Emery et al., 2003). Por lo tanto, al igual que ocurre con la polaridad adaxial-abaxial de los órganos laterales, la polaridad colateral de los haces parece estar definida por las actividades antagónicas de los genes HD-ZIP III y los genes KANADI. El alelo icu4-1, a diferencia de los anteriores, nunca da lugar a haces vasculares anfivasales, ni en heterocigosis ni en homocigosis. No obstante, las plantas transgénicas que sobeexpresan el cDNA mutante icu4-1, cuando florecen, producen tallos que contienen haces con un patrón anfivasal bastante acusado. Es decir, estas plantas no sólo pueden presentar órganos laterales muy adaxializados, sino que Discusión 116 también muestran la radialización parcial de los haces vasculares. El resultado indica que el producto ICU4 posee función tanto para la especificación de la identidad adaxial en los órganos laterales, como para la especificación del eje central-periférico en los haces vasculares. Una corroboración adicional de esta interpretación la constituye el fenotipo sinérgico observado en los haces del doble heterocigoto para los alelos icu4-1 y phb-1d, con un patrón claramente anfivasal, que indica que el gen ICU4, tal y como se ha interpretado para PHB y REV, estaría participando en el establecimiento del patrón de tejidos en los haces vasculares (Emery et al., 2003; Dinneny y Yanofsky, 2004; Zhong y Ye, 2004). Un resultado interesante a tener en cuenta es que las plantas transgénicas que sobreexpresan el cDNA silvestre de ICU4, aunque presentan un mayor número de haces vasculares, posiblemente debido al gran grosor de sus tallos, aquéllos siguen manteniendo el patrón colateral. Puesto que las características del promotor empleado y de las construcciones realizadas son idénticas en los dos tipos de plantas transgénicas, con la salvedad de que unas sobreexpresan el cDNA silvestre y otras el mutante, la diferencia de patrón vascular debe estar causada por la alteración en el mecanismo de regulación por miRNA. Estos resultados sugieren que hay un mecanismo de información posicional, mediado por la regulación de los miRNA sobre los genes HD-ZIP III, que está implicado en el establecimiento del patrón colateral característico de los haces vasculares de Arabidopsis (Emery et al., 2003; Zhong y Ye, 2004). V.6.4.- La participación de ICU4 en la formación del patrón radial del tallo incluye también a tejidos no vasculares. La intervención de los genes HD-ZIP III en el establecimiento del patrón radial del tallo se ha limitado, hasta el momento, a su función sobre el patrón y la posición de los haces vasculares (Emery et al., 2003; Dinneny y Yanofsky, 2004; Zhong y Ye, 2004), no habiéndose descrito alteración alguna de otros tipos celulares, ni en los mutantes simples ni en los dobles mutantes, con la salvedad de las fibras interfasciculares en las plantas rev. En un apartado anterior, se ha comentado el fenotipo sinérgico de los dobles mutantes icu4-1 hst-1, que producen fuertes transformaciones adaxiales en estructuras de naturaleza abaxial (véase el apartado V.2). Cuando observamos cortes histológicos transversales de los tallos de estos dobles mutantes, comprobamos que el patrón radial estaba fuertemente desorganizado. Los haces vasculares habían disminuido extraordinariamente en su número y no se organizaban claramente en un anillo o eustela, sino que se encontraban inmersos entre las células parenquimatosas de la médula, y además, Discusión 117 mostraban un patrón completamente anfivasal. Por otro lado, no sólo estaban afectados los haces vasculares, sino también otras capas celulares de las que forman el patrón radial del tallo. Así, la endodermis desaparecía, y disminuía el número de capas celulares en la corteza, que presentaba algunas células grandes, de tamaño similar a las de la médula. La alteración de este patrón radial fue todavía más severa en las plantas homocigotas para el alelo hst-1 y heterocigotas para phb-1d. En éstas, algunos haces vasculares mostraron un patrón anfivasal, mientras que otros estaban completamente desorganizados, no siendo posible reconocer ningún patrón obvio de disposición del floema y el xilema. Los haces, además, ocupaban una posición central en el tallo, desplazando a la médula hacia una situación periférica. No se formaron fibras interfasciculares, también desaparecía la endodermis, y las células de la epidermis y de la corteza adquirieron un gran tamaño. De hecho, el patrón de estas dos capas celulares presentaba un gran parecido con las capas de epidermis y de parénquima en empalizada características de la superficie adaxial de las hojas y los cotiledones. Dado que, según la teoría del teloma, las hojas han evolucionado a partir de los tallos (Zimmerman, 1952), podría especularse con que en este paso evolutivo hubieran podido estar implicadas determinadas variaciones en los patrones de expresión de los genes HD-ZIP III. En cualquier caso, para explicar los cambios del patrón radial observados en los tallos anteriores, hay que tener en cuenta el efecto muy pleotrópico de la mutación hst1 (Bollman et al., 2003), que estaría afectando a la expresión no sólo de los genes HDZIP III, sino también a la de otros muchos genes regulados por miRNA, como ocurre, por ejemplo, con el gen SCARECROW (SCR), que está implicado en la formación del patrón radial en la raíz y el tallo (Wysocka-Diller et al., 2000). No obstante, los fenotipos descritos tan sólo se observan cuando se combina el alelo hst-1 con mutaciones de ganancia de función en los genes HD-ZIP III, como icu4-1 y phb-1d, lo cual indica que estos genes deben estar actuando en la regulación de todos, o la gran mayoría, de los elementos que componen el patrón radial del tallo, y no sólo en la formación del patrón en los haces vasculares. Además, dado que, entre los genes regulados por miRNA, los HD-ZIP III son los únicos de los que se ha descrito su implicación en el patrón colateral de los haces, creemos bastante probable que los cambios observados hacia una organización anfivasal o a la desorganización completa del haz se deban a una desrepresión generalizada de genes HD-ZIP III en el fondo hst-1, además de la propia desregulación producida por la mutación icu4-1 o la phb1d. Discusión 118 En resumen, la alteración general del patrón radial del tallo causada por la combinación de las mutaciones semidominantes icu4-1 o phb-1d con el alelo hst-1 indica que se requiere un control preciso de la expresión de los genes de la familia HD-ZIP III, no sólo para la correcta localización de los haces vasculares en la eustela y la formación de un patrón colateral en éstos, sino también para la organización del resto de los elementos que componen el patrón radial de los tallos. Esta interpretación, junto al fenotipo de transformación anfivasal observado en los dobles heterocigotos icu4-1 phb-1d, sugiere que los patrones de expresión de los distintos genes HD-ZIP III y la localización precisa de sus productos proteicos confieren información posicional en los tallos, necesaria para establecer el patrón correcto de tejidos dentro de los haces vasculares y el conjunto del patrón radial de los tallos. V.6.5.- Relación entre el flujo polar de auxinas y la función del gen ICU4 en la formación del patrón radial del tallo. Diferentes ensayos fisiológicos han puesto de manifiesto la importancia de las auxinas en la diferenciación del tejido vascular (Jacobs, 1952; Young, 1953; Aloni, 1987). De hecho, las auxinas tienen una función determinante no sólo en la diferenciación de las células vasculares, sino también en la producción de haces vasculares continuos que, finalmente, acabarán organizándose en un patrón definido (Sachs, 1981; 1991; Berleth et al., 2000). Además, la alteración del proceso de señalización de las auxinas, como ocurre cuando se inhibe el flujo polar de auxina, afecta severamente a la diferenciación del tejido vascular y a la formación del patrón correcto (Mattson et al., 1999; 2003). Para verificar una posible interacción entre ICU4 y la vía de señalización de las auxinas en la formación del patrón radial del tallo, llevamos a cabo tratamientos con un inhibidor del transporte polar, el NPA, y con una auxina sintética, el NAA, tanto en las plantas mutantes como en las silvestres. Los tratamientos con NPA en las plantas En-2 producen el fenotipo descrito previamente para otros ecotipos (Gälweiler et al., 1998; Mattson et al., 1999), consistente en una gran proliferación del tejido vascular, que prácticamente forma un anillo continuo. Este resultado está de acuerdo con la hipótesis de la canalización de Sachs (1981; 1991; véase el apartado I.6.3.1.2), que afirma que la diferenciación vascular ocurre a lo largo de las rutas de flujo preferencial de auxina, formadas al aumentar la conductividad para esta hormona vegetal en las células que la transportan, mediante un flujo de retroalimentación positiva. La gran amplitud de las zonas en las que se diferencia el tejido vascular en las plantas tratadas con NPA se debe a que, al disminuir el flujo polar, la auxina se acumula y se transporta lateralmente. Sorprendentemente, cuando se trataron las plantas icu4-1 con NPA, Discusión 119 además de la proliferación de tejido vascular observada en el silvestre, muchos de los haces vasculares mostraron un patrón anfivasal y se situaron más internamente en el tallo, un fenotipo que guarda una cierta similitud al causado por avb1, un alelo de ganancia de función de REV (Zhong et al., 1999; Zhong y Ye, 2004). Este resultado indica una participación de la auxina tanto en la formación de los haces vasculares como en el patrón que éstos adoptan, procesos en los que también participan los genes HD-ZIP III. Los tratamientos con NAA en las plantas silvestres produjeron fenocopias del patrón vascular observado en los mutantes icu4-1, de manera que aquéllas mostraron un menor número de haces vasculares de mayor tamaño, mientras que el mismo tratamiento en las plantas icu4-1 acentuó aún más el fenotipo mutante. Una posible explicación para este resultado sería que, al incrementar la concentración de auxina, se produciría un incremento en la capacidad de las células para su transporte polar, como dicta la hipótesis de la canalización de Sachs (1981; 1991; véase el apartado I.6.3.1.2). Como resultado, acabarían formándose unos haces vasculares de gran tamaño que inhibirían la formación de otros haces en sus inmediaciones. En este contexto, consideramos poco probable la existencia de un fenómeno de inhibición lateral debido a la eliminación de las auxinas en los tejidos circundantes al haz vascular en formación, ya que en las plantas tratadas con NAA debe haber un exceso de auxina. Por ello, además de la canalización, nuestros resultados apoyan la existencia de un proceso de inhibición lateral activo debido a una sustancia inhibidora, aún por descubrir, tal y como propone la hipótesis de la difusión-reacción (véase el apartado I.6.3.1.2; Koch y Meinhardt, 1994), que está apoyada por diversos resultados experimentales (Koizumi et al., 2000; Parker et al., 2003). De hecho, no existe una gran contradicción entre la hipótesis de la canalización y la de difusión-reacción. Esta última es una hipótesis general para explicar la formación de patrones en numerosos modelos tanto animales como vegetales, siendo uno de éstos el patrón vascular de las plantas. La hipótesis de difusión-reacción puede asumir sin problemas el transporte polar de auxinas, como parte del proceso autocatalítico de una sustancia inductora, así como la existencia de una sustancia inhibidora o un proceso de inhibición causado por la simple eliminación de la sustancia inductora de los tejidos cercanos (Meinhardt, 1982; Meinhardt y Gierer, 2000). Los resultados discutidos en este apartado indican que los fenotipos de los tallos del silvestre y de icu4-1 dependen de la señal de auxina, y sugieren la existencia de una colaboración entre las auxinas y los genes pertenecientes a la familia HD-ZIP III para el establecimiento del patrón radial del tallo. Quedaría aún por responder la pregunta de cómo se produciría dicha colaboración. Una posibilidad sería que la Discusión 120 expresión de los genes HD-ZIP III estuviera regulada por auxina. Sin embargo, el único gen de la familia que incrementa rápidamente su transcripción en respuesta a esta fitohormona es ATHB8 (Baima et al., 1995; Mattson et al., 2003; Kim et al., 2005). Esto no descartaría una posible regulación de los miRNA165/166 por auxina, los cuales, a su vez, actuarían sobre la expresión de los genes HD-ZIP III. No obstante, al menos el miRNA166a tampoco parece responder a tratamientos con auxina (Kim et al., 2005). Otra alternativa sería que los patrones de expresión de los genes HD-ZIP III, quizá con la excepción de ATHB8, no fueran dependientes de auxina, sino que sus productos estuvieran modulando de algún modo la vía de señalización de esta hormona vegetal. En este sentido, conviene resaltar la sobreexpresión que se produce del gen PID en el mutante icu4-1 (véase el apartado V.7), que indica que ICU4 estaría regulando positivamente la expresión de dicho gen, y la gran reducción en la transcripción de los genes que codifican los transportadores de auxina PIN3 y PIN4 en los mutantes carentes de la función de REV, los cuales presentan también una severa reducción del flujo polar de auxina (Zhong y Ye, 2001). Además, cuando se analiza el patrón de expresión de ICU4 en los tallos, se observa que el mRNA del gen se detecta por toda la zona del meristemo que va a dar lugar al procámbium. Inmediatamente por debajo del meristemo, el gen se expresa con intensidad en los grupos de células que van a formar parte de los haces y algo menos por toda la médula; y en zonas inferiores del tallo, tan sólo se detectan sus transcritos en los haces vasculares. Con ligeras diferencias, que radican en si se expresan o no en la médula y la intensidad con la que lo hacen en el meristemo, los patrones de expresión de los demás genes HD-ZIP III en los tallos son relativamente similares (Prigge et al., 2005). Basándonos, en todo este conjunto de resultados, que abarca los fenotipos con los tratamientos con NPA y NAA, la expresión independiente de auxina de la mayoría de los genes HD-ZIP III, la posible regulación positiva de genes que participan en el transporte polar de auxinas por parte de los genes HD-ZIP III y los patrones de expresión de éstos, proponemos una hipótesis en la que los productos HD-ZIP III, y posiblemente los productos de genes de naturaleza abaxial, que actuarían de forma antagónica, estarían formando un prepatrón sobre el cual se canalizaría el flujo polar de auxinas, de manera que la formación de un haz vascular y la intensidad del flujo a través de él dependería de la concentración de auxina, que estaría actuando como morfógeno, y de los productos HD-ZIP III, que determinarían la respuesta final de las células. Por tanto, según esta hipótesis, el patrón radial del tallo y la organización interna de los haces vasculares dependería tanto de las auxinas como de la información posicional conferida por los productos HD-ZIP III, que modularían Discusión 121 determinados aspectos de la vía de señalización de auxinas, como la capacidad del tejido para el transporte polar de esta hormona vegetal. Los haces vasculares anfivasales dispuestos en una atactostela, es decir, los haces vasculares que están dispersos por el tallo y no forman un anillo o eustela, son característicos de muchas especies de monocotiledóneas, mientras que los haces colaterales organizados en una eustela son más comunes en las dicotiledóneas (Ye, 2002). Se cree que la atactostela con haces anfivasales ha surgido evolutivamente a partir de la eustela con haces colaterales (Mauseth, 1988), y se ha sugerido que en dicha evolución podrían haber estado implicados los genes HD-ZIP III, mediante mutaciones de ganancia de función (Zhong y Ye, 2004). Sin embargo, no se han encontrado aún monocotiledóneas cuyas estirpes silvestres presenten genes HD-ZIP III con alelos semidominantes; y, además, cabría esperar que muchas mutaciones de este tipo dieran lugar a alteraciones tan graves que no les permitieran prosperar en condiciones naturales. Nuestro trabajo permite contemplar otro escenario en el que cambios sutiles en la función de los promotores de los genes HD-ZIP III, en la expresión de los miRNA que regulan post-transcripcionalmente a los genes HD-ZIP III y/o en la señal de auxinas podrían ser los responsables de la formación de haces anfivasales con un patrón en atactostela, sin que por ello se produjeran plantas gravemente afectadas. V.7.- Relaciones sinérgicas y antagónicas entre diferentes alelos mutantes de miembros de la familia HD-ZIP III. Las fuertes transformaciones adaxiales que sufren los órganos laterales de los individuos heterocigotos para el alelo de ganancia de función phb-1d se reducen en presencia de una copia del alelo mutante icu4-1, de forma que el doble heterocigoto ICU4/icu4-1;PHB/phb-1d muestra un fenotipo menos adaxializado que el del heterocigoto PHB/phb-1d. Este resultado indica que icu4-1 suprime parcialmente el fenotipo causado por phb-1d, lo que sugiere la existencia de antagonismo entre ambos. A su vez, como estos dos alelos son de ganancia de función, el resultado también sugiere que podría haber una relación antagónica entre los genes ICU4 y PHB en la determinación del eje adaxial-abaxial de los órganos laterales. Sin embargo, cuando se observó el patrón radial de los tallos de los dobles heterocigotos, se pudo comprobar que el fenotipo incrementaba con respecto a los dos heterocigotos sencillos, en una interacción que puede calificarse como sinérgica. Por lo tanto, de este resultado, se desprende una conclusión contraria a la anterior para el eje adaxial- Discusión 122 abaxial. Los genes ICU4 y PHB estarían colaborando en la determinación del patrón en los haces vasculares. Podría encontrarse una solución a esta aparente paradoja mediante el estudio de los patrones de expresión de los dos genes. Mientras que el mRNA de PHB se detecta en el tallo y en las regiones adaxiales de las hojas, ICU4 se expresa en el tallo y no lo hace adaxialmente en los órganos foliares (véase la sección IV.4.3; McConnell et al., 2001; Prigge et al., 2005). Por lo tanto, hay antagonismo en los órganos en los que sólo se expresa PHB y sinergia en un órgano donde se expresan los dos genes. Esto implicaría que las dianas de estos genes en los órganos laterales y en los tallos son diferentes o que debe haber factores moduladores de la respuesta a la acción de los genes en los distintos órganos. Es decir, a pesar de que se ha propuesto la existencia de un mecanismo común en el establecimiento del eje adaxial-abaxial de los órganos laterales y en la formación del patrón radial de los tallos, este resultado plantea la existencia de algunas diferencias en ambos procesos. ¿Cómo se produciría el antagonismo o la sinergia entre los dos genes? Las transformaciones adaxiales producidas por phb-1d se deben fundamentalmente a la expresión ectópica del gen en la región abaxial. Por lo tanto, la disminución del fenotipo mutante en los dobles heterocigotos implica que el producto ICU4 también debe estar presente en las regiones abaxiales, con dos posibles interpretaciones: a) ICU4 se une a las dianas de PHB, lo que impediría la función de este producto; b) el secuestro de PHB por parte de la proteína ICU4, al formarse heterodímeros ICU4PHB. Nosotros nos decantamos por esta última alternativa, ya que hemos visto anteriormente que el producto ICU4 especifica identidad adaxial (véase el apartado V.2), de forma que la unión de ICU4 a dianas concretas en el DNA debería dar lugar a transformaciones adaxiales. Además, la segunda opción es consistente con la formación de homo y heterodímeros recientemente publicada entre los miembros de la familia HD-ZIP III de Zinnia elegans, ZeHB-10, ZeHB-11 y ZeHB-12 (Oashi-Ito et al., 2002), y con el comportamiento de cna-1, un alelo parcialmente antimorfo de ICU4, que interfiere con la función del alelo silvestre y con la de otros genes HD-ZIP III (Green et al., 2005). A través del estudio de mutantes múltiples para alelos de pérdida de función en los genes HD-ZIP III, se ha podido determinar la existencia de sinergia y antagonismo entre ICU4 y PHB dependiendo del órgano en estudio (Prigge et al., 2005). Nuestro resultado aporta una información adicional a este trabajo. Los heterodímeros ICU4-PHB no deberían tener actividad, o una actividad escasa, en la especificación del eje adaxial-abaxial y sí deberían tenerla en la especificación del patrón de los haces vasculares en el tallo. Esto, unido a los patrones de expresión de Discusión 123 los dos genes, parece indicar que ICU4 no tiene una función directa en la determinación del eje adaxial-abaxial de los órganos laterales y sí la tiene en la especificación del patrón radial en el tallo. En apoyo de esta hipótesis, las hojas de los mutantes icu4-1 e icu4-2 presentan alteraciones en el tamaño de las células tanto en su superficie abaxial como en la adaxial (véase el apartado IV.1.1; J.L. Micol, comunicación personal), de lo que se desprende que no sólo está afectado el dominio abaxial, sino también el adaxial, y que, en los mutantes, el producto ICU4 está interfiriendo con el desarrollo normal de este dominio. Los individuos homocigotos para los alelos de pérdida de función del gen REV carecen de meristemos axilares y de fibras interfasciculares, y muestran una reducción en el número de flores fértiles (Talbert et al., 1995; Zhong y Ye, 1999; Otsuga et al., 2001). Recientemente, se ha publicado que estos fenotipos se suprimen parcialmente en un triple mutante para los alelos de pérdida de función cna-2 (un alelo nulo de ICU4), athb8-11 y rev-6, lo que se interpretó como una prueba de antagonismo entre las funciones de REV y las de los genes ICU4 y ATHB8. Los productos de ICU4 y ATHB8 se estarían uniendo a las dianas de REV y, posiblemente, de PHB y PHV, impidiendo la acción de estos factores de transcripción (Prigge et al., 2005). Sorprendentemente, nuestros resultados demuestran que el fenotipo Rev también se suprime parcialmente en los dobles mutantes icu4-1 rev-1 e icu4-1 rev-6. Por lo tanto, la sobreexpresión del gen ICU4, que tiene lugar en el mutante icu4-1, es capaz de compensar la deficiencia de la función REV, lo que descarta la hipótesis que se había propuesto de competencia por las dianas para explicar la relación antagónica. Una posible interpretación para estas interacciones antagónicas y sinérgicas guarda relación con la demostración de que muchos de los fenotipos causados por la homocigosis de los alelos rev se deben a la reducción del transporte polar de auxina, originada por la disminución de los niveles de dos transportadores de esta fitohormona, PIN3 y PIN4 (Zhong y Ye, 2001). Es, por tanto, posible que, dado que PID se sobreexpresa en el mutante icu4-1, ello pudiera compensar la reducción en el transporte en los mutantes rev, lo que permitiría explicar la supresión del fenotipo mutante. No obstante, todavía quedaría por explicar por qué también la eliminación de ICU4 y ATHB8 da lugar a la recuperación del fenotipo silvestre (Prigge et al., 2005). Una posible hipótesis estaría relacionada con la complejidad de las respuestas a la señal de auxina, dado que ésta puede producir la activación o la inhibición de determinados procesos dependiendo de su concentración y de interacciones con otras hormonas vegetales, tal y como ocurre con la elongación celular en los tallos y coleoptilos, que se induce a concentraciones bajas de auxinas y se inhibe a concentraciones elevadas (Eckardt, 2005). Discusión 124 Una hipótesis alternativa, pero no excluyente con la anterior, sería la formación de diferentes combinaciones de homo o heterodímeros en los distintos mutantes. De hecho, el conjunto de los datos sugiere que el sistema de los genes HDZIP III ha evolucionado hacia un modelo en el que las funciones precisas son aportadas por el establecimiento de los dominios de acción de sus productos, coincidentes en unos casos y excluyentes en otros. Así, en la gran mayoría de las regiones en las que se están expresando varios genes HD-ZIP III, éstos están actuando de forma redundante, mientras que un gen expresado ectópicamente altera la información posicional, lo que provoca un fenotipo mutante, pudiendo incluso interferir con la función de otros genes de la familia. Esto explicaría por qué el sistema es más resistente a la pérdida de función en los genes que a su ganancia. V.8.- ICU4 participa en la formación del patrón de filotaxia e interacciona con genes implicados en dicho proceso. El desarrollo vegetativo de las plantas comprende dos fases, la juvenil, en la que se forman hojas pequeñas, con filotaxia decusada (ángulo de divergencia entre hojas consecutivas de 180°) y que carecen de tricomas en la superficie abaxial, y la adulta, en la que la filotaxia adopta una forma espiral con un ángulo de divergencia entre órganos sucesivos de unos 137,5° y comienzan a aparecer tricomas en la superficie abaxial de las hojas (véase el apartado I.5). En el ecotipo En-2, los dos primeros pares de hojas muestran las características típicas de las formadas durante la fase juvenil, y es aproximadamente a partir de la quinta hoja cuando la filotaxia comienza a ser espiral y empiezan a reconocerse tricomas en la superficie abaxial. Sin embargo, en los mutantes icu4-1 e icu4-2, la filotaxia espiral y los tricomas en la superficie abaxial de las hojas no aparecen hasta el cuarto o quinto par de hojas. Es más, en ocasiones, incluso en el tallo principal se observan dos hojas caulinares, con sus inflorescencias axilares asociadas, surgiendo del mismo nudo con un patrón decusado. Estas observaciones indican que las mutaciones semidominantes de ICU4 dan lugar a un retraso en el cambio de la fase juvenil a la adulta. Cabe destacar en este sentido que la mutación hst-1 también afecta al cambio de fase, aunque en este caso produciendo un adelanto (Telfer y Poethig, 1998). El hecho de que los dos genes participen en el mismo proceso regulador del cambio de fase viene sugerido por el fenotipo de adelanto en el doble mutante, que indica que icu4-1 es epistático sobre hst-1 para el cambio de fase. El patrón vascular primario del tallo está estrechamente coordinado con el patrón de filotaxia (Steeves y Sussex, 1989; Kang et al., 2003), lo que permite que los Discusión 125 tejidos vasculares de las hojas y flores dispuestas con una filotaxia concreta alrededor del tallo encuentren una rápida conexión con los haces vasculares que discurren por éste. La filotaxia espiral de Arabidopsis se observa en que las posiciones de las hojas y las flores van formando hélices a lo largo del tallo, con ángulos de divergencia o separación entre órganos sucesivos próximos a 137,5° (Callos y Medford, 1994; Byrne et al., 2003); y se representa por una fracción en la que, en el numerador, se indica el número de vueltas necesario para pasar de una hoja o flor, con una posición determinada en el tallo, hasta otra que esté directamente sobre la posición inicial, y en el denominador viene expresado el número total de hojas o flores encontradas en los giros anteriores alrededor del tallo. En Arabidopsis, la filotaxia viene definida por la fracción 3/8 o 5/8, dependiendo de si el sentido en el que sigamos el giro es dextrorso o hacia la izquierda, y se ajusta a la serie numérica propuesta por Fibonacci en el siglo XIII (Callos y Medford, 1994; Byrne et al., 2003). Un dato a destacar es que el número de hojas o flores que encontramos desde una posición inicial n en el tallo hasta una localización inmediatamente por encima de ésta es 8 (posición n+8), que coincide con el número de haces vasculares que encontramos habitualmente en las secciones de los tallos de Arabidopsis. Es decir, el número de posiciones de inserción de órganos alrededor de la circunferencia de un tallo es el mismo que el número de haces vasculares. La íntima conexión entre los dos procesos hace que sea habitual encontrar mutantes que están afectados tanto en el patrón vascular como en la filotaxia, tal y como ocurre en icu4-1 e icu4-2 y las plantas carentes de la función del gen PENNYWISE (PNY), observándose asimismo un efecto sinérgico entre ambos tipos de mutantes que demuestra la participación de los genes en los dos procesos, ya sea en la misma vía o en vías paralelas. Un dato adicional a favor lo constituye el hecho de que las plantas dobles homocigotas para mutaciones de pérdida de función en PNY y su parálogo POUND-FOOLISH (PNF) presentan filotaxia decusada en todas las hojas de la roseta basal y nunca florecen (Smith et al., 2004), un fenotipo que recuerda al de los mutantes icu4-1 e icu4-2, aunque mucho más fuerte. Una pregunta obvia a responder sería de qué manera se produce la coordinación de ambos procesos. Inicialmente, se sugirió que los órganos situados en el tallo con patrones filotácticos específicos sintetizarían auxina que, al ser exportada, determinaría la formación de los haces vasculares en posiciones concretas (revisado en Steeves y Sussex, 1989; revisado en Leyser y Day, 2003). No obstante, la presencia de sistemas vasculares en los tallos carentes de órganos de las plantas con un transporte polar de auxinas muy reducido, como son el mutante pin-1 o las plantas tratadas con NPA, indica que la estructura organizada de los haces vasculares se Discusión 126 produce con independencia de los órganos laterales (Mattson et al., 1999). Alternativamente, también se ha propuesto que los haces vasculares del tallo podrían ser los que guiaran el patrón filotáctico de las hojas y flores (revisado en Leyser y Day, 2003). Sin embargo, la hipótesis actual para explicar la filotaxia argumenta que se debe a la inducción de órganos por la auxina transportada de forma polar a través de la epidermis, y no a través de los haces vasculares, teniendo lugar la formación de los órganos en las zonas periféricas del meristemo en las que se alcanza un máximo en la concentración de auxina. La acumulación de auxina en la región que formará el órgano da lugar a la eliminación de la fitohormona de las regiones circundantes, por lo que en éstas no se producirá la organogénesis (Reinhardt et al., 2003). Por lo tanto, la formación del patrón filotáctico tendría lugar independientemente del patrón de haces vasculares en el tallo. Un hecho importante que se desprende de lo comentado en el párrafo anterior es que, de forma similar a lo que ocurre en el establecimiento del patrón vascular, la auxina también tiene una función inductora en la iniciación de los órganos en el tallo y participa en la regulación de la filotaxia (Reinhardt et al., 2000; 2003; Vernoux et al., 2000). De hecho, la hipótesis comentada anteriormente para explicar cómo se genera la filotaxia no es más que una ligera modificación del mecanismo de difusión-reacción, también propuesto como explicación para la formación del patrón vascular, donde habría un componente autocatalítico inductor representado por la auxina y su transporte polar, así como un componente de inhibición lateral que, en este caso, sería la eliminación de la auxina de los tejidos circundantes (Meinhardt, 1982; 1984; Reinhardt et al., 2003). En cualquier caso, una hipótesis análoga a la utilizada para explicar la formación del patrón vascular según el modelo de difusión-rección. Por tanto, a pesar de que no haya señales instructivas del patrón de filotaxia al patrón vascular o, viceversa, del segundo hacia el primero, la estrecha correlación entre ambos patrones podría explicarse por la intervención de un mecanismo similar en los dos procesos, que incluiría la función de genes que estarían participando tanto en la formación del patrón de filotaxia como en el establecimiento de la posición de los haces vasculares en la eustela. Es interesante considerar en este sentido que se ha especulado que el gen PNY podría estar integrando las señales de hormonas como las auxinas y las giberelinas para establecer el patrón correcto de órganos alrededor del tallo (Smith y Hake, 2003). VI.- Conclusiones Conclusiones 128 VI.- Conclusiones I.- icu4-1 e icu4-2 son dos alelos semidominantes de ganancia de función del gen ATHB15/CNA/ICU4, que pertenece a la familia génica HD-ZIP III. II.- Los alelos icu4-1 e icu4-2 son portadores de la misma mutación puntual, que es a su vez idéntica a la de varios alelos semidominantes de otros miembros de la familia HD-ZIP III. Esta mutación se sitúa en la diana del miRNA165/166. La alteración del proceso de regulación post-transcripcional, debida al desapareamiento entre el miRNA y el mRNA de ICU4 provocado por la mutación, nos proporciona una explicación molecular para la ganancia de función de los dos alelos. III.- Los alelos icu4-1 e icu4-2 causan transformaciones adaxiales en los órganos laterales e interaccionan de forma sinérgica con otras mutaciones que también afectan al establecimiento del eje adaxial-abaxial, como hst-1, crc-1 y fil-3. IV.- El fenotipo producido por los alelos icu4-1 e icu4-2 es termosensible y muy pleiotrópico, ya que afecta no sólo al establecimiento del eje adaxial-abaxial, sino también al cambio de fase, a la filotaxia, al patrón radial de los tallos y a la embriogénesis. V.- Los alelos de pérdida de función del gen ICU4 no muestran fenotipo mutante, lo que puede ser atribuible a la redundancia funcional existente entre los miembros de la familia HD-ZIP III. VI.- El gen ICU4 promueve el desarrollo de los tejidos vasculares en el tallo, fundamentalmente a través de la estimulación de la proliferación de las células del procámbium, y regula el número de haces vasculares en la eustela. VII.- La localización precisa de los patrones de expresión de los genes HD-ZIP III, debida a la actividad de sus promotores y a la regulación post-transcripcional mediada por miRNA, confiere información posicional para la organización del patrón colateral en los haces vasculares y el establecimiento del conjunto del patrón radial en los tallos. Conclusiones 129 VIII.- Proponemos como hipótesis que los productos HD-ZIP III estarían formando un prepatrón sobre el cual se canalizaría el flujo polar de auxina, de manera que la formación de un haz vascular y la intensidad del flujo a través de él dependería de la concentración de auxina, que estaría actuando como morfógeno, y de los productos HD-ZIP III, que determinarían la respuesta final de las células. IX.- Nuestros resultados apoyan que, en la formación de los haces vasculares del tallo, además de la canalización del flujo de auxina, también hay un proceso de inhibición lateral debido a una sustancia inhibidora aún por descubrir, tal y como propone la hipótesis de la difusión-reacción. X.- Hemos observado relaciones sinérgicas y antagónicas entre distintos alelos mutantes de miembros de la familia HD-ZIP III, que proponemos pueda deberse a la formación de homo y heterodímeros con diferentes capacidades funcionales. XI.- La estrecha correlación entre el patrón vascular del tallo y la filotaxia puede explicarse por la intervención de un mecanismo similar en el establecimiento de ambos patrones. Esto hace que sea habitual encontrar genes afectados en los dos procesos, tal y como ocurre en icu4-1 y en los mutantes de pérdida de función del gen PNY, observándose asimismo un efecto sinérgico entre ambos tipos de alelos que demuestra la participación de los genes en los dos procesos, ya sea en la misma vía o en vías paralelas. VII.- Bibliografía Bibliografía 129 VII.- Bibliografía Adams, M.D., Celniker, S.E., Holt, R.A., Evans, C.A., Gocayne, J.D., Amanatides, P.G. et al. (2000). The genome sequence of Drosophila melanogaster. Science 287: 2185-2195. Al-Hammadi, A.S., Sreelakshmi, Y., Negi, S., Siddiqi, I. y Sharma, R. (2003). The polycotyledon mutant of tomato shows enhanced polar auxin transport. Plant Physiol. 133, 113-125. Al Shehbaz, I. A. (1984). The tribes of Cruciferae (Brassicaceae) in the south-eastern. J. Arnold Arbor 65: 343-373. Aloni, R. (1987). Differentiation of vascular tissues. Annu. Rev. Plant. Biol. 38, 179– 204. 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A Adelaida Baso y Asunción Climent, por su inestimable ayuda técnica. A José Luis Micol y sus colaboradores, por prestarme su ayuda siempre que la he necesitado. A mi familia, por su apoyo incondicional. A Miguel, por animarme siempre a seguir adelante. La realización de esta Tesis ha sido posible gracias a la concesión de una beca predoctoral de la Conselleria d’Empresa, Universitat i Ciència de la Generalitat Valenciana.