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LABORATORIO 8. REINO MÓNERA
OBSERVACIÓN DE BACTERIAS
COLORACIÓN DE GRAM
Profesor: Luis Francisco Moreno B. Biólogo, M. Sc. Biología.
El reino mónera es el grupo de microorganismos más pequeño que se puede ver al
microscopio compuesto. A este reino pertenecen las bacterias, que se caracterizan
porque no tienen núcleo, su pared es de carbohidratos, se reproducen
asexualmente y resisten a las condiciones ambientales adversas mediante
esporulación, entre otras características.
Las bacterias no tienen color, por lo que se requiere teñirlas para hacerlas visibles.
Los procedimientos de coloración que ponen de manifiesto diferencias entre las
células bacterianas o partes de una célula bacteriana, se conocen como técnicas
de coloración diferenciales. Son algo más elaboradas que la técnica simple en la
que las células se someten a una sola solución (o reactivo) colorante.
El bacteriólogo danés, Christian Gram, descubrió en 1.884 un método de coloración
con cristal violeta, el cual resulto dividiendo a las bacterias en dos grupos: El de las
Gram positivas que retienen dicho colorante y el de las Gram negativas, que no lo
retienen, cuando se exponen a decoloración con alcohol cetona.
Después de la decoloración, se utiliza safranina, que es colorante de contraste de
color rojo, el cual imparte un color rosado a los organismos decolorados, y no altera
el color de los que retuvieron el colorante violeta. También se puede utilizar otros
colorantes de contraste.
La razón por la cual las bacterias Gram positivas no se decoloran con el alcohol
cetona se debe a que se utiliza un mordiente inmediatamente después de la
aplicación del cristal violeta. Dicho mordiente en la forma de una solución yodada,
reacciona con el cristal violeta y el magnesio (Mg), dentro de la célula, para formar
un complejo cristal violeta yodo (C.V.I.) que resiste la decoloración.
Las explicaciones más plausibles de este fenómeno son las que se refieren a la
estructura y composición de la pared celular. Las bacterias Gram negativas,
contienen un porcentaje más alto de lípidos que las bacterias Gram positivas.
Las paredes celulares de las bacterias Gram negativas son también más delgadas
que las de las Gram positivas. Hay pruebas experimentales en el sentido de que el
tratamiento con alcohol extrae lípidos con lo cual se aumenta la porosidad o
permeabilidad de la pared celular Gram negativa. Así el complejo cristal violeta-yodo
(CV-1) puede extraerse en los organismos Gram negativos y de esta manera se
destiñen. Las paredes celulares de las bacterias Gram positivas, por su composición
diferente (bajo contenido lípido) se deshidratan durante el tratamiento con alcohol,
los poros se disminuyen afectando la permeabilidad y no se logra extraer el
complejo (CV-1). Además las bacterias Gram positivas hacen magnesio en su ARN,
y las Gram positivas no.
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Todo esto señala que la pared celular de las bacterias Gram positivas es el sitio de
retención del colorante primario. En las bacterias Gram negativas esta reacción no
ocurre, con el resultado de que el cristal violeta es removido.
Pese a la antigüedad del método de coloración diferencial, constituye aún hoy día
una de las técnicas más importantes en el trabajo bacteriológico.
Las Gram positivas son, por lo general, más susceptibles a la penicilina, a los
detergentes tenso activos y a ciertos colorantes. Las bacterias Gram negativas
constituyen un grupo más susceptible a otros antibióticos como la estreptomicina.
Normalmente, la técnica de coloración de Gram, requiere varios intentos antes de
llegar a ser completamente dominada y aprendida.
2. OBJETIVOS
2.1 Conocer y aplicar la técnica de coloración de Gram a bacterias cultivadas.
2.2 Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.
2.3 Determinar las bacterias observadas, con base en su morfología y organización.
3. MATERIALES
3.1 Guía de laboratorio.
3.2 Microscopio compuesto.
3.3 Portaobjetos.
3.4 Cubreobjetos.
3.5 Jabón.
3.6 Papel cocina.
3.7 Papel de arroz.
3.8 Limpia lentes.
3.9 Reloj o cronometro X 3
3.10 Muestra de bacterias X 3
3.11 Gradilla X 3
3.12 Agua destilada dispensador X 3
3.13 Cristal violeta dispensador X 3
3.14 Lugol con dispensador X 3
3.15 Alcohol Cetona al 95%.
3.16 Safranina dispensador X 3
3.17 Puente de coloración X 3
3.18 Asa de nicromo o Henle X 3
3.19 Mechero.
3.20 Candela o fósforos.
3.21 Aceite de inmersión X 3
4. MÉTODO Y RESULTADOS
Reciba el tubo de ensayo con el cultivo de bacterias y deposítelo en la gradilla para
que no se caiga, se rompa y contamine el laboratorio. Anote en la tabla 8.1 el
nombre científico de la bacteria que le correspondió, el cual está anotado en el tubo
de ensayo.
Colocar un portaobjetos limpio sobre el puente de coloración.
Prender el mechero y no colocarlo al borde del mesón, porque puede caerse y
causar incendio o accidente.
Colocarse tapa bocas.
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Tomar el asa de Henle con una mano. Con la otra destapar el tubo de ensayo que
contiene las bacterias, muy cerca de la llama del mechero, para disminuir riesgos
de fuga de bacterias al aire.
Introducir el asa y raspar la parte superior del sustrato, donde están las bacterias.
No introducir el asa dentro del sustrato, porque ahí no hay bacterias.
Sacar el asa con la muestra de bacterias, sosteniéndola cerca de la llama, pero no
tan cerca que queme la muestra.
Tapar el tubo de ensayo.
Fijar las bacterias al porta objetos que tiene en el puente, frotando la muestra y
distribuyéndola uniformemente con el asa.
Los siguientes pasos se resumen en una hoja que se coloca frente al puente de
coloración.
Cubrir la muestra con cristal violeta. Dejar actuar este colorante durante un minuto.
Lavar el exceso de coloración con agua destilada.
Cubrir el frotis con lugol durante un minuto.
Lavar con agua destilada.
Cubrir el frotis con una solución de alcohol-cetona por 10 o 15 segundos. Este paso
es crítico. Los frotis más gruesos requerirán más tiempo que los delgados
Lavar con agua destilada.
Cubrir el frotis con safranina por un minuto
Lavar con agua destilada.
Secar a la temperatura ambiente bandereando la muestra.
Llevar al microscopio y no colocar cubreobjetos.
Enfocar de aumento en aumento hasta 400.
Dibujar, fotografiar e identificar partes y funciones.
Fig. 8-1: ________________________________________________________________________
Depositar una gota de aceite de inmersión sobre la muestra y enfocar en 1000X.
El lente quedará inmerso en el aceite. Enfocar, dibujar, fotografiar e identificar.
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Fig. 8-2: ________________________________________________________________________
Limpiar el lente con papel absorbente, para que eliminarle el aceite.
Lavar el portaobjetos con agua y jabón.
TABLA 8.1: Tipo de la bacteria utilizada.
BACTERIA
Nombre Científico
COLOR PARED BACTERIA
Violeta o rasada
TIPO DE BACTERIA
Gram + o Gram -
FORMA BACTERIAL
Coco, diplococo, estafilococo, bacilo …
IMPORTANCIA
Enfermedad, utilidad, uso industrial, etc.
OBSERVACIONES:
5. ANÁLISIS
(Para consultar, reforzar y entender lo aprendido)
Desarrollar el siguiente cuestionario y anexarlo a la presente guía.
5.1 Mencionar cinco características del Reino Mónera.
5.2 Mencionar cinco empresas agropecuarias que trabajen con bacterias.
5.3 ¿Por qué las bacterias no son visibles al microscopio sino tiñéndolas?
5.4 Quién y en qué año se inventó la técnica de coloración de Gram?
5.5 ¿Cuál es la importancia de la coloración de Gram?
5.6 ¿En qué consiste la coloración de Gram?
5.7 Mencionar cinco características de las bacterias Gram positivas.
5.8 Mencionar cinco características de las bacterias Gram negativas.
5.9 Bajar e imprimir en un cuarto de página, una o más imágenes de la bacteria con
la que trabajó en el laboratorio e identificar sus partes y funciones.
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5.10 Consultar y resumir en media página, las principales características de la
bacteria con la que trabajó en el laboratorio.
5.11 ¿Qué son bacterias Gram variables y cuál podría ser la característica de
coloración de tales microorganismos?
5.12 ¿Cuál es el reactivo al cual debe controlarse con mayor cuidado el tiempo, en
la coloración de Gram y por qué?
5.13 ¿Cuál es la utilidad de esta técnica en agropecuaria? ¿En qué casos?
5.14 ¿En qué consiste el uso biotecnológico de las bacterias?
5.15 ¿En qué consiste la Ingeniería genética en relación con las bacterias?
6. CONCLUCIONES
6.1 Concluir sobre el grado de cumplimiento de los objetivos
6.2 Mencionar las aplicaciones del tema a la carrera que sigue, dando uno o más
ejemplos concretos.
7. FUENTES DE CONSULTA
Moreno, L. F. (productor). 2016. Video corto: ¿Cómo ver las Bacterias? Técnica
de coloración de Gram. Colombia.
https://www.youtube.com/watch?v=TWpaZseoB-o&t=68s
Recuperado de www.YouTube.com Canal: Biología Aplicada.
Moreno, L. F. (productor). 2016. Video corto: ¿Qué son las Bacterias y cuál es su
utilidad e importancia? Colombia.
https://www.youtube.com/watch?v=RWcx-mp9wLk
Recuperado de www.YouTube.com Canal: Biología Aplicada.
8. FUENTES CONSULTADAS
Autores y textos consultados para desarrollar la guía del laboratorio y profundizar
sobre el tema. Apellido del autor, iniciales del nombre, año, título de la publicación,
país, editorial. Orden alfabético.
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