Download Usos de la biología molecular y la ingeniería genética para el

UNIVERSIDAD NACIONAL DE ASUNCIÓN
DIRECCIÓN GENERAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA Y
TECNOLÓGICA
CENTRO MULTIDISCIPLINARIO DE INVESTIGACIONES
TECNOLÓGICAS
PROGRAMA DE VINCULACIÓN DE CIENTÍFICOS Y TECNÓLOGOS
CONACYT
APLICACIONES DE LA BIOLOGÍA MOLECULAR Y
LA INGENIERÍA GENÉTICA PARA EL
DESARROLLO DE CULTIVARES MEJORADOS
Resistencia a enfermedades fúngicas
Ing. Agr. M.Sc. Cinthia C. Cazal
Estancia de investigación- Centro de
Investigación Científica de Yucatán
(CICY) 2015.-
INTRODUCCIÓN
Se pueden separar en 3 grupos las actividades realizadas.
Proceso de
Transformación
Genética de
Plantas,
utilizando
Agrobacterium.-
Amplificación
de regiones
conservadas
para
identificación
molecular de
hongos.-
Identificación
de la presencia
de un gen
regulador de la
embriogénesis
en Stevia.-
PROCESO DE TRANSFORMACIÓN GENÉTICA
DE PLANTAS DE CAFÉ, UTILIZANDO
AGROBACTERIUM.Preparación del transgen para la transformación genética de Coffea canephora.
Verificación de la integración del gen de interés en un vector.
TÉCNICAS EMPLEADAS
Crecimiento de Agrobacterium: Se ponen a crecer en
medios específicos con antibióticos selectivos para la cepa
en cuestión a ser utilizada. El rango de densidad óptica
óptima es 0,3 a 0,5.
Preparación del material vegetal para la
transformación genética. Las plantas in
vitro se pre-acondicionarán por 14 días en
presencia
de
balance
hormonales
específicos.
…TÉCNICAS EMPLEADAS
Transformación genética de Coffea canephora mediante co-cultivo con
Agrobacterium tumefaciens. Se co-cultivará la bacteria y los explantes.
Corte de las hojas en forma circular
Explantes en medio con
Agrobacterium tumefaciens
1 hora en cámara de vacío
Incubación por 72 horas a 28 °C, en oscuridad.
…TÉCNICAS EMPLEADAS
Después de eliminar a la bacteria se procederá al inicio del protocolo de
embriogénesis somática de cafeto.
IDENTIFICACIÓN MOLECULAR DE HONGOS.IMPORTANCIA
Una alta diversidad genética se asocia a la capacidad de adaptarse a condiciones cambiantes
en su entorno.
REGIONES AMPLIFICADAS
Primers
Sequence (5′ – 3′)
ACT-512F
ACT-783R
ATG TGC AAG GCC GGT TTC GC
TAC GAG TCC TTC TGG CCC AT
Regiones
Partial actin gene (Carbone & Kohn (1999).
Partial CAL gene (Carbone & Kohn (1999).
CAL-228F
CAL-737R
GAG TTC AAG GAG GCC TTC TCC C
CAT CTT TCT GGC CAT CAT GG
ITS4 Reverse TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC
V9G Forward TTA CGT CCC TGC CCT TTG TA
LR5 Reverse TCC TGA GGG AAA CTT CG
NL1 Forward GCA TAT CAA TAA GCG GAG GAA AAG
RPB1F
RPB1R
AGA CGA TYG AGG AGA TCC AGT T
ART CCA CAC GCT TAC CCA TC
Internal transcribed spacers (White et al.
(1990).
Partial large subunit (LSU) (28S) of the nrRNA
gene operon. Vilgalys & Hester (1990)
O'Donnell (1993).
Partial RNA polymerase II largest subunit gene
Klaubauf et al. (2014).
TÉCNICAS EMPLEADAS
100pb 1
2
3
ACT ±380 pb
4
5
6 1
2
3
4
CAL ± 480 pb
5
6 7
100pb
1
2
3
1 kb
62,9 ⁰C
60,2 ⁰C
57 ⁰C
RPB1_009
66,7°C
68°C
63,8°C
60,3°C
62,1°C
55,1°C
68
°C
100bp
63,8°C
66,7°C
ITS ±470 pb
6
62,1°C
5
60,9°C
4
60,3°C
3
58,9°C
2
55,1°C
52,7°C
51,0 °C
60,9°C
5 6 1
56,4°C
4
55,1°C
LSU ±729 pb
3
58,9°C
2
56,4°C
1
55,1°C
52,7°C
1kb
51,0°C
1. Optimizar la amplificación de los fragmentos de interés.-
1kb
RBP1 ±980 pb
…TÉCNICAS EMPLEADAS
2. Obtención de productos de PCR
100pb 1
2
Leyenda
1. LSU_C-005
2. LSU_C-007
3. LSU_C-012
3
1
2
3 100pb
Leyenda
1. RBP1_C-005
2. RBP1_C-007
3. RBP1_C-012
100pb 1
2
3
Leyenda
1. C-016_ACT
2. C-017_ACT
3. C-019_ACT
4. C-021_ACT
4
100pb 1 2
3
Leyenda
1. C-04_CAL
2. C-05_CAL
3. C-07_CAL
4. C-012_CAL
4
100pb 1 2
3
Leyenda
1. 1. C-04_ITS4
2. C-05_ITS4
3. C-07_ITS4
4. C-012_ITS4
4
…TÉCNICAS EMPLEADAS
3. Ligación de fragmentos amplificados
…TÉCNICAS EMPLEADAS
2. Transformación
Choque térmico a 42 °C
Incubar a 37°C
190 rpm
1 hs30 min
LB+antibiótico+XGal+IPTG
Medio LB
Reposar en hielo
Incubar ±18 horas 37°C
Células Competentes+Producto
de ligación
…TÉCNICAS EMPLEADAS
…TÉCNICAS EMPLEADAS
PCR-Colonias
…TÉCNICAS EMPLEADAS
Incubar ±18 horas 37°C
Centrifugar a 8000 rpm
3 min
Temperatura ambiente
Pellet
LSU_±730 pb
ITS4_±470 pb
RPB1_±980 pb
CAL_±480 pb
…TÉCNICAS EMPLEADAS
…TÉCNICAS EMPLEADAS
Secuenciación
IDENTIFICACIÓN DE LA PRESENCIA DE UN
GEN REGULADOR DE LA EMBRIOGÉNESIS EN
STEVIA.Se realizó el diseño de cebadores específicos del gen Serk-1 utilizando la secuencia
del fragmento secuenciando.
…TÉCNICAS EMPLEADAS
El diseño de cebadores consiste en buscar una región de la secuencia que cumpla
ciertos parámetros (Temperatura de melting (Tm), % GC, entre otros.)
…TÉCNICAS EMPLEADAS
PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) denominada RACE por sus siglas en
inglés (Rapid amplification of cDNA ends)
…TÉCNICAS EMPLEADAS
POR SU ATENCIÓN
Muchas Gracias
email.: cccazalm86@gmail.com
AGRADECIMIENTOS