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CAPÍTULO 8
Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays
de ADN en la microbiología médica
Antonio Doménech-Sáncheza y Jordi Vilab
aUnidad de Investigación.
Hospital Universitario Son Dureta. Institut Universitari d’Investigacions en Ciències de la Salut (IUNICS). Palma de Mallorca.
España. bServicio de Microbiología. Hospital Clínic. Barcelona. España.
Los chips o arrays de ADN son una serie de sondas de ADN
unidas a un soporte sólido en una disposición regular y
prefijada. El ácido nucleico diana que será detectado puede
ser ADN o ARN y previamente a la hibridación debe ser
marcado con una sustancia fluorescente o radiactiva. La
principal ventaja con respecto a las técnicas de biología
molecular como la reacción en cadena de la polimerasa es
que pueden detectarse en un único procesamiento miles
de genes. Hasta la actualidad la aplicación de los arrays de
ADN en el campo de la microbiología clínica es escasa.
Dentro de las aplicaciones específicas cabe destacar:
a) Investigación de la patogenia bacteriana; b) análisis de
la evolución bacteriana y epidemiología; c) estudio de los
mecanismos de acción y de resistencia de los antibióticos,
y d) diagnóstico microbiológico de las enfermedades
infecciosas.
Si bien esta metodología se encuentra todavía en fase
embrionaria por lo que respecta a su aplicación en el
campo del diagnóstico microbiológico, presenta una serie
de ventajas que la hacen muy atractiva y en un futuro
pueda ser una técnica muy válida para el diagnóstico de
las enfermedades infecciosas.
Palabras clave: Arrays de ADN. Microarrays de ADN.
Microchips de ADN. Aplicaciones. Diagnóstico molecular.
Enferm Infecc Microbiol Clin 2004;22(1):46-54
Basis, types and application of DNA arrays
in clinical microbiology
The DNA microarrays or microchips are sets of DNA
probes bound to a solid support in a prefixed and regular
disposition. The target nucleic acid that can be detected is
either DNA or RNA, which is previously labeled with a
fluorochrome or a radioactive compound. The main
advantage with respect to other molecular biological tools,
such as polymerase chain reaction, is that thousands of
genes can be detected in a single procedure. The
application of the DNA arrays in the field of clinical
microbiology is so far scarce. Among the specific
applications we can point out: 1. Investigation of bacterial
pathogenesis; 2. Analysis of bacterial evolution and
molecular epidemiology; 3. Study of the mechanisms of
action and resistance to antimicrobial agents and 4.
Microbiological diagnostic of the infectious diseases. This
methodology is still in an embryonic phase with respect to
its application in clinical microbiology. However, it
presents a series of advantages that make it very
attractive and in the future it may become a valuable tool
for the diagnosis of infectious diseases.
Key words: DNA arrays. DNA microarrays. DNA microchips.
Molecular diagnosis.
Introducción
La investigación microbiológica a nivel molecular está
viviendo un cambio espectacular en los últimos años. En
apenas una década se ha pasado de trabajos basados en el
estudio de uno o unos pocos genes al análisis de los genomas en su totalidad. Gracias a los avances tecnológicos, la
secuenciación de genomas es algo cada vez más frecuente,
y desde que en 1995 se publicara el primer genoma completo de un ser vivo, Haemophilus influenzae1, ya se han
descrito unos 145 genomas completos (incluyendo los de
19 organismos eucariotas como el hombre o el ratón) y
aproximadamente 600 están siendo secuenciados en la
actualidad.
Asociada a esta explosión de datos y conocimientos ha
aparecido una nueva terminología como genómica, que
hace referencia al estudio de genomas completos, ya sea de
manera individual (tamaño, número de genes y posición
en el genoma, agrupaciones génicas, etc.) o comparando
distintos genomas; transcriptómica o genómica funcional,
referido al estudio de los genes que se expresan en un momento determinado; y proteómica, relativo al estudio de
las proteínas expresadas en una condición determinada y
al cual no haremos referencia en esta revisión, en la que se
presentan el fundamento y las variantes de los microarrays de ADN, así como sus aplicaciones en el campo de la
microbiología médica.
Arrays de ADN
Correspondencia: Dr. A. Doménech-Sánchez.
Unidad de Investigación. Hospital Universitario Son Dureta.
Institut Universitari d’Investigacions en Ciències de la Salut (IUNICS).
Andrea Doria, 55. 07014 Palma de Mallorca. España.
Correo electrónico: adomenech@uib.es
00
La aplicación más conocida y probablemente la que está
generando más datos en estos momentos es la técnica de
la hibrización mediante arrays de ADN. Buena prueba
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PUESTA AL DÍA EN MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO
de ello es el importante aumento en el número de publicaciones basadas en esta técnica en los últimos años, en particular en el campo de la microbiología (fig. 1).
Un array es un conjunto de sondas moleculares fijadas
de manera ordenada sobre un soporte sólido. Estas sondas
pueden ser clones de ADN, productos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) o bien oligonucleótidos sintéticos. Además, debido a su creciente popularidad, el término
array por extensión también hace referencia a la técnica
que utiliza estos soportes (hibridación mediante array).
El desarrollo de esta técnica ha sido posible gracias a
los avances en nuestro conocimiento de los genomas y a los
avances tecnológicos. De hecho, la idea o el concepto básico es el mismo que el de las técnicas clásicas de dot-blot.
La diferencia principal radica en la automatización del
proceso, donde la nanotecnología ha permitido que los
nuevos robots puedan procesar de manera simultánea decenas de miles de reacciones de PCR y depositar estas sondas moleculares en forma de microgotas en una superficie
de uno o varios centímetros cuadrados.
La síntesis de los arrays supone la impresión y fijación
de sondas de ADN sobre un soporte sólido con afinidad por
el ADN. Estos soportes generalmente son membranas de
nitrocelulosa o nailon, o bien portaobjetos recubiertos con
residuos de polilisinas u otro compuesto capaz de unir
ADN. En cuanto a las sondas, pueden ser clones de ADN
procedentes de una genoteca, productos de PCR obtenidos
a partir del genoma de interés o bien oligonucleótidos sintéticos (fig. 2).
La figura 3 muestra un esquema general de la técnica
de hibridación mediante la utilización de arrays. Las
muestras pueden ser ADN o ARN, según se trate de un
análisis genómico (genotipificación) o bien un análisis de
la expresión génica (genómica funcional). Una vez purificado el ácido nucleico se procede a su marcado, que puede
ser radiactivo o fluorescente. Esta última es la más popular, no sólo por su menor peligrosidad sino porque además
Figura 1. Número de publicaciones en las que se utilizan los microarrays de
ADN en el campo de la microbiología frente al total de publicaciones en otros
campos.
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Figura 2. Fundamento de los arrays de ADN.
permite hibridar dos muestras simultáneamente si se utilizan dos fluorocromos distintos (fig. 4). En el caso del
ADN, se fragmenta mediante sonicación o digestión enzimática parcial y a continuación se procede a su marcado
mediante una polimerasa. En el caso del ARN el marcaje
se lleva a cabo durante el proceso de transcripción inversa.
Una vez marcado el ADN (o ADNc) se procede a su hibridación con el array sintetizado previamente, uniéndose cada ADNc a la sonda correspondiente. A continuación
se somete al microarray a una serie de lavados para eliminar el exceso de ADNc que ha hibridado inespecíficamente y se procede a la medición de la señal. En el caso
de la radiactividad se utilizan principalmente sistemas de
captación de imágenes radiactivas, ya que su superior dinamismo, sus tiempos de exposición más cortos y el hecho
de obtener los resultados ya en formato digital los convierten en los métodos de elección frente a las clásicas películas de rayos X. Para las muestras marcadas fluorescentemente se utiliza un escáner provisto de un láser y una
serie de filtros capaces de excitar los fluorocromos y captar
la fluorescencia.
En cualquiera de los dos métodos se genera una imagen
que se somete a un proceso de digitalización, normalización y cuantificación. Tras este tratamiento se obtiene una
colección de datos con las intensidades correspondientes a
cada gen incluido en el array. Finalmente se procede al
análisis de los datos, que en ocasiones se convierte en una
tarea compleja, pues la ventaja de esta técnica es que permite obtener una enorme cantidad de información en un
único experimento. Por ejemplo, si utilizamos un microarray (v. más adelante) con 10.000 sondas fijadas es posible incluir todos los genes de Escherichia coli K12 (casi
5.000) por duplicado, lo que supone que en un único experimento se obtienen 20.000 valores: dos valores de expresión en la muestra control y dos valores en la muestra problema para cada gen. Sin embargo, esta gran cantidad de
información se convierte en un problema importante a la
hora de analizar todos los datos manualmente. Precisamente este aspecto supone la necesidad de análisis de tipo
estadístico para poder analizar los resultados. Por esta
misma razón, la ayuda de los sistemas informáticos es clave para el análisis de todos los datos por un lado, y evitar
la subjetividad inherente del propio investigador, por el
otro. La aplicación de la estadística es especialmente importante cuando el investigador no conoce de antemano algunos genes cuya expresión varíe en el sistema analizado,
es decir, controles que permitan determinar de manera objetiva cuál es el valor a partir del que se va a considerar
que existe un cambio en la expresión de un gen. En esos
Doménech-Sánchez A, et al. Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología médica
Figura 3. Esquema de la preparación de los microarrays de ADN y del procesamiento de las muestras para su análisis mediante microarrays de ADN.
casos, evitar la subjetividad a la hora de establecer este
punto de corte es fundamental.
Tipos de arrays
La nomenclatura en este campo es bastante variable y
en ocasiones subjetiva, de modo que podemos encontrar en
la literatura el término microarray como sinónimo de
array. A pesar de ello, en la mayoría de los casos se distinguen dos tipos principales de arrays: macroarrays y microarrays. Las diferencias entre ambos tipos se basan en el
tipo de soporte, el marcado de las muestras, el tamaño del
array y el número/densidad de sondas fijadas sobre el soporte. En la tabla 1 se muestran las principales ventajas
e inconvenientes de cada uno de ellos.
Figura 4. Fragmento de un microarray de ADN donde se compara la expresión
génica de una cepa control y una cepa problema. Los puntos rojos indican expresión únicamente del gen en la cepa control, los puntos verdes aquellos genes
que se expresan únicamente en la cepa problema y los puntos amarillos/naranjas los genes que se expresan en ambas cepas.
Macroarrays
Consideraremos macroarrays aquellos arrays en los que
las sondas se depositan e inmovilizan sobre un soporte
tipo membrana, generalmente de nitrocelulosa o nailon.
Este tipo de arrays utilizan en la mayoría de los casos un
marcado de tipo radiactivo, aunque el quimioluminiscente
también se ha utilizado en alguna ocasión2. El hecho de
utilizar radiactividad implica la necesidad de utilizar un
macroarray para cada muestra o control. Los macroarrays
generalmente contienen entre decenas y algunos miles
de sondas, y pueden considerarse como los primeros
arrays, pues ya en 1993 fueron utilizados por el grupo del
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PUESTA AL DÍA EN MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO
TABLA 1. Ventajas e inconvenientes de los distintos tipos de arrays de ADN
Macroarrays
Microarrays en portaobjetos
Gene-Chip
Ventajas
Inconvenientes
Más barato
Puede sintetizarse en el propio laboratorio
Permite hibridaciones interespecíficas
Gran variedad disponible en el mercado
Kits para diagnóstico (LiPA)
Utiliza volúmenes pequeños
Alta densidad de sondas
Puede sintetizarse en el propio laboratorio
Permite hibridaciones interespecíficas
Pueden procesarse dos muestras a la vez
en un mismo microarray
Utiliza volúmenes pequeños
Muy puesto a punto: repetitivo y robusto
Radiactivo
Número de sondas limitado
Requiere mayor volumen de muestra
Requiere puesta a punto
Cada muestra requiere un array
Coste relativamente elevado
Requiere puesta a punto
La mayor densidad de sondas del mercado
Chips microelectrónicos
Utiliza volúmenes pequeños
Alta densidad de sondas
Gran versatilidad y control sobre sondas
y muestras
Mayor eficacia de hibridación
Dr. Blattner (UW-Madison) para investigar la expresión
génica de Escherichia coli3.
Dentro de los macroarrays se encuentran el LiPA (Line
Probe Assay), un sistema de detección multiparamétrico
que se ha convertido en una alternativa a la secuenciación directa para genotipificar (v. p. ej., la referencia 4).
Este sistema utiliza tiras cubiertas con sondas específicas
de determinados genes que son hibridados con los productos de amplificación obtenidos a partir de la muestra analizada. Una clara ventaja de este sistema es que en un sólo
análisis pueden amplificarse distintas partes de un gen,
diferentes genes o incluso ADN de diversos organismos.
En definitiva, estos macroarrays contienen un número
pequeño de sondas, pero son muy útiles para realizar análisis concretos y son cada vez más utilizados en el diagnóstico clínico (v. apartado de aplicaciones y tablas 2 y 3).
Microarrays
Como ya hemos comentado anteriormente, la característica principal de los microarrays es la gran cantidad
de sondas que pueden fijarse sobre el soporte sólido, pudiéndose alcanzar hasta 60.000 sondas en un único soporte. Otra de las diferencias fundamentales frente a los
macroarrays es el soporte utilizado, y en función de esto
pueden diferenciarse microarrays en portaobjetos, microarrays de alta densidad o Gene-Chip y chips microelectrónicos.
Microarrays en portaobjetos
Este tipo de microarray se diferencian de los macroarrays en tres aspectos: a) utilizan un portaobjetos de cristal o plástico como soporte; b) el marcado de las muestras
se realiza mediante fluorescencia, y c) contienen un gran
número y densidad de sondas. Este tipo de microarrays
fue introducido en 1995 por el grupo de P.O. Brown en la
Universidad de Stanford5. Las ventajas de este sistema es
que la hibridación tiene lugar en una cámara de hibridación pequeña, de modo que se trabaja con volúmenes
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Coste elevado
El uso de oligonucleótidos requiere
altas homologías
Disponible para un número limitado
de organismos
No pueden procesarse dos muestras
a la vez en un mismo microarray
Exclusivo de Affimetrix
Coste elevado
Todavía en desarrollo
Exclusivo de Nanogen
mucho más pequeños y la concentración relativa de las
sondas es mayor, y sobre todo que la utilización de la fluorescencia como sistema de marcado permite hibridar en
un mismo array varias muestras conjuntamente (p. ej.,
control y problema).
El sistema Gene-Chip
Un tipo particular de microarrays son los producidos por
Affymetrix, una compañía que ha ideado y patentado una
tecnología que permite de manera simultánea la síntesis y
la impresión de las sondas moleculares directamente en la
fase sólida. Estos microarrays, conocidos comercialmente
con el nombre de GeneChip o “DNA-chip”, utilizan una
tecnología de síntesis mediante fotolitografía, es decir, que
las sondas son oligonucleótidos sintetizados in situ sobre
un cristal mediante una reacción fotoquímica. Las sondas
constan de 25 nucleótidos debido a la eficiencia del sistema de síntesis, ya que sondas mayores podrían contener
errores. Precisamente, este pequeño tamaño supone una
limitación en la especificidad y la afinidad de la muestra
por la sonda. Para solucionar este problema el array contiene series de oligonucleótidos que difieren únicamente
en una base para determinados genes, lo cual permite
calcular el ruido de fondo debido a la hibridación inespecífica. Estos arrays contienen más de 50.000 sondas y actualmente son los que poseen mayor número de sondas y
mayor densidad.
La ventaja de este sistema es que es muy reproducible,
ya que las condiciones están muy estandarizadas. Los inconvenientes principales son que el análisis con este tipo
de microarrays requiere el uso de escáneres y sofware específicos que únicamente provee la propia compañía, y que
estos microarrays no contienen las secuencias completas
de los genes sino fragmentos internos de 25 nucleótidos, de
modo que si la muestra analizada no presenta una homología del 100% pueden aparecer problemas a la hora de la
hibridación. En un principio esta tecnología GeneChip
únicamente contemplaba la síntesis de microarrays de
Doménech-Sánchez A, et al. Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología médica
TABLA 2. Aplicaciones de los macroarrays y microarrays de ADN en la microbiología clínica: bacterias
Bacteria
Sistema utilizado
Sondas utilizadas
Aplicación
Brucella spp.
Membrana nitrocelulosa (LiPA*) Oligonucleótidos
17
Campylobacter spp.
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
18
Enterococcus spp.
Membrana nailon
Escherichia coli
Portaobjetos
Helicobacter pylori
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
H. pylori
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
Listeria spp.
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
Mycobacterium spp.
Affimetrix
M. tuberculosis
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
M. tuberculosis
Membrana nailon
Mycobacterium spp.
Salmonella enterica
Staphylococcus spp.
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
Portaobjetos
Membrana nailon
Streptococcus pneumoniae
Diversas bacterias
Bacteria de hemocultivos
–
Chip microelectrónico
Membrana nailon
Identificación de especies
del género Brucella
Oligonucleótidos
Identificación de especies
del género Campylobacter
Productos de PCR
Identificación de especies
del género Enterococcus
Oligonucleótidos
Identificación de factores
de virulencia
Oligonucleótidos
Genotipificación según
los genes vacA y cagA
Oligonucleótidos
Detección de resistencia
a macrólidos
Oligonucleótidos
Identificación de especies
del género Listeria
Oligonucleótidos in situ Identificación de micobacterias
y resistencia a rifampicina
Oligonucleótidos
Detección de resistencia
a rifampicina
Oligonucleótidos
Detección de resistencia
a isoniacida
Oligonucleótidos
Identificación de micobacterias**
Productos de PCR
Genotipificación
Productos de PCR
Identificación de especies
del género Staphylococcus
Productos de PCR
Factores de virulencia
y antígenos superficiales
Oligonucleótidos
Identificación bacteriana
Oligonucleótidos
Detección de bacterias
a partir de frascos
de hemocultivo positivos
Referencia
19
20
21
22
23
13
24
25
26
27
28
29
30, 31
12
*LiPA: Line Probe Assay
**Identificación de micobacterias a partir de frascos BACTEC 12B positivos.
PCR: reacción en cadena de la polimerasa.
TABLA 3. Aplicaciones de los macroarrays y microarrays de ADN en el campo de la microbiología clínica: parásitos y virus
Microorganismo
Sistema utilizado
Sondas utilizadas
Aplicación
Referencia
14
32
33
34
35
36, 37
38, 39
40
41
42,43
Parásitos
Cryptosporidium spp.
Affymetrix
Oligonucleótidos*
Plasmodium falciparum
Portaobjetos
Productos de PCR
Identificación de especies de
Cryptosporidium
Análisis de la expresión génica
Virus
Citomegalovirus
Influenza A y B
Rotavirus
VIH
VIH
VHB
Papilomavirus
VHC
Membrana nitrocelulosa
Portaobjetos
Portaobjetos
Membrana nitrocelulosa
Affymetrix
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
Membrana nitrocelulosa (LiPA)
Oligonucleótidos
Oligonucleótidos
Oligonucleótidos
Producto de PCR
Oligonucleótidos in situ
Oligonucleótidos
Oligonucleótidos
Oligonucleótidos
Resistencia a ganciclovir
Diagnóstico
Genotipificación
Resistencia a antirretrovirales
Resistencia a antirretrovirales
Genotipificación
Genotipificación
Genotipificación
*En este caso se utilizó impresión de los oligonucleótidos sobre soporte de vidrio, no se utilizó síntesis in situ.
LiPA = Line Probe Assay. VIH: virus de la inmunodeficiencia humana; VHB: virus de la hepatitis B; VHC: virus de la hepatitis C.
E. coli basándose en los resultados obtenidos por el grupo
de F. R. Blattner en la Universidad de Wisconsin-Madison6. Tras la publicación de nuevos genomas esta tecnología se ha ampliado para el análisis de organismos tan diversos como el hombre, el ratón, Arabidopsis thaliana o
Bacillus subtilis.
Chips microelectrónicos
Los chips microelectrónicos o NanoChip son uno de los
formatos más novedosos dentro de los arrays. Su desarrollo es el resultado de la combinación de varios avances en
el campo de la biología molecular y las técnicas de microfabricación de semiconductores.
En lugar de una membrana o un portaobjetos este tipo
de arrays consiste en un conjunto de electrodos cubiertos
por una fina capa de agarosa que contiene acoplados motivos de afinidad que permiten la inmovilización de las sondas mediante el sistema biotina-estreptavidina. La incorporación de campos eléctricos controlables dota de un nuevo
grado de control del sistema a la hora de depositar tanto las
sondas como las muestras. A diferencia del resto de arrays,
en los que la hibridación es un proceso pasivo y aleatorio, en
el caso de los chips microelectrónicos se genera un campo
eléctrico que dirige activamente la muestra, incrementando
su concentración sobre las sondas, y por tanto, aumentando
la efectividad de la hibridación. Además, si tras el proceso
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PUESTA AL DÍA EN MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO
de hibridación se invierte la polaridad se elimina el exceso
de muestra y puede procesarse una nueva. Por tanto, este
sistema permite hibridaciones seriadas de distintas muestras o bien de una muestra sobre distintas combinaciones
de sondas en el mismo array. Esta tecnología está siendo
desarrollada por Nanogen (San Diego, CA, USA) y evidentemente presenta un gran potencial debido a su capacidad
de mover ácidos nucleicos sobre la superficie del chip. Si la
compañía consigue que el coste no sea excesivo podría convertirse en el futuro de los arrays.
Aplicaciones de los arrays de ADN
en el campo de la microbiología médica
Tradicionalmente en la microbiología clínica se ha utilizado una amplia variedad de cultivos, métodos de tinción y
pruebas bioquímicas para la identificación de la mayoría de
especies bacterianas. En la identificación de los parásitos la
visualización microscópica mediante examen en fresco o
tras una tinción específica ha desempeñado una importante función, mientras que la identificación de los virus requiere una vía más indirecta como es el cultivo celular. Algunos de estos ensayos requieren un largo período de
tiempo antes de obtenerse un resultado definitivo, por lo
que a lo largo del tiempo se han desarrollado diversos métodos para detectar características moleculares específicas
del patógeno, como por ejemplo todas las variantes del enzimoinmunoanálisis. Aunque estas técnicas pueden ser útiles para la identificación microbiana, su efectividad puede
verse afectada por el hecho de que muchos microorganismos han encontrado maneras de modificar su antigenicidad. De manera similar, la determinación de los niveles de
anticuerpos circulantes puede que no distinga una infección pasada de una actual. Debido a esta variabilidad se
han desarrollado métodos de identificación microbiana basados en la detección de un factor relativamente estable
como el genoma del microorganismo. Los métodos utilizados inicialmente estaban basados en la hibridación de pequeños fragmentos de ADN marcados (sondas) que reconocían regiones específicas del microorganismo que se quería
detectar. No obstante, debido al bajo número de estos microorganismos presentes en un producto patológico determinado, fue necesario desarrollar un sistema de amplificación del gen. Esto se consiguió con la introducción de la
PCR. Utilizando diversos cebadores en una misma reacción
(PCR múltiple) se pueden llegar a identificar diversos microorganismos en una única reacción. Sin embargo, este
sistema también posee sus limitaciones, entre las que se
encuentran:
1. La PCR múltiple permite amplificar concomitantemente un número limitado de genes.
2. Mutaciones puntuales en la región de ADN que es reconocida por los cebadores pueden conducir a falsos negativos.
3. Muchas veces es necesario secuenciar el producto de
PCR para identificar mutaciones puntuales en un gen determinado asociadas, por ejemplo, con la adquisición de resistencia a un antibiótico.
Estos problemas pueden resolverse mediante la utilización de arrays de ADN. En general, las principales aplicaciones de los microarrays de ADN son:
62
1. Detección de genes específicos o regiones del genoma
de un microorganismo (genotipificación).
2. Detección de mutaciones puntuales en ciertos genes.
3. Análisis de la expresión de ARNm.
Hasta la actualidad los arrays de ADN se han aplicado
de una manera más específica al estudio de la patogenia
microbiana, a la epidemiología molecular, al diagnóstico
microbiológico, así como a la investigación de los mecanismos de acción y resistencia a agentes antimicrobianos.
Aplicación de los arrays de ADN a la investigación
de la patogenia bacteriana
Durante la investigación de la patogenia bacteriana deben diferenciarse dos aspectos. En primer lugar, los factores de patogenicidad del microorganismo, y en segundo lugar, la respuesta de la célula hospedadora frente a la
acción del microorganismo. Israel et al7 utilizaron microarrays de ADN que contenían los genes que constituyen el
genoma de H. pylori para analizar determinantes asociados a la patogenicidad de este microorganismo. Desde el
punto de vista de la respuesta de la célula hospedadora
frente a un patógeno, Belcher et al8 investigaron la respuesta de células del epitelio bronquial frente al efecto de
dos cepas de Bordetella pertussis, una productora de la toxina y la otra no. Para ello utilizaron el microchip HU6800
(Affymetrix) que contiene un conjunto de sondas para analizar la expresión de genes que codifican proteínas del sistema inmunitario, hallando que las células infectadas con
la cepa que producía la toxina expresaban un conjunto de
citocinas y genes regulados por NFkB.
Aplicación de los arrays de ADN al estudio
epidemiológico molecular de ciertos
microorganismos
En un estudio realizado por Kato-Maeda et al9 en el que
se pretendía obtener información sobre las bases moleculares de la diversidad bacteriana y de la evolución de
Mycobacterium tuberculosis se utilizaron microarrays de
ADN que contienen los genes que constituyen el genoma
de este microorganismo (Affymetrix). Se analizaron 19 cepas de M. tuberculosis de 16 clones diferentes y tras purificación del genoma, digestión con ADNasaI y marcado
terminal con biotina se procedió a la hibridación con los
microarrays, revelando posteriormente con estreptavidina-ficoeritrina. Los resultados demostraban deleciones
importantes en el genoma de algunas de las cepas y que
estas deleciones se asociaban con una menor patogenicidad. Los patrones de deleciones detectados eran idénticos
en los mismos clones, pero diferían en los clones diferentes, lo cual sugería que esta metodología podría ser utilizada en estudios epidemiológicos.
Aplicación de los arrays de ADN al diagnóstico
microbiológico
Los microarrays de ADN desarrollados hasta la actualidad con finalidad diagnóstica no presentan una elevada
complejidad. Se podría decir que son macroarrays o microarrays de baja densidad (tablas 2 y 3). Por ejemplo, Hamels
at al10 han diseñado un microarray para detectar varias
especies del género Staphylococcus. En primer lugar, amplifican utilizando oligonucleótidos degenerados el gen
femA, que se encuentra altamente conservado en el géne-
Doménech-Sánchez A, et al. Fundamento, tipos y aplicaciones de los arrays de ADN en la microbiología médica
ro Staphylococcus y este producto de PCR es analizado posteriormente mediante microarrays de ADN que contienen
sondas que reconocen el gen femA de S. aureus, S. epidermidis, S. haemolyticus, S. hominis y S. saprophyticus. En
el análisis realizado los autores identifican correctamente
cada una de las especies sin que se presente reacción cruzada. De una manera similar se han diseñado microarrays
para distinguir entre especies de Pseudomonas11.
Una estrategia que se ha utilizado para la identificación bacteriana es la utilización como sonda de oligonucleótidos específicos de las regiones variables de los genes
que codifican el ARNr 23S o 16S. Anthony et al12 analizaron 158 hemocultivos positivos mediante la utilización de
un array de oligonucleótidos específicos para 25 bacterias
distintas. A partir del crecimiento bacteriano en el frasco
de hemocultivos, se realizó una PCR con cebadores universales para la amplificación de la región variable del gen
23S. Este producto o productos de PCR, si el hemocultivo
era mixto, se hibridaban con el array. La identificación fue
correcta en 125 hemocultivos positivos (79,7%); en estos
datos se incluían cuatro hemocultivos mixtos. En 9 hemocultivos (7,2%) se aislaron bacterias no representadas en
el array y en 16 hemocultivos positivos (10,3%) no se obtuvo producto de PCR. En 7 de los 8 hemocultivos positivos restantes, se identificaron estreptococos, pero éstos no
crecieron y un aislamiento de S. aureus se interpretó como
estafilococo plasmocoagulasa negativo.
De la misma manera, Troesch et al13 analizan en el mismo microarray la identificación de especies del género Mycobacterium y su resistencia a la rifampicina. Para la
identificación de las especies utilizan oligonucleótidos específicos de las regiones variables del gen que codifica el
ARNr 16S mientras que para la detección de la resistencia
a rifampicina se utilizan oligonucleótidos específicos para
la detección de mutaciones puntuales asociadas con la resistencia a este agente antimicrobiano. De hecho, para
detectar la mutación específica se utilizaron cuatro sondas
de igual longitud cuya única diferencia es que en la posición de la mutación se incluye A, T, C o G. Se diseñaron los
oligonucleótidos de forma que la base donde podría tener
lugar la mutación quedase en la parte central.
Los microarrays de ADN también se han utilizado para
detectar Cryptosporidium sp. en aguas y diferenciar los
que pueden ocasionar infecciones en humanos14. Las sondas utilizadas en este microarrays son distintas regiones
del gen hsp70 del microorganismo. Otro aspecto de la aplicación de los microarrays de ADN es el ámbito de la virología clínica, básicamente su utilización en la genotipificación del VIH15.
En la información aportada en las tablas 2 y 3 se incluye
el sistema LiPA (Line Probe Assay) porque, si bien posee
normalmente un número pequeño de sondas, por lo que
debería considerarse un macroarray, está siendo ampliamente utilizado en el diagnóstico microbiológico.
Aplicación de los arrays de ADN al estudio
de los mecanismos de acción y de resistencia
a los agentes antimicrobianos
Los microarrays de ADN se han utilizado para analizar
en profundidad el mecanismo de acción de la isoniacida
frente a M. tuberculosis16. Además, se han utilizado para
el estudio de la resistencia bacteriana a los antibióticos: ya
se ha mencionado anteriormente la utilización de los mi-
croarrays de ADN para la detección de resistencia a rifampicina en M. tuberculosis. Nuestro grupo (Vila et al) de
investigación ha utilizado microarrays de ARN que contienen los genes que constituyen el genoma de E. coli para
analizar la expresión de sistemas de expulsión activa en
cepas de este microorganismo resistentes a quinolonas,
demostrando que esta metodología es altamente válida
para este tipo de estudios, pues permite una visión general de los genes que se están expresando y así poder comparar la expresión de estos genes entre cepas isogénicas
sensibles y resistentes a las quinolonas.
Ventajas y desventajas de la utilización
de los arrays de ADN en el diagnóstico de las
enfermedades infecciosas
La principal ventaja de esta metodología es la posibilidad de hibridación simultánea de un gran número de sondas, por lo que permite detectar a la vez un amplio número
de microorganismos (bacterias, virus, parásitos y hongos).
Además permite no sólo la identificación del microorganismo, sino también el análisis del genotipo de resistencia y
la presencia de factores de patogenicidad, mediante detección de genes específicos o mutaciones. Sin embargo,
existe una serie de desventajas que probablemente en el
futuro podrán ser soslayadas. Una de ellas es la baja sensibilidad, que en la actualidad hace difícil la utilización
de esta metodología para la detección directa del microorganismo en el producto patológico, a no ser que se incorpore un paso previo de amplificación génica. No obstante,
cuando los microarrays sean miniaturizados, su sensibilidad probablemente aumentará, por lo que, en un futuro,
y gracias a la nanobiotecnología, es probable que pueda
detectarse el ADN o ARN directamente de la muestra sin
amplificación previa. Otra desventaja importante es que
la detección de un gen de resistencia no significa invariablemente un fenotipo de resistencia, por lo que además de
detectar la presencia del gen deberíamos detectar la expresión de éste mediante análisis del ARN mensajero
(ARNm). Desde el punto de vista de la detección de la resistencia a los antibióticos de un microorganismo determinado directamente del producto patológico comporta
también una serie de inconvenientes, como son:
1. La diversidad de mecanismos de resistencia que existen para un antibiótico determinado y la necesidad de contemplarlos todos ellos en el microarray de ADN.
2. Para algunos mecanismos es necesario determinar
la expresión del gen.
3. La aparición de nuevos mecanismos de resistencia no
contemplados en el microarray.
4. Si el producto patológico corresponde a una zona del
cuerpo humano que presenta una microbiota normal, ésta
puede interferir con la detección, ya que el mismo mecanismo de resistencia puede estar presente en algunas de
las bacterias que constituyen esta microbiota.
En definitiva, los microarrays con elevada densidad de
sondas se encuentran en las primeras fases de desarrollo,
pero ofrecen un potencial futuro enorme. Sin embargo,
debido a la dinámica de la evolución inherente a los microorganismos, probablemente en muchos casos nunca llegarán a desplazar totalmente a los métodos convencionales,
sino que serán un complemento de ellos.
63
PUESTA AL DÍA EN MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS PARA EL DIAGNÓSTICO CLÍNICO
Agradecimientos
A.D-S ha sido parcialmente financiado por la Red Española de Investigación en Patología Infecciosa (REIPI).
Bibliografía
1. Fleischmann RD, Adams O, White RA, Clayton EF, Kirkness AR, Kerlavage
CJ, et al. Whole-genome random sequencing and assembly of Haemophilus
influenzae Rd. Science 1995;269:496-512.
2. Rajeevan MS, Dimulescu IM, Unger ER, Vernon SD. Chemiluminescent
analysis of gene expression on high-density filter arrays. J Histochem Cytochem 1999;47:337-42.
3. Chuang SE, Daniels DL, Blattner FR. Global regulation of gene expression
in Escherichia coli. J Bacteriol 1993;175:2026-36.
4. Descamps D, Calvez V, Collin G, Cecille A, Apetrei C, Damond F, et al. Line
probe assay for detection of human immunodeficiency virus type 1 mutations conferring resistance to nucleoside inhibitors of reverse transcriptase:
Comparison with sequence analysis. J Clin Microbiol 1998:36:2143-5.
5. Schena MD, Shalon R, Davis W, Brown PO. Quantitative monitoring of gene
expression patterns with a complementary DNA microarray. Science 1995;
270:467-70.
6. Blattner FR, Plunkett G, Bloch CA, Perna NT, Burland V, Riley M, et al.
The complete genome sequence of Escherichia coli K-12. Science 1997;277:
1453-74.
7. Israel DA, Salama N, Arnold CN, Moss SF, Ando T, Wirth HP, et al. Helicobacter pylori strain-specific differences in genetic content, identified by microarray, influence host inflammatory responses. J Clin Invest 2001;107:611-20.
8. Belcher CE, Drenkow J, Kehoe B, Gingeras TR, McNamara N, Lemjabbar
H, et al. The transcriptional responses of respiratory epithelial cells to Bordetella pertussis reveal host defensive and pathogen counter-defensive strategies. Proc Natl Acad Sci USA 2000;97: 13847-52.
9. Kato-Maeda M, Rhee JT, Gingeras TR, Salamon H, Drenkow J, Smittipat N,
et al. Comparing genomes within the species Mycobacterium tuberculosis.
Genome Res 2001;11:547-54.
10. Hamels S, Gala L, Dufour S, Vannuffem P, Zammatteo N, Remaci J. Consensus PCR and microarray for diagnosis of the genus Staphylococcus, species and methicillin resistance. Biotechniques 2001;31:1364-72.
11. Cho JC, Tiedje JM. Bacterial species determination from DNA-DNA hybridization by using genome fragments and DNA microarrays. Appl Environ
Microbiol 2001;67:3677-82.
12. Anthony RM, Brown TJ, French GL. Rapid diagnosis of bacteremia by universal amplification of 23S ribosomal DNA followed by hybridization to an
oligonucleotide array. J Clin Microbiol 2000;38:781-8.
13. Troesch A, Nguyen H, Miyada CG, Desvarenne S, Gingeras TR, Kaplan PM,
et al. Mycobacterium species identification and rifampin resistance testing
with high-density DNA probe arrays. J Clin Microbiol 1999;37:49-55.
14. Straub TM, Daly DS, Wunshel S, Rochelle PA, DeLeon R, Chandler DP.
Genotyping Cryptosporidium parvum with an hsp70 single-nucleotide polymorphism microarray. Appl Environ Microbiol 2002;68:1817-26.
15. Lipshutz RJ, Morris D, Chee M, Hubbell E, Kozal MJ, Shah N, et al. Using
oligonucleotide probe arrays to access genetic diversity. BioTechniques
1995;19:442-7.
16. Wilson M, DeRisi J, Kristensen HH, Imboden P, Rame S, Brown PO, et al.
Exploring drug-induced alterations in gene expression in Mycobacterium tuberculosis by microarray hybridization. Proc Natl Acad Sci USA 1999;96:
12833-8.
17. Rijpens NP, Jannes G, Van Asbroeck M, Rossau R, Herman LMF. Direct
detection of Brucella spp. in raw milk by PCR and reverse hybridization
with 16S-23S rRNA spacer probes. Appl Environ Microbiol 1996;62:1683-8.
18. Van Doorne LJ, Verschuuren-Van Haperen A, Burnens A, et al. Rapid identification of thermotolerant Campylobacter jejuni, Campylobacter coli,
Campylobacter lari and Campylobacter upsaliensis from various geographic
locations by a GTPase.based PCR hybridization assay. J Clin Microbiol
1999;37:1970-6.
19. Goh SH, Facklam RR, Chang M, Hill JE, Tyrrell GJ, Burns EC, et al. Identification of Enterococcus species and phenotypically similar Lactococcus and
Vagococcus species by reverse checkerboard hybridization to chaperonin
60 gene sequences. J Clin Microbiol 2000;38:3953-9.
20. Chizhikov V, Rasooly A, Chumakov C, Levy DD. Microarray analysis of microbial virulence factors. Appl Environ Microbiol 2001;67:3258-63.
21. Van Doorn LJ, Figueiredo C, Rossau R, Jannes G, Van Asbroek M, Sousa JC,
et al. Typing of Helicobacter pylori vacA gene and detection of cagA gene by
PCR and reverse hybridization. J Clin Microbiol 1998;36:1271-6.
64
22. Van Doorn LJ, Debets-Ossenkopp YJ, Marais A, Sanna R, Megraud F, Kusters JG, et al. Rapid detection, by PCR and reverse hybridization, of mutations in the Helicobacter pylori 23S rRNA gene, associated with macrolide
resistance. Antimicrob Agents Chemother 1999;43:1779-82.
23. Rijpens NP, Jannes G, Van Asbroeck M, Herman LMF, Rossau R. Simultaneous detection of Listeria spp. and Listeria monocytogenes by reverse hybridization with 16S-23S rRNA spacer probes. Mol Cell Probes 1996;9:
423-32.
24. De Beenhouwer H, Lhiang Z, Jannes G, Mijs W, Machtelinckx L, Rossau R,
et al. Rapid detection of rifampicin resistance in sputum and biopsy specimens from tuberculosis patients by PCR and line probe assay. Tuber Lung
Dis 1995;76:425-30.
25. Brown TJ, French GL. Genotypes associated with isoniazid resistance in
Mycobacterium tuberculosis isolates seen at a London Teaching Hospital. J
Microbiol Meth 1999;38:226.
26. Miller N, Infante S, Cleary T. Evaluation of the LiPA mycobacteria assay for
identification of Mycobacterial species from BACTEC 12B bottles. J Clin Microbiol 2000;38:1915-9.
27. Garaizar J, Porwollik S, Echeita A, Rementeria A, Herrera S, Wong RM, et
al. DNA microarray-based typing of an atypical monophasic Salmonella enterica serovar. J Clin Microbiol 2002;40:2074-8.
28. Goh SH, Santucci Z, Kloos WE, Faltyn M, George CG, Driedger D, et al.
Identification of Staphylococcus species and subspecies by the chaperonin
60 gene identification method and reverse checkerboard hybridisation. J
Clin Microbiol 1997;35:3116-21.
29. McCluskey J, Dowson CG, Mitchell TJ. The use of microarray technology
for the analysis of Streptococcus pneumoniae. Comp Funct Genom 2002;3:
366-8.
30. Edman CF, Mehta P, Press R, Spargo C, Walker G, Neremberg M, et al.
Pathogen analysis and genetic predisposition testing using microelectronic
arrays and isothermal amplification. J Invest Med 2000;48:93-101.
31. Westin L, Miller C, Vollmer D, Canter D, Radtkey R, Nerenberg M, et al.
Antimicrobial resistance and bacterial identification utilizing a microelectronic chip array. J Clin Microbiol 2001;39:1097-104.
32. Hayward RE, De Risi JL, Alfadhli S, Kaslow DC, Brown PO, Rathod PK.
Shotgun DNA microarrays and stage-specific gene expression in Plasmodium falciparum malaria. Mol Microbiol 2000;35:6-14.
33. Zhou L, Harder TC, Ullmann U, Rautenberg P. Rapid detection by reverse
hybridization of mutations in the UL97 gen of human cytomegalovirus conferring resistance to ganciclovir. J Clin Virol 1999;13:53-9.
34. Li J, Chen S, Evans DH. Typing and subtyping Influenza virus using DNA
microarrays and multiplex reverse transcriptase PCR. J Clin Microbiol
2001;39:696-704.
35. Chizhikov V, Wagner M, Ivshima A, Hoshino Y, Kapikian AZ, Chumakov K.
Detection and genotyping of human group A rotavirus by oligonucleotide microarray hybridization. J Clin Microbiol 2002;40:2398-407.
36. Stuyver L, Wyseur A, Rombout A, Louwagie J, Scarcez T, Verhofstede C, et
al. Line probe assay for rapid detection of drug-selected mutations in the human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase gene. Antimicrob
Agents Chemother 1997;41:284-91.
37. Schmit JC, Ruiz L, Stuyver L, Van Laethem K, Vanderlinden I, Puig T, et al.
Comparison of the LiPA HIV-1 RT test, selective PCR and direct solid phase sequencing for the detection of the HIV-1 drug resistance mutations. J Virol Methods 1998;73:77-82.
38. Vahey M, Nau ME, Barrick S, Cooley JD, Sawyer R, Sleeker AA, et al. Performance of the Affymetrix GeneChip HIV PRT 440 platform for antiretroviral drug resistance genotyping of human immunodeficiency virus type 1 clades and viral isolates with length polymorphisms. J Clin Microbiol 1999;
37:2533-7.
39. Kozal MJ, Shah N, Shen N, Yang R, Fucini R, Merigan TC, et al. Extensive
polymorphisms observed in HIV-1 clase B protease gene using high density
oligonucleotide arrays. Nature Med 1996;2:753-9.
40. Blitz L, Pujol FH, Swenson PD, Porto L, Atencio R, Araujo M, et al. Antigenic diversity of hepatitis B virus strains of genotype F in Ameridians and
other population groups in Venezuela. J Clin Microbiol 1998;36:648-51.
41. Kleter B, Van Doorn LJ, Schrauwen L, Molijn A, Sastrowijoto S, Ter Schegget J, et al. Development and clinical evaluation of a highly sensitive
PCR-reverse hybridization line probe assay for detection and identification
of anogenital human papillomavirus. J Clin Microbiol 1999;37:2508-17.
42. Livache T, Fouque B, Roget A, Marchand J, Bidan G, Teoule R, et al. Polypyrrole DNA chip on a silicon device: Example of hepatitis C virus genotyping.
Anal Biochem 1998;255:188-94.
43. Stuyer L, Wyseur A, Van Arnhem W, Hernández F, Maertens G. Second-generation line probe assay for hepatitis C virus genotyping. J Clin Microbiol
1996;34:2259-66.