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Transcript

Centro de Investigación Científica de Yucatán, A.C.
Posgrado en Ciencias Biológicas
IDENTIFICACIÓN Y CARACTERIZACIÓN
MOLECULAR DE FACTORES DE
TRANSCRIPCIÓN DE LA FAMILIA NAC
INVOLUCRADOS EN RESPUESTA A ESTRÉS
ABIÓTICO EN Carica papaya, L. cultivar Maradol
Tesis que presenta
ALEJANDRO PEREIRA SANTANA
En opción al título de
DOCTOR EN CIENCIAS
(Ciencias Biológicas: Opción Biotecnología)
Mérida, Yucatán, México
Diciembre de 2015
Mérida, Yucatán, México; a 2 de Diciembre de 2015
DECLARACIÓN DE PROPIEDAD
Declaro que la información contenida en la sección de Materiales y Métodos
Experimentales, los Resultados y Discusión de este documento proviene de las
actividades de experimentación realizadas durante el período que se me asignó para
desarrollar mi trabajo de tesis, en las Unidades y Laboratorios del Centro de
Investigación Científica de Yucatán, A.C., y que a razón de lo anterior y en
contraprestación de los servicios educativos o de apoyo que me fueron brindados,
dicha información, en términos de la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley de la
Propiedad Industrial, le pertenece patrimonialmente a dicho Centro de Investigación.
Por otra parte, en virtud de lo ya manifestado, reconozco que de igual manera los
productos intelectuales o desarrollos tecnológicos que deriven o pudieran derivar de lo
correspondiente a dicha información, le pertenecen patrimonialmente al Centro de
Investigación Científica, A.C., y en el mismo tenor, reconozco que si derivaren de este
trabajo productos intelectuales o desarrollos tecnológicos, en lo especial, estos se
regirán en todo caso por lo dispuesto por la Ley Federal del Derecho de Autor y la Ley
de la Propiedad Industrial, en el tenor de lo expuesto en la presente Declaración.
________________________________
Alejandro Pereira Santana
AGRADECIMIENTOS
Agradezco al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT) por la beca
otorgada (#240187) en apoyo a mis estudios de Doctorado, así como el apoyo
otorgado a través del proyecto de Ciencia básica 2010-I (CB-2010-01) titulado
“Factores de Transcripción de papaya (Carica papaya) como una plataforma molecular
para mejorar su tolerancia a estreses bióticos y abióticos” con número 155356.
Agradezco al Dr. Luis Carlos Rodríguez Zapata toda la confianza que deposito en mi
persona, por toda su ayuda, sus comentarios, sus consejos y sobre todo agradezco su
amistad a lo largo de mi formación académica.
Agradezco de manera muy personal al Dr. Felipe Sánchez Teyer, por toda su
confianza y el apoyo brindado hacia mi persona, durante mi formación académica en
el transcurso de mi estadía en el CICY.
Agradezco de igual forma a mi comité tutoral integrado por el Dr. Luis C. Rodríguez
Zapata, Dr. Enrique Castaño de la Serna, Dr. Lenin Sánchez Calderón y Dr. Luis David
Alcaráz Peraza, cuyas aportaciones y sugerencias llevaron a buen término este
trabajo.
De igual forma agradezco a mi comité revisor integrado por el Dr. Luis C. Rodríguez
Zapata, Dr. Enrique Castaño de la Serna, Dr. Felipe Sánchez Teyer, Dr. Lenin
Sánchez Calderón, Dr. Manuel Martínez Estévez, Dra. Ana Ly Arroyo Herrera y la Dra.
Daisy de la Caridad Pérez Brito, gracias por sus valiosas observaciones y
comentarios.
Agradezco de manera institucional al Centro de Investigación Científica de Yucatán,
A.C. (CICY), al Dr. Felipe Sánchez Teyer en su carácter de Director General del CICY,
a la Unidad de Biotecnología, al Departamento de Posgrado actual y al anteriormente
dirigido por la Lic. Gilma Michell y la Lic. Nancy Sulub Herrera, al Coordinador de
Posgrado actual de la Unidad de Biotecnología Dra. Marcela Gamboa Angulo, y al
anterior, Dr. Luis Saénz Carbonell, así como a la subdirectora de docencia la CP.
Liligelia García Cano. De igual forma quiero agradecer al Departamento de Cómputo
por su pronta ayuda durante mi estadía en el CICY.
Agradezco al Instituto de Ecología, de la Universidad Nacional Autónoma de México,
por permitirme realizar una estancia de Investigación en sus instalaciones.
Agradezco también al M. en C. Francisco Espadas Gil por su ayuda y asesoría con las
mediciónes de parámetros fisiológicos. Agradezco al M. en C. Pablo Acereto Escoffie
por su disposición y su ayuda con los análisis de nutrientes realizados en su
laboratorio. De igual forma Agradezco a la M. en C. Ángela Kú González por su ayuda
en el uso del microscopio confocal. Al Dr. Cesar de los Santos Briones por sus
comentarios y sugerencias. A la IIA. Wilma Aracely González Kantún por su ayuda en
la preparación de muestras para microscopía.
Quiero agradecer a todas las personas que formaron parte de las labores diaras
durante mi estadía en el CICY e hicieron ameno el trabajo en el laboratorio. Dra. Ana
Ly Arroyo Herrera, Dr. Luis Joel Figueroa Yáñes, QFB. Miguel Keb llanes, M. en C.
Jorge Espadas Alcocer, M en C. Samuel David Gamboa Tuz, Biol. Gabriela Flores
Vargaz, M. en C. Christian Alcocer Jauriga, IBT. Edyciel Jordán Alvarado Robledo,
IBT. Sandi Julissa Reyes Hernández, M. en C. Jesús Alejandro Zamora Briseño, QFB.
Ricardo Ortíz Luevano, Ing. Biomédico María Magdalena Rodríguez Ruíz, IBQ. Karina
Maricela Sosa Martínez, Biol. Aarón Xavier G Cantón Bastarrachea, IBT. María Ileana
Leon Campos, IBQ. Evelyn Arlette Carrillo Bermejo.
Agradezco a todas aquellas personas las cuales no aparece su nombre pero que sin
duda han sido parte de este gran proceso formativo y de mi vida.
Dedico esta tesis a mi Familia.
Mi esposa Diana Sofía Gutiérrez Martín, Mis Padres Manuel Pereira Novelo y Landy
Elizabeth Santana Rivas, y Mis hermanos Manuel y Fernando. Sin duda este trabajo
es el resultado del esfuerzo conjunto de mi familia, del gran ejemplo de dedicación y
perseverancia que me inculcaron, y de la paciencia para esperar el fruto del trabajo.
“Consideré luego todas las cosas que mis manos habían hecho y el trabajo en que me
había empeñado y he aquí, me di cuenta de que nada de esto tenía sentido y era
como correr tras el viento…”
Índice
RESUMEN ..............................................................................................................................................1
ABSTRACT ............................................................................................................................................3
INTRODUCCIÓN ....................................................................................................................................5
CAPÍTULO I ............................................................................................................................................7
1.1 ANTECEDENTES .................................................................................................................. 7
1.1.1 ESTRÉS ABIÓTICO ................................................................................................................. 7
1.1.2 SISTEMAS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA ANTE ESTRÉS
ABIÓTICO .......................................................................................................................................... 11
1.1.3 FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN INVOLUCRADOS EN RESPUESTA A
ESTRÉS ABIÓTICO ......................................................................................................................... 11
1.1.4 EL REGULÓN NAC ................................................................................................................ 13
1.1.5 PLANTAS USADAS COMO MODELOS EXPERIMENTALES EN BIOLOGÍA
MOLECULAR..................................................................................................................................... 17
1.1.6 Carica papaya .......................................................................................................................... 18
1.2 JUSTIFICACIÓN .................................................................................................................. 20
1.3 HIPÓTESIS .......................................................................................................................... 21
1.4 OBJETIVOS ......................................................................................................................... 21
1.4.1 OBJETIVO GENERAL ............................................................................................................ 21
1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ................................................................................................. 21
1.5 DISEÑO EXPERIMENTAL DE LA INVESTIGACIÓN.......................................................... 22
1.6 REFERENCIAS.................................................................................................................... 23
CAPÍTULO II COMPARATIVE GENOMICS OF NAC TRANSCRIPTIONAL FACTORS IN
ANGIOSPERMS: IMPLICATIONS FOR THE ADAPTATION AND DIVERSIFICATION
OF FLOWERING PLANTS .................................................................................................................. 35
2.1 ABSTRACT.......................................................................................................................... 36
2.1 INTRODUCTION .................................................................................................................. 37
2.2 MATERIALS AND METHODS ............................................................................................. 40
2.2.1 NAC GENE FAMILY SEARCHES AND RETRIEVAL ........................................................ 40
2.2.2 SEQUENCE ANALYSIS, MULTIPLE SEQUENCE ALIGNMENTS AND
EVOLUTIONARY MODEL TESTING............................................................................................. 40
2.2.3 DEFINING ORTHOLOGOUS GROUPS (OGs) .................................................................. 41
2.2.4 EVOLUTIONARY ANALYSIS AND ANGIOSPERM TREE OF LIFE .............................. 41
2.3 RESULTS AND DISCUSSION ............................................................................................. 42
2.3.1 GENOME-WIDE IDENTIFICATION OF NAC GENES ...................................................... 42
2.3.2 ORTHOLOGOUS GROUPS AND DUPLICATIONS IN THE NAC FAMILY ................... 46
i
Índice
2.3.3 NAC PHYLOGENETIC ANALYSES ..................................................................................... 50
2.4 CONCLUSIONS ................................................................................................................... 57
2.5 ACKNOWLEDGMENTS ...................................................................................................... 57
2.6 AUTHOR CONTRIBUTIONS ............................................................................................... 58
2.7 REFERENCES ..................................................................................................................... 59
2.8 SUPPORTING INFORMATION ........................................................................................... 74
CAPÍTULO III CARACTERIZACIÓN IN SILICO DE FACTORES DE TRANCRIPCIÓN
NAC INVOLUCRADOS EN RESPUESTA A ESTRÉS ABIÓTICO ................................................. 77
3.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 77
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS ................................................................................................ 79
3.2.1
DETERMINACIÓN
DE
SECUENCIAS
NAC
CARACTERIZADAS
EN
DISTINTAS ESPECIES VEGETALES, E IDENTIFICACIÓN DE LAS SECUENCIAS
ORTÓLOGAS EN C. papaya L. cv. MARADOL ........................................................................... 79
3.2.2 MODELOS ESTRUCTURALES DE LAS PROTEÍNAS NAC DE C. papaya
SELECCIONADAS ........................................................................................................................... 80
3.2.3 ANÁLISIS DE PROMOTORES ............................................................................................. 80
3.3 RESULTADOS..................................................................................................................... 81
3.3.1
DETERMINACIÓN
DE
SECUENCIAS
NAC
CARACTERIZADAS
E
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS ORTÓLOGAS EN C. papaya L. cv.
MARADOL .......................................................................................................................................... 81
3.3.2
MODELOS
ESTRUCTURALES
DE
LAS
PROTEÍNAS
NAC
SELECCIONADAS ........................................................................................................................... 86
3.3.3 ANÁLISIS DE PROMOTORES DE GENES NAC .............................................................. 87
3.4 DISCUSIÓN ......................................................................................................................... 89
3.5 REFERENCIAS.................................................................................................................... 92
CAPÍTULO IV EXPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL DE GENES NAC DE C. PAPAYA
ANTE DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRÉS ABIÓTICO ...................................................... 99
4.1 INTRODUCCIÓN ................................................................................................................. 99
4.2 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 102
4.2.1 TRATAMIENTOS DE ESTRÉS ABIÓTICO PARA C. papaya ....................................... 102
4.2.2 EXTRACCIÓN DE ARN Y SÍNTESIS DE ADNc .............................................................. 103
4.2.3 CLONACIÓN DE LOS GENES CpNAC SELECCIONADOS ......................................... 103
4.2.4 DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL .................................... 103
4.3 RESULTADOS................................................................................................................... 105
4.3.1 EXTRACCIÓN DE ARN Y SÍNTESIS DE ADNc .............................................................. 105
4.3.2 DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL .................................... 108
ii
Índice
4.4 DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 114
4.5 REFERENCIAS.................................................................................................................. 118
CAPÍTULO V DETERMINACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS GENES NAC
SELECCIONADOS ............................................................................................................................ 123
5.1 INTRODUCCIÓN ............................................................................................................... 123
5.2 MATERIALES Y MÉTODOS .............................................................................................. 125
5.2.1 SOBREEXPRESIÓN EN N. tabaccum. ............................................................................. 125
5.2.1.1 ESTANDARIZACIÓN DE LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE TABACO ....... 125
5.2.2 LOCALIZACIÓN NUCLEAR DE LAS PROTEÍNAS CpNAC-GFP ................................. 126
5.2.3 ENSAYOS DE ESTRÉS EN LÍNEAS TRANSGÉNICAS DE TABACO ........................ 126
5.3 RESULTADOS................................................................................................................... 128
5.3.1 TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS DE TABACO .................................... 128
5.3.2 LOCALIZACIÓN NUCLAR GFP-CpNAC’s ........................................................................ 131
5.3.3 ENSAYOS DE ESTRÉS ABIÓTICO EN LAS LÍNEAS TRANSGÉNICAS DE
TABACO ........................................................................................................................................... 132
5.4 DISCUSIÓN ....................................................................................................................... 137
5.5 REFERENCIAS.................................................................................................................. 140
CAPÍTULO VI ..................................................................................................................................... 143
6.1 DISCUSIÓN GENERAL ..................................................................................................... 143
6.2 CONCLUSIONES GENERALES ....................................................................................... 146
6.3 PERSPECTIVAS................................................................................................................ 147
iii
Índice
ÍNDICE DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 1.1 Cascada de señalización en respuesta a estrés abiótico. Los factores de
transcripción son mostrados dentro cajas de color (Shinozaki y Yamaguchi-Shinozaki.,
2007) . ......................................................................................................................................... 12
Figura 1. 2 Esquema de la estructura de un factor de transcripción NAC. La región del
dominio de unión al ADN está contenida en los subdominios D y E. La región TAR (Región
de activación transcripcional) se encuentra en el C-terminal de las proteínas de la familia
NAC. ............................................................................................................................................ 14
Figura 1.3 Representación esquemática de las principales estructuras de las proteína NAC
(Ooka et al., 2003). Las barras grises indican el dominio N-terminal NAC. Proteínas VOZ
con un dedo de zinc indicado como (Zinc F). ............................................................................. 14
Figura 1.4 Estrategia experimental de este trabajo.................................................................... 22
CAPÍTULO II
Fig. 1 Phylogenetic relationships among 24 land plant species and the distribution of NAC
proteins identified in this study, based on the HMM-generated profile. The total number of
NAC proteins identified in each genome; the plant genome size, ploidy and chromosome
number of each species; and the number of NAC sequences with Transmembrane motifs
(TMM) for each genome are indicated on the right in colored squares. Ancient WGDs are
represented
by
colored
stars
(details
were
taken
from
CoGepedia,
https://genomevolution.org). Species names are color-coded as follows: blue – Moss, purple
– pseudofern, red - monocots, and green - eudicots. *Genome size in Gb. ............................... 43
Fig. 2 Schematic representation of NAC OGs shared among Angiosperms. A) Venn diagram
showing the orthologous gene number shared between the P. patens outgroup and rice and
grapevine genomes as the selected representatives for monocot and eudicot plants,
respectively. The total overlap consisted of five proteins that define the basal core of the
NAC genes. B) The number of orthologous proteins detected by means of BBH in 24 green
plants. Green lines indicate the OGs shared between the moss P. paten, S. moellendorffii,
and the basal taxa of the monocot and eudicot lineages. The number below the red line
indicates the number of OGs shared between the rice and grapevine species. Black lines
indicate the number of OGs shared among the monocots and eudicots with their respective
selected pivotal species. ............................................................................................................. 48
Fig. 3 Phylogenetic relationships of the NAC gene family. A) Maximum likelihood
phylogenetic tree derived from a MUSCLE alignment of the NAC domains from 24 plant
species. The unrooted phylogenetic tree of the 2106 NAC proteins was clustered into six
major families. Specific motifs found in the C-terminal region of the NAC proteins are shown
iv
Índice
next to each group. Blue lines and blue asterisks indicate sequences of P. patens in the tree,
green circles show Arabidopsis proteins, and purple and red circles show grapevine and rice
sequences, respectively. B) Schematic depiction of the proposed NAC family classification.
Names of each subgroup are shown next to each clade. Triangles represent the NAC
subgroups (detailed phylogenetic analysis is available in S4 Fig; branch lengths are
arbitrary). C) Schematic representation of the five NAC's BOGs detected in the plant lineage
and their affiliation into the major groups. Paralogous proteins for rice and grapevine are
shown below each colored box. The affiliation of each BOG into the phylogenetic tree is
available in S5 Fig. C) HMM LOGO of the NAC domain of 2106 proteins used in the
phylogenetic tree. ........................................................................................................................ 51
CAPÍTULO III
Figura 3. 1 Análisis comparativo entre las tres secuencias caracterizadas de A. thaliana
ANAC019, ANAC055 y ANAC072 con la secuencia ortóloga CpNAC4 de C. papaya (color
naranja). ...................................................................................................................................... 84
Figura 3. 2 Comparación de las estructuras secundarias de las proteínas de A. thaliana con
respecto a sus secuencias ortólogas en C. papaya. A y E corresponden a la proteína
CpNAC5 y ANAC002 respectivamente; B y F, proteínas CpNAC1 y ANAC029; C y G,
proteínas CpNAC39 y ANAC040; D y H, proteínas CpNAC12 y ANAC092 respectivamente. .. 86
Figura 3. 3 Comparación de modelos tridimensionales de las proteínas NAC seleccionadas
A) Ensamble biológico del dominio NAC de la proteína ANAC019 (Crystal form IV, PDB), B)
ANAC019, C) ANAC055, D) ANAC072 y E) proteína CpNAC4 de papaya ortóloga a
ANAC072..................................................................................................................................... 86
Figura 3. 4 Resumen de los diversos elementos en cis presentes en la región promotora de
los genes NAC seleccionados. Los nombres de los diferentes elementos en cis se señalan
dentro de cajas en color verde, y el sitio dentro del promotor se señala con figuras para cada
uno de los elementos encontrados. (Análisis realizado 1.5 Kb río arriba a partir del ATG de
la secuencia codificante) ............................................................................................................. 88
CAPÍTULO IV
Figura 4. 1 ARN total de plantas de papaya sometidas a 40°C en diferentes tiempos de
exposición (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5% ...................................................... 105
Figura 4. 2 ARN total de plantas de papaya sometidas a 4°C en tiempos de exposición (0,
2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5% .............................................................................. 105
Figura 4. 3 Muestras de ARN total de plantas de papaya sometidas a diferentes tiempos de
estrés por sequía (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5% ........................................... 106
Figura 4. 4 Muestras de ARN total de plantas de papaya sometidas a diferentes tiempos de
estrés por salinidad (300mM NaCl). Gel de agarosa al 1.5% ................................................... 106
v
Índice
Figura 4. 5 Muestras de ADNc de plantas sometidas a tratamiento de 40ºC en diferentes
tiempos (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5% ........................................................... 107
Figura 4. 6 Muestras de ADNc de plantas sometidas a tratamiento de 4ºC en diferentes
tiempos (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5% ........................................................... 107
Figura 4. 7 Muestras de ADNc de plantas sometidas a tratamiento de sequía en diferentes
tiempos. Gel de agarosa 1.5%. ................................................................................................. 108
Figura 4. 8 Muestras de ADNc de plantas sometidas a tratamiento de salinidad (300mM) en
diferentes tiempos. Gel de agarosa 1.5%. ................................................................................ 108
Figura 4. 9 Patrón de expresión transcripcional en dos diferentes tejidos, hoja y raíz, de los
cinco genes NAC seleccionados de C. papaya sometidos a estrés por baja temperatura
(4°C). Los nombres de los genes homólogos de Arabidopsis se encuentran a un lado del
nombre del gen de papaya. Se utilizó el gen de la subunidad ribosomal 18S como control de
carga. ......................................................................................................................................... 109
Figura 4. 10 Patrón de expresión transcripcional en dos diferentes tejidos, hoja y raíz, de los
cinco genes NAC seleccionados de papaya sometidos a estrés por alta temperatura (40°C).
Los nombres de los genes homólogos de Arabidopsis se encuentran a un lado del nombre
del gen de papaya. Se utilizó el gen de la subunidad ribosomal 18S como control de carga .. 109
Figura 4. 11 Perfil de expresión transcripcional en dos diferentes tejidos, hoja y raíz, para
los cinco genes NAC seleccionados de papaya sometidos a estrés por sequía así como
para el grupo control. Se utilizaron los genes HSP70 y DREB2C como control positivo ante
el estrés por sequía. Los nombres de los genes homólogos de Arabidopsis se encuentran a
un lado del nombre del gen de papaya. Se utilizó el gen de la subunidad ribosomal 18S
como control de carga ............................................................................................................... 110
Figura 4. 12 Perfil de expresión transcripcional de los genes NAC seleccionados de papaya
para el estrés por salinidad así como para el grupo control. Se utilizaron los genes HSP70 y
DREB2C como control positivo ante el estrés. Los nombres de los genes homólogos de
Arabidopsis se encuentran a un lado del nombre del gen de papaya. Se utilizó el gen de la
subunidad ribosomal 18S como control de carga ..................................................................... 111
CAPÍTULO V
Figura 5. 1 Explantes de tabaco transformados en medio semisólido de inducción de brotes,
con los respectivos antibióticos para cada tratamiento. ........................................................... 128
Figura 5. 2 Plantas de N. tabacum transformadas con el gen gusA, mediante el protocolo de
Clemente, 2006. ........................................................................................................................ 129
Figura 5. 3 Desarrollo de plantas de tabaco transformadas con genes CpNAC4 y CpNAC5
de C. papaya. A) Regeneración mediante organogénesis directa de plantas transformadas,
B) plantas de tabaco transformadas de 8 semanas en medio de enraizamiento. .................... 130
Figura 5. 4 Plantas transgénicas de N. tabacum (progenie F0) después de su aclimatación . 130
vi
Índice
Figura 5. 5 Localización de la proteína CpNAC4 y CpNAC5 en hojas de tabaco. Proteínas
de papaya fusionadas a la proteína GFP bajo el control del promotor 35S. ............................ 131
Figura 5. 6 Localización nuclear de la proteína CpNAC4 y CpNAC5 en raíz de tabaco.
Proteínas de papaya fusionadas a la proteína GFP bajo el control del promotor 35S. ............ 132
Figura 5. 7 Trantamiento de estrés por temperatura (42°C) para plantas de tabaco
sobreexpresantes del gen CpNAC5 de papaya. Tres líneas pertenecientes al gen CpNAC5
(a, b y c) fueron sometidas junto con un grupo control a un ensayo por calor durante 8
horas. ......................................................................................................................................... 133
Figura 5. 8 Tratamiento de salinidad para plantas de tabaco sobreexpresantes del gen
CpNAC5 de papaya. En cajas rojas se señalas las diferencias más notorias en la afectación
del crecimiento de la raíz en las líneas transgénicas de tabaco. En recuadro verde (100 mM)
se muestra la diferencia del crecimiento de la parte aérea de la planta control con respecto a
las sobreexpresantes. ............................................................................................................... 134
Figura 5. 9 Tratamiento de germinación de plantas de tabaco transformadas con el gen
CpNAC4 de papaya. A) Disposición de las líneas transgénicas y el control (wild-type) en la
placa; B) placa con medio MS sin ABA a los 18 días; C y D) placa con 0.1 µM de ABA a los
18 días; E y F) placa con 0.1 µM de ABA a los 21 días de germinación; G y H) placa con 0.1
µM de ABA a los 24 días de germinación. ................................................................................ 135
Figura 5. 10 Fenotipos resultantes de plantas de tabaco no transformadas y plantas
sobreexpresantes del gen CpNAC4_1 después de siete días de estrés por temperatura a
44°C durante 7 días. A) Plantas no transformadas de tabaco después de siete días de
estrés; B) Plantas de tabaco que sobreexpresan el gen CpNAC4_1 despues de 7 días a
44°C. Las plantas fueron regadas diariamente con 200 mL de agua. ...................................... 136
vii
Índice
ÍNDICE DE CUADROS
CAPÍTULO I
Tabla 1. 1 Plantas genéticamente modificadas con Factores de Transcripción NAC para
conferir tolerancia a estrés abiótico............................................................................................. 17
CAPÍTULO III
Tabla 3. 1 Genes funcionales NAC reportados en la literatura, involucrados en diversas
respuestas ambientales. ............................................................................................................. 81
Tabla 3. 2 Secuencias seleccionadas de C. papaya ortólogas a genes de A. thaliana
responsivos a estrés abiótico ...................................................................................................... 83
CAPÍTULO IV
Tabla 4. 1 Iniciadores usados para clonación y análisis de expresión transcripcional de los
genes NAC seleccionados de papaya ...................................................................................... 104
viii
Resumen
RESUMEN
Los factores de transcripción (FT) son conocidos por regular una amplia gama de
procesos fisiológicos y estar incluidos en las estrategias moleculares que las plantas
utilizan para hacer frente ante los diversos tipos de estrés ambiental. Se ha
comprobado que la alteración de la expresión de ciertos FT en las plantas puede influir
considerable en la tolerancia al estrés. La familia NAC es una de los grupos más
grandes de FT encontrados específicamente en plantas, los cuales se encuentran
involucrados en un gran número de procesos del desarrollo y en respuesta al estrés
ambiental. Dichas proteínas se pueden identificar por la presencia de un dominio Nterminal conservado, con la capacidad de unirse al ADN, y un dominio C- terminal
altamente variable el cual tiene la capacidad de ser un activador de la transcripción. En
este estudio se determinó mediante diversos análisis bioinformáticos, la evolución de
esta familia de FT en Angiospermas, así como las expansiones génicas que ha sufrido
entre los diversos linajes de plantas. Por otro lado, se determinó la expresión
transcripcional de cinco genes NAC de C. papaya cv. Maradol ante cuatro diferentes
tipos de estrés abiótico, comprobando de esta manera la actividad transrcripciona de
dichos genes en respuesta a
un determinado tipo de estrés abiótico. La
sobreexpresión de los genes CpNAC4 y CpNAC5 en plantas de tabaco, demostraron
su participación en los mecanismos moleculares que dichos organismos adoptan para
hacer frente al estrés abiótico.
1
Abstract
ABSTRACT
Transcription factors (TFs) are known to regulate a wide range of physiological
processes and are included in the strategies that plants use to cope with environmental
stresses. It has been found that the overexpression of certain transcription factors in
plants can considerably influence on stress tolerance. NAC TF family, which is only
found in plants, regulates many processes of plant development and in response to
stress. NAC proteins can be identified by the presence of an N-terminal conserved
domain (called NAC domain) with the ability to bind to DNA and a highly variable Cterminal region which is an activator of transcription. In this study we determine the
evolutionary history of NAC TF family in Angiosperms. On the other hand, the
transcriptional expression of five stress-related NAC's genes from papaya tree was
determined. Furthermore, the functionality of two stress-related NAC genes (CpNAC4
and CpNAC5) was determined by overexpression in tobacco plants and their
participation in tolerance to abiotic-stress processes was corroborated.
3
Introducción
INTRODUCCIÓN
Las plantas crecen en un ambiente dinámico que a menudo presenta grandes retos y
limitaciones para su crecimiento y desarrollo. Entre los factores adversos que impone
el medio ambiente encontramos las altas y bajas temperaturas, la salinidad de los
suelos, los déficits hídricos, la disponibilidad de nutrientes en los suelos y el estrés
osmótico. Estas problemáticas han sido el centro de la atención de un gran número de
estudios a nivel fisiológico y bioquímico, los cuales se han enfocado a desentrañar las
diversas respuestas y los mecanismos celulares/moleculares que las plantas han
desarrollado ante los diversos tipos de estrés (Zhu, 2002). El primer evento de
adaptación vegetal ante cualquier tipo de estrés involucra la percepción del mismo y la
subsecuente transducción de la señal que permitirá a la planta adoptar las estrategias
metabólicas y fisiológicas necesarias para hacer frente a dichos retos, entre estas
respuestas se incluye la expresión transcripcional de genes responsivos al estrés
(Shinozaki et al., 2003). Diversos estudios han señalado que las respuestas de una
planta ante un estrés está gobernado por múltiples loci, esto hace mención del
carácter multigénico inherente de las plantas en respuesta a las condiciones de la
naturaleza (Tran et al., 2004).
La regulación transcripcional actúa como el primer controlador de los diversos
procesos celulares en las plantas, tales como la morfogénesis celular, las señales de
transducción y las respuesta a estrés ambiental (Riechmann et al., 2000). Aunque la
función de muchos genes permanece sin conocer, existen algunos como los factores
de transcripción (FT) que han sido descritos en una amplia variedad estudios a nivel
molecular en diversas especies de plantas (Tra et al., 2004).
Los Factores de Transcripción (FTs) son proteínas consideradas como reguladores
maestros de la transcripción, debido a que un solo FT puede controlar la expresión de
diversos genes a través de la unión específica de estos en los elementos en cis
encontrados en los respectivos promotores de los genes blanco (Nakashima et al.,
2009; Wray et al., 2003; Riechmann et al., 2000). Dichas proteínas se encuentran
agrupadas en familias con base en la similitud de sus secuencias, más frecuentemente
en el dominio de unión al ADN (DBD) por sus siglas en inglés DNA-binding domain
(Jensen et al., 2010). Los FT's desempeñan un rol importante en la regulación de la
expresión de genes en respuesta al estrés abiótico, por tal motivo son considerados
5
Introducción
como un poderoso blanco para la ingeniería genética en la tolerancia al estrés debido
a que la sobreexpresión de estos puede desencadenar la regulación de un gran
número de genes en respuesta al estrés. Algunos de los FT's más importantes en
respuesta al estrés abiótico incluyen a los DREB1/CBF, DREB2, AREB/ABF, NAC y
MYC/MYB, los cuales han sido usados para mejorar la tolerancia al estrés abiótico en
una gran variedad de plantas (Nakashima et al., 2009)
Hasta la fecha, han sido identificadas más de 60 diferentes familias de FT's en plantas
basados en análisis bioinformáticos (Zhang et al., 2011). Un ejemplo de la enorme
diversidad de estas secuencias es el genoma de Arabidopsis que codifica por lo
menos 1550 FT's, representando un 6.2% del número total de genes estimados
(AtTFDB, 2011). En cuanto a Populus, se ha encontrado que un 6.4% de su genoma
codifica para más de 2900 FT's (Riano-Pachon et al., 2007; Tuskan et al., 2006). Por
lo tanto, la identificación y caracterización funcional de los FT's es esencial para la
reconstrucción de las redes de regulación transcripcional y el entendimiento de los
mecanismos adaptativos de las plantas frente a un entorno cada vez más cambiante
(Riano-Pachon et al., 2007).
6
Capítulo I
CAPÍTULO I
1.1 ANTECEDENTES
1.1.1 ESTRÉS ABIÓTICO
1.1.1.1 SEQUÍA
La disponibilidad de agua es obviamente el agente selectivo más significativo dentro
de las poblaciones vegetales en la naturaleza. El entendimiento de las bases
genéticas y fisiológicas de la adaptación a la sequía, es por lo tanto de vital
importancia para comprender la evolución de las especies silvestres, así como para
mejorar los cultivos vegetales. Arabidopsis, como otras plantas, posee tres
mecanismos para hacer frente al estrés por sequía: 1) El escape de la sequía, el cual
permite a la planta reproducirse y dejar su descendencia antes de que el ambiente se
vuelva seco, probablemente una estrategia de vida (Chávez et al., 2003). 2) Evitar la
deshidratación, se refiere al ajuste del crecimiento con el fin de evitar perturbaciones
fisiológicas internas. Durante la sequía, las plantas cierran sus estomas para evitar la
pérdida de agua, y alargan sus raíces para poder captar más agua. La mayoría de las
plantas evitan la deshidratación mediante este mecanismo primario, que involucra la
regulación de la conductancia estomática con el fin de mantener un estado interno de
agua favorable (Ludlow et al., 1989). Sin embargo, los estomas son usados en la
respiración, y las plantas bajo estrés por sequía, necesitan encontrar un balance con el
fin de mantener una asimilación residual de carbono y subsecuentemente poder
crecer. 3) La tolerancia a la deshidratación varía con respecto al genotipo y la
habilidad de sus tejidos para soportar la deshidratación, algunas veces mediante la
acumulación de metabolitos como la prolina y la glicina betaína, con el fin de mantener
la integridad y la homeostasis celular. Esta clase de mecanismo es bastante teórico,
ya que las plantas experimentan una variedad de tensiones como resultado de la
combinación de factores estresantes, lo que da a lugar múltiples y complejos ajustes
internos (Lefebvre et al., 2009).
Durante el proceso de respuesta de las plantas al estrés por sequía, una gran cantidad
de genes son inducidos. Estos genes se clasifican en dos grandes grupos de acuerdo
a su modo de funcionamiento. El primer grupo comprende genes que codifican para
proteínas estructurales, los cuales son los efectores dentro de la señalización en
respuesta al estrés, como es el caso de los genes de osmorregulación, proteínas
antioxidantes, acuaporinas y proteínas LEA (Late Embryogenes Abundant; Wang et
7
Capítulo I
al., 2006). El segundo grupo consiste en genes que codifican para proteínas
reguladoras, que son activadores transcripcionales de respuesta temprana, en las
cuales se incluyen los factores de transcripción y las proteínas cinasas.
Entre los principales factores de transcripción relacionados con el estrés se incluyen
las proteínas bZIP, WRKY, MYB y AP2/EREBP, las cuales han demostrado
desempeñar un rol importante en la regulación en la tolerancia a sequía (Song et al.,
2005). Las proteínas cinasas incluye a las CDPK's (calmodulin dependent protein
kinases), MAPK's (mitoge-activated protein kinases), RPK's (receptor protein kinases)
y las proteínas cinasas ribosomales, éstas se encuentran involucradas en la
amplificación de las señales en cascada, en respuesta a diferentes factores
estresantes (Ludwig et al., 2004). La expresión de genes inducibles por sequía puede
estar controlada por los sistemas de regulación dependientes o independientes de
ABA (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 2005). Existen varios mecanismos de
señalización cruzados (cross-talks) entre diversos tipos de estrés, tales como sequía,
estrés salino y estrés biótico (Huang et al., 2008).
Los cambios en la expresión transcripcional de genes bajo estrés por sequía, provocan
una serie de alteraciones fisiológicas y bioquímicas. La fotosíntesis, una de las rutas
biosintéticas primarias, es significativamente afectada por el estrés por sequía, el cual
restringe el funcionamiento normal de otras rutas metabólicas, tales como la fijación
del nitrógeno (Chaves et al., 2009). La ruta de la respiración, la cual cataboliza
moléculas complejas en compuestos más simples, para proveer de la energía
requerida para el desarrollo de las plantas, es acelerada bajo condiciones de estrés
(Haupt-Herting et al., 2001). Los sistemas de protección tales como las rutas
antioxidantes, las cuales pueden proteger a las células vegetales mediante la
eliminación de especies reactivas de oxígeno (ROS por sus siglas en inglés Reactive
Oxygen Species), son afectadas por la sequía (Apel y Hirt, 2004).
1.1.1.2 TEMPERATURAS
Debido a que las plantas son organismos sésiles, se encuentran expuestas a un gran
número de estreses, por lo cual necesitan estrategias para adaptarse a cada uno de
ellos. Uno de los estreses más comunes que enfrentan son las altas y bajas
temperaturas. La respuesta al choque térmico (heat-shock response) es una reacción
8
Capítulo I
causada por la exposición repentina de un organismo, tejido o célula a temperaturas
extremas, la cual es caracterizada por la expresión transitoria de proteínas de choque
térmico (HSPs, heat-shock proteins). Estas proteínas se encuentran involucradas en la
protección del organismo contra el estrés por calor y el mantenimiento de la
homeostasis (Koh, 2002). La inducción de estas proteínas depende de la temperatura
a la cual cada especie crece normalmente. En plantas superiores, las HSP son
generalmente inducidas por una corta exposición a temperaturas entre 38-40ºC.
Existen varios HSP de diferente tamaño molecular, pero todos ellos son caracterizados
por unirse a la estructura de proteínas inestables. Poseen funciones importantes,
como moléculas chaperonas, prevén la agregación de proteínas desnaturalizadas y
promueven la renaturalización de agregados de proteínas. Otro factor de importancia
es el incremento de las ROS durante el aumento y el descenso de las temperaturas.
En este proceso, existen seis enzimas encargadas de detoxificar a las ROS, la
superóxido dismutasa (SOD), la ascorbato peroxidasa (APX), la catalasa (CAT),
monodehidroascorbato reductasa (MDAR), dehidroascorbato reductasa (DHAR) y
glutatión reductasa (GR). Cuando la planta modelo Arabidopsis es sometida a bajas
temperaturas acumula grandes concentraciones de H2O2 en sus células, y las
actividades enzimática de APX y GR aumentan.
El efecto de la temperatura varía grandemente, desde el congelamiento hasta las altas
temperaturas. No se conoce mucho sobre las bases del mecanismo molecular de la
variación natural de la tolerancia a las bajas temperaturas, sin embargo tanto las
temperaturas bajas como el congelamiento, son dos factores relevantes que limitan la
distribución de las especies vegetales. El estrés por frío resulta en cambios en la
expresión de genes, cambios en la composición de los lípidos de la membrana, en la
acumulación de osmolitos compatibles, elevación transitoria de la concentración de
ABA y disminución del crecimiento. Las bajas temperaturas de igual forma imponen un
estrés por deshidratación, debido a la baja absorción y transporte de agua por parte de
las raíces (Smallwood et al., 2002)
1.1.1.3 SALINIDAD
La salinidad de los suelos es un suceso natural anterior a la civilización humana, hoy
en día sigue siendo uno de los principales tipos de estrés abiótico que afecta
severamente el crecimiento y desarrollo de las plantas, causando pérdidas en los
cultivos en todo el mundo (Jah et al., 2009).
9
Capítulo I
Los suelos salinos se caracterizan por su nivel de toxicidad debido principalmente a
los cloruros y a los sulfatos de sodio, aunque existen otro tipos de sales en menor
proporción; este problema se agudiza cada vez más debido al factor antropogénico y a
sucesos naturales como por ejemplo: 1) el uso de agua para riego de mala calidad, 2)
drenaje inadecuado de los canales de riego de los agroecosistemas, 3) entrada de
agua de mar durante los ciclones en las zonas costeras y 4) la acumulación de sal en
la zona de las raíces en las regiones áridas y semi-áridas debido a la alta demanda de
evaporación y lixiviación insuficiente de los iones, debido a las escasas lluvias
(Chinnusamy y Jian-Kang, 2003). La producción alimentaria en aumento es el principal
factor de presión ejercido sobre los recursos de la tierra, lo que acentúa la degradación
de los suelos. De acuerdo al laboratorio de salinidad USDA (United State Department
of Agriculture), un suelo salino se define como aquel que presenta 40 mM de NaCl o
más. Muchos cultivos de granos y vegetales como las glicofitas son altamente
susceptibles a los suelos salinos. Existen diferentes umbrales de tolerancia y
diferentes tasas de reducción de los cultivos indicando una variación en los
mecanismos de tolerancia a sal entre especies cultivables (Witcombe et al., 2007).
La salinidad es perjudicial para el desarrollo de las plantas, ya que restringe la
captación de nutrientes a través de la raíz y la absorción de fósforo, potasio, nitrato de
calcio (Flowers y Colmer, 2008), causa una severa citotoxicidad debido a la presencia
de iones sodio, cloro y sulfatos, aunado al estrés osmótico al que se encuentra
sometida la planta. El sodio desplaza al potasio en el interior celular y altera la
homeostasis enzimática en el
citoplasma, donde más de 50 enzimas utilizan el
potasio para su activación. Además, está molécula puede penetrar la capa de
hidratación de las proteínas e interferir con las interacciones no covalentes entre
aminoácidos, llevando a cambios conformacionales y pérdida de la función de las
proteínas, ocasionando la reducción de la asimilación del CO2, reducción de la
conductancia estomatal, daño a los fotosistemas, cambios en los contenidos de
clorofila, lo que conlleva a un desequilibrio metabólico dando lugar a un estrés
oxidativo. Se estima que la salinidad afecta el nivel transcripcional en un promedio del
8% de todos los genes (Smethurst et al., 2009).
10
Capítulo I
El estrés salino frecuentemente es acompañado por la deshidratación y el estrés
osmótico. El bajo nivel osmótico reduce la captación de agua por la planta, resultando
en sequía fisiológica (Lefebvre et al., 2009).
1.1.2 SISTEMAS DE REGULACIÓN DE LA EXPRESIÓN GÉNICA ANTE
ESTRÉS ABIÓTICO
Existen al menos cuatro sistemas de regulación a nivel transcripcional para la
expresión génica, en respuesta al estrés abiótico en Arabidopsis, entre éstos se
encuentran dos vías independientes del ácido abscísico (ABA) y otras dos
dependientes de ABA (Shinozaki and Yamaguchi-Shinozaki, 2000). En la vía
independiente de ABA, se encuentra el elemento en cis conocido como "Dehydrationresponsive element/C-repeat" (DRE/CRT), el cual actúa en respuesta al frío y la alta
salinidad, controlando los niveles transcripcionales de genes involucrados ante dichos
procesos. Otros regulador transcripcional son las proteínas MYC y MYB las cuales son
activadoras en uno de los sistemas de regulación dependientes de ABA (Abe et al.,
2003) al igual que las proteínas "ABA-responsive element-binding protein/ABA-binding
factor" (AREB/ABF's) (Uno et al., 2000).
El sistema de regulación menos entendido es el independiente de ABA, el cual
interviene en la activación de genes que no responden ante la acumulación endógena
o aplicación exógena de ABA, tales como el gen erd1, que codifica un proteína
homóloga a la subunidad de unión al ATP de la clp ATP-dependent protease de
Escherichia coli (Nakashima et al., 1997). Estudios realizados por Tran et al., (2004)
en la secuencia promotora de erd1, señalaron la presencia de un tipo de FT's que
regula la expresión del gen, dicho factor posee un dominio característico encontrado
en la familia multigénica de FT's NAC los cuales son
específicos en plantas
(Riechmann et al., 2000).
1.1.3 FACTORES DE TRANSCRIPCIÓN INVOLUCRADOS EN RESPUESTA
A ESTRÉS ABIÓTICO
Las respuestas ante el estrés abiótico requieren de la producción de proteínas
metabólicas, como las que participan en la síntesis de osmoprotectores y proteínas
reguladoras que operan en las vías de transducción de señales, tales como cinasas y
factores de transcripción. Dado a que la mayoría de las respuestas implica un control
11
Capítulo I
de la expresión génica, los FT's desempeñan un rol importante en la respuesta al
estrés abiótico (Chaves y Oliveira, 2004). Los FT's son proteínas específicas, que
poseen un dominio capaz de interaccionar con los elementos en cis presentes en las
cajas promotoras de los genes, estos inducen (activan) o reprimen la actividad de la
ARN polimerasa, por lo tanto regulan la expresión de sus genes "blanco". Los factores
de transcripción pueden ser agrupados en familias de acuerdo a su dominio de unión
al ADN (Riechmann et al., 2000). Un grupo de genes controlado por cierto tipo de FT's
es conocido como regulón. En respuesta a estrés abiótico en plantas se han
identificado por lo menos cuatro tipos diferentes de regulones (Figura 1.1): (1) el
regulón CBF/DREB, (2) el regulón NAC (NAM, ATAF y CUC) y ZF-HD (zinc-finger
homeodomain), (3) regulón AREB/ABF (ABA-responsive element-binding protein/ABAbinding
factor)
y
el
regulón
(4)
MYC
(myelocytomatosis
oncogene)/MYB
(myeloblastosis oncogene). (Saibo et al., 2009).
Figura 1.1 Cascada de señalización en respuesta a estrés abiótico. Los factores
de transcripción son mostrados dentro cajas de color (Shinozaki y YamaguchiShinozak i., 2007).
12
Capítulo I
1.1.4 EL REGULÓN NAC
La vía dependiente de ABA se dio a conocer cuando se observó que el transcripto del
gen ERD1 (Early responive to dehydration stress 1) se acumulaba antes de cualquier
incremento de ABA, en respuesta a deshidratación o salinidad, sugiriendo la presencia
de una vía independiente de ABA (Nakashima et al., 1997). El análisis del promotor
ERD1 reveló la presencia de FT's pertenecientes a la familia NAC y ZF-HD los cuales
son esenciales para la activación del gen ERD1 (Tran et al., 2007). En un estudio
propuesto por Hu et al., en 2006, se aisló el gen responsivo a sequía SNAC1 (Stressresponsive NAC1) de una variedad de arroz de tierras altas y fue sobreexpresado en
otra variedad de tierras bajas. Cuando se comparó la planta transformada con la
planta de arroz silvestre de tierras bajas, la que sobreexpresaba SNAC1 mostró
tolerancia a sequía en la antesis, y tolerancia a la sequía y a la salinidad en el estado
vegetativo. Dichas plantas no mostraron el fenotipo enano esperado, como las que
sobreexpresan CBF/DREB1 (Ito et al., 2006) revelando un mecanismo diferente ante
el estrés.
Las proteínas con el dominio característico NAC (NAM, ATAF1/2 y CUC2)
comprenden una de las familias más grandes de FT's específicos para plantas,
representados por 105 genes en Arabidopsis (Ooka et al., 2003), 140 genes en arroz
(Fang et al., 2008) y 101 genes en el genoma de soya (Pinheiro et al., 2009). Dichos
factores de transcripción poseen un dominio N-terminal conservado, el cual es
nombrado como dominio NAC, que comprende cerca de 160 aminoácidos (aa) el cual
se encuentra dividido en 5 subdominios (A-E) (Figura 1.2); los subdominios A, C y D
se encuentran altamente conservados entre las proteínas NAC de diversos
organismos, mientras que los subdominios B y E presentan mayor variabilidad (Ooka,
2003; Kikuchi et al., 2000). Dentro del dominio NAC se encuentra una región de 60
a.a. conteniendo un único doblez en todo el factor de transcripción, que forma una
doble trenza unida por algunos elementos helicoidales (Duval et al., 2002). Dicho
dominio ha sido implicado en la señalización de localización nuclear, en la unión al
ADN y en la formación de homodímeros o heterodímeros con otras proteínas con
dominio NAC (Jensen et al., 2010; Ernst et al., 2004). Diversos estudios realizados en
Arabidopsis señalan la existencia de por lo menos cinco diferentes secuencias blanco
de unión al ADN de dichos FT's, la primera de ellas es la "Secuencia de
Reconocimiento en Respuesta a sequía NAC (NACRS)" la cual contiene el motivo
central CACG; el segundo sitio de unión es el "Motivo en Respuesta a Deficiencias fe
13
Capítulo I
Hierro IDE2" con la secuencia central CA(A/C)G(T/C)(T/C/A)(T/C/A); el sitio de unión
CBNACBS "Unión a Calmodulina" con la secuencia central GCTT; el "Elemento de
unión NAC de pared secundaria SNBE" el cual posee
el motivo de 19 pb
(T/A)NN(C/T) (T/C/G)TNNNNNNNA(A/C)GN(A/C/T) (A/T); y por último la secuencia de
21 pb del promotor 35S (283-263) conteniendo dos secuencias centrales, CGTA y
CGTC. En contraste, la región C-terminal de los FT's NAC poseen secuencias
altamente variables difíciles de agrupar (Olsen et al., 2005; Kikuchi et al., 2000), éstas
les confieren la capacidad de regular una amplia gama de funciones celulares
mediante la activación o represión de la actividad transcripcional (Figura 1.3)
(Yamaguchi et al., 2008; Hegedus et al., 2003; Xie et al., 2000).
Figura 1. 2 Esquema de la estructura de un factor de transcripción NAC. La región del dominio
de unión al ADN está contenida en los subdominios D y E. La región TAR (Región de
activación transcripcional) se encuentra en el C-terminal de las proteínas de la familia NAC.
N-terminal extendida
VOZ
TAR
Dominio NAC
Zinc F
Tandem
TAR
Dominio NAC
Dominio NAC
Dominio NAC
Figura 1.3 Representación esquemática de las principales estructuras de las proteína NAC
(Ooka et al., 2003). Las barras grises indican el dominio N-terminal NAC. Proteínas VOZ con un
dedo de zinc indicado como (Zinc F).
14
Capítulo I
1.1.4.1 PROCESOS EN LOS QUE SE ENCUENTRAN INVOLUCRADAS LAS
PROTEÍNAS NAC
Las proteínas NAC se encuentran implicadas en una amplia gama de procesos de
desarrollo vegetal, tales como, la formación del meristemo apical (Nikovics et al.,
2006), la morfogénesis floral (Sablowski y Meyerowitz, 1998), el desarrollo de raíces
laterales (He et al., 2005), la senescencia de las hojas (NAP) (Balazadeh et al, 2010),
la inducción de la floración por estrés (Kim et al., 2007), el desarrollo del embrión
(Duval et al., 2002), el control del ciclo celular (Kato et al., 2009), la señalización
hormonal (Jensen et al., 2008), la movilización de nutrientes en semilla (Waters et al.,
2009) y en la determinación del patrón de ramificación (Mao et al., 2007).
Particularmente, un gran número de FT's NAC se encuentran implicados en respuesta
a distintos tipos de estrés abiótico, tales como sequía, salinidad, altas temperaturas y
estrés por frío (ANAC019, ANAC055 y ANAC072); por otro lado, se ha comprobado la
participación de algunos de éstos FT's NAC en diversos tipos de estrés biótico, tales
como daño mecánico e infecciones virales (Wang et al., 2009; Lu et al., 2007). El gen
ANAC019, de acuerdo a varios estudios de expresión transcripcional, se encuentra
implicado en la respuesta a diversos tipos de estrés (Greve et al., 2003) la
sobreexpresión de este gen causa un incremento en la tolerancia a la sequía (Tran et
al., 2004). Además de esta respuesta ante el estrés abiótico, se ha demostrado que
ANAC019 responde ante el ataque de hongos mediante vías de señalización
relacionadas con la hormona vegetal ácido jasmónico (Bu, et al., 2008).
Recientemente Bu et al., (2009), demostraron que ANAC019 interacciona con RHA2a
los cuales responden como un nuevo regulador positivo en la señalización de la
hormona ABA. Otro gen perteneciente a la familia NAC es ATAF1 o ANAC002, uno de
los primero genes en ser descritos para esta familia. ATAF1 posee un rol distinto
debido a que actúa como un regulador negativo en respuesta a sequía, ya que
experimentos llevados a cabo con mutantes de Arabidopsis (ataf1) revelaron altos
niveles transcripcionales de genes responsivos al estrés inducido por sequía, incluidos
los genes COR47 (también conocido como RD17), ERD10, KIN1, RD22 y RD29
(COR78 o LT178, Lu et al., 2007).
Recientemente, se ha visto que algunos FT's NAC desempeñan un papel fundamental
en la xilogénesis (formación del xilema), en la formación de fibras y en la formación de
la madera en plantas vasculares (Mitsuda y Ohme-Takagi, 2008; Ko et al., 2007). En
15
Capítulo I
Arabidopsis, se han identificado algunos subgrupos de proteínas NAC, tales como
NST1/ANAC043
(NAC
NST2/ANAC066,
y
secondary
NST3/SND1
Wall
Thickening
(Secondary
Promoting
Wall-associated
NAC
Factor-1),
Domain
Protein)/ANAC012, los cuales actuan como controles maestros de la transcripción
(master switches) en la biosíntesis de la pared secundaria (Zhong et al., 2007). Otro
subgrupo de proteínas NAC son las VND6 y VND7 (Vascular-related NAC-Domain)
que han sido propuestas como reguladoras en la formación de vasos vasculares en
Arabidopsis (Yamaguchi et al., 2008); dichas proteínas regulan la diferenciación del
metaxilema y el protoxilema en raíces primarias (Kubo et al., 2005). Un tercer
subgrupo de proteínas NAC, son las XND1/ANAC104 (Xylem NAC Domain 1) que se
encuentran involucradas en la diferenciación de elementos traqueales y en el
desarrollo del xilema en Arabidopsis, mediante regulación negativa de la biosíntesis de
la pared secundaria y de la muerte celular programada en vasos del xilema. Aunque
un buen número de FT's NAC han sido caracterizados funcionalmente en Arabidopsis
y en arroz, como se señala en la tabla 1.1, la función de la mayoría de los miembros
de la familia NAC es aún desconocida (Hu et al., 2010).
16
Capítulo I
Tabla 1. 1 Plantas genéticamente modificadas con Factores de Transcripción NAC para
conferir tolerancia a estrés abiótico
Planta transgénica
Gen/Procedencia
Arabidopsis
Referencia
Hu et al., (2006)
SNAC1/Arroz
Tolerancia a Salinidad
ORS1/Arroz
Control
de
senescencia
OsNAC10/Arroz
Tolerancia a sequía
Jeong et al., (2010)
SNAC2/Arroz IRA109
Tolerancia a salinidad y
Frío
Hu et al., (2008)
OsNAC5/Arroz
Tolerancia a Salinidad y
Sequía
Song et al., (2011)
NTL8
(NAC)/Arabidopsis
Señalización
en
salinidad mediada por
GA
Kim et al., (2008)
ONAC063/Arroz
Tolerancia a Salinidad y
a estrés osmótico
Yokotani et al., (2009)
GmNAC20/Glycine max
Tolerancia a Salinidad
Hao et al., (2011)
GmNAC11/Glycine max
Tolerancia a Salinidad
Hao et al., (2011)
Respuesta a salinidad
Yang, et al., (2011)
SlNAC3/ Tomate
Tolerancia a Salinidad y
Sequía
Han et al., (2011)
CsNAC1/Citrus
Tolerancia
abiótico
De Oliveira et
al.,(2011)
DgNAC1/Chrysanthemu
m
Tolerancia a Salinidad
Arroz
Arabidopsis y Arroz
Fenotipo de la
planta transgénica
la
Balazadeh, et al.
(2011)
SlNAC1/Tomate
Solanum tuberosum
SlNAM1/ Tomate
Solanum lycopersicum
Citrus
Tabaco
a
estrés
Liu et al., (2011)
1.1.5 PLANTAS USADAS COMO MODELOS EXPERIMENTALES EN
BIOLOGÍA MOLECULAR
Una de las plantas dicotiledóneas más importantes dentro de los estudios molecuares
es Arabidopsis thaliana, esto debido a que su genoma ha sido completamente
secuenciado y existen un gran número de líneas mutantes. Cerca de 28,000 genes
han sido predichos a partir de la secuenciación, pero solamente se conoce la función
biológica de la mitad de ellos (Ooka, et al, 2003). La secuenciación del genoma de
Arabidopsis fue la primera en completarse para plantas en el año 2000, trayendo
17
Capítulo I
consigo nuevas perspectivas en la genética de las plantas superiores. Posee un
genoma pequeño (220Mb en cinco cromosomas), es de vida corta (2-3 meses en
invernadero), genera una gran descendencia en cada generación (más de 10,000
semillas por planta), y presenta autopolinización. Todo esto ha hecho de esta pequeña
planta, perteneciente a las Brassicaceae, uno de los modelos favoritos en la genética
molecular y en la biología celular del desarrollo. En los últimos 15 años, se ha creado
una gran colección de líneas mutantes por inserción, lo cual ha facilitado la asociación
de un cierto fenotipo con la función de un solo gen interrumpido. Más recientemente,
Arabidopsis se ha convertido en una especie modelo para la biología evolutiva
(Lefebvre et al., 2009).
Por otro lado, Nicotiana tabaccum y N. benthamiana han servido como modelo
experimental desde hace más de 20 años. Esta última posee características únicas al
ser susceptible a una gran número de virus (>500), incluso aquellos que solamente
afectan a plantas monocotiledóneas (Dasgupta et al., 2001). Dichas plantas se han
ubicado en la categoría de "plantas modelo" por la facilidad y rapidez de evaluar y
modular la expresión de transgenes en plantas superiores mediante ingeniería
genética (Voinnet et al., 2003). N. tabaccum y N. benthamiana son susceptibles a una
gran variedad de cepas desarmadas de A. tumefaciens y el sistema de transformación
dispone de una amplia gama de agentes de selección diferentes a kanamicina (Fraley
et al., 1983). Tabaco posee una regeneración prolífica a partir de discos foliares,
mediante la organogénesis indirecta. Por otra parte, el tamaño de las semillas y la
cantidad producida por evento permite monitorear la segregación en placas petri,
puede ser acumulada suficiente biomasa a partir de una sola planta y puede de igual
forma ser propagada clonalmente, autopolinizada y es de fácil entrecruzamiento
manual. Por estas razones, el tabaco es considerada como una valiosa herramienta en
la genómica funcional (Bendahmane et al., 2000).
1.1.6 Carica papaya
Por otra parte, la planta de papaya es un sistema excepcional para el estudio y
exploración de genomas de árboles tropicales y frutales, posee un genoma diploide
relativamente pequeño de 372 Mb, agrupado en 9 cromosomas, con un porcentaje de
GC del 35.3%. El 52% de su genoma está compuesto por regiones repetitivas largas
conocidas como retrotransposones. De acuerdo a estudios citogenéticos 65-70% se
compone de eucromatina y el 35-30% restante de heterocromatina. La Papaya posee
24,746 genes predichos con un promedio de 1,057 pb, 9,760 se catalogan como
18
Capítulo I
genes únicos, de los cuales 6,845 genes poseen un promedio de 309 pb, de los cuales
no ha sido reportada asociación alguna dentro las bases de datos de proteínas no
redundantes. De igual modo, se han predicho para papaya un total de 27,873
proteínas codificantes. Por otro lado, la papaya posee un número mucho menor de
genes en comparación con otras plantas, posee un 11-20% menos que Arabidopsis
thaliana, un 34% menor que arroz (Oryza sativa japonica) y un 19% menor que la vid
(Vitis vinifera), siendo hasta el momento la planta secuenciada con el menor número
de genes. En una comparación entre cinco especies secuenciadas (Arabidopsis
thaliana, Carica papaya, Populus trichicarpa, Oryza sativa y Vitis vinifera), todas las
proteínas inferidas se colapsaron en 39,709 grupos similares, y en una comparación
entre Arabidopsis y papaya se encontró que 3,595 grupos de los 6,726 compartidos,
poseían el mismo número de genes. Para el resto de los grupos, Arabidopsis superó
en número a papaya en una relación de dos a uno, siendo ésta una tendencia con las
demás plantas comparadas, teniendo en común solamente 13,311 genes compartidos
de entre los 39,709 grupos colapsados. (ASGPB, 2011; Ming et al., 2008), Por otro
lado, papaya posee un sistema de transformación genética bien establecido, un ciclo
de vida corto (9-15 meses), una floración continua durante todo el año y un sistema
primitivo de cromosomas sexuales. Esta planta requiere de una pluviometría media de
1.800 mm anuales y una temperatura media anual de 20 a 22 ºC, puede resistir fríos
ligeros, pero si no tiene las condiciones ambientales óptimas no se desarrolla y los
frutos no maduran. La papaya ocupa el primer lugar en las puntuaciones de nutrición
de entre 38 frutos comunes (FAO 2009) y posee una gran versatilidad en cuanto a sus
usos, tanto así que para el año 2014 en México se sembró una superficie total de
16,055.52 ha con una producción de 836,370.48 Ton (SAGARPA, 2014).
19
Capítulo I
1.2 JUSTIFICACIÓN
Las plantas, en el transcurso del tiempo, han desarrollado estrategias que les han
permitido adaptarse y permanecer ante situaciones adversas que el medio ambiente
les ha impuesto, como es el caso de los diferentes tipos de estreses bióticos y
abióticos. Muchas de las las estrategias que las plantas han implementado, no han
sido suficientes para lograr la tolerancia ante las condiciones ambientales cada día
más severas. Dentro de estas especies vegetales se encuentran aquellas de gran
importancia para el hombre, como es el caso de los cultivos. Durante las últimas
décadas, alrededor de todo el mundo, la productividad de los cultivos se ha visto
mermada hasta en un 70% debido a los diferentes tipos de estrés abiótico, aunado al
cambio climático ocasionado por acción del hombre. En las plantas un gran número de
genes son regulados en respuesta a estrés abiótico. Estudios moleculares dan evidencia del
papel fundamental que desempeñan los FT's en la regulación de la expresión génica en
respuesta al estrés, motivo por el cual son un blanco de la ingeniería genética. Al día de
hoy, no existen estudios de la función que desempeñan los FT's de la familia NAC en
papaya; dicho conocimiento es fundamental para el mejoramiento genético de plantas
cultivadas en un medio ambiente cambiante cada vez más extremoso, aunado a la
creciente demanda de producción de alimentos a nivel mundial. Por tales motivos, en
este estudio se llevó a cabo la identificación y caracterización molecular de FTs de la
familia NAC en Carica papaya involucrados en respuesta estrés abiótico.
20
Capítulo I
1.3 HIPÓTESIS
Existen evidencias moleculares y bioquímicas sobre la participación de los Factores de
Transcripción NAC en respuesta a distintos tipos de estrés abiótico; por lo tanto, se
espera que miembros de esta familia de proteínas de Carica papaya cv. Maradol,
estén involucrados en dicha respuesta y la sobreexpresión de estas secuencias en la
planta modelo Nicotiana tabaccum, le confieran tolerancia ante diversos tipos de
estrés abiótico.
1.4 OBJETIVOS
1.4.1 OBJETIVO GENERAL
Determinar la funcionalidad de factores de transcripción NAC de C. papaya cultivar
Maradol, involucrados en respuesta a estrés abiótico.
1.4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS

Realizar una reconstrucción filogenética de la familia de FT NAC en
Angiospermas.

Determinar mediante análisis in silico, secuencias NAC dentro el proteoma de
Carica papaya cultivar Maradol, con una posible participación en procesos
moleculares en respuesta a estrés abiótico.

Determinar la expresión transcripcional de genes NAC en respuesta a
diferentes
tipos
de
estrés
abiótico
en
C.
papaya
mediante
PCR
semicuantitativa.

Evaluar plantas Intragénicas de N. tabaccum que sobreexpresan genes NAC
de C. papaya involucrados en respuesta a estrés abiótico.
21
Capítulo I
1.5 DISEÑO EXPERIMENTAL DE LA INVESTIGACIÓN
La estrategia experimental de este trabajo se resume en la Figura 1. 4
Identificación y caracterización molecular de factores de transcripción de la familia NAC
involucrados en respuesta a estrés abiótico en Carica papaya, L. cultivar. Maradol.
Muestra
Genes NAC de Carica papaya L.
Diseño del estudio
Análisis bioinformático de la familia de genes NAC en diferentes especies vegetales
Extracción de ARN y síntesis de ADNc de plantas
sometidas a diferentes tratamientos de estrés Abiótico
Diseño de
oligonucleótidos
específicos
Análisis de expresión de genes candidatos mediante
PCR semicuantitativo
Clonación y secuenciación de genes de interés
Transformación genética de plantas de N. tabacum
con genes NAC
Fenotipicación de plantas intragénicas ante diversos
tratamientos de estrés abiótico
22
Capítulo I
1.6 REFERENCIAS
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33
Capítulo I
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34
Capítulo II
CAPÍTULO II COMPARATIVE GENOMICS OF NAC TRANSCRIPTIONAL
FACTORS IN ANGIOSPERMS: IMPLICATIONS FOR THE ADAPTATION
AND DIVERSIFICATION OF FLOWERING PLANTS
Alejandro Pereira-Santana1, Luis David Alcaraz3, Enrique Castaño2, Lenin SanchezCalderon4, Felipe Sanchez-Teyer1, and Luis Rodriguez-Zapata1*
1
Unidad de Biotecnología, Centro de Investigación Científica de Yucatán, Mérida,
Yucatán, México.
2
Unidad de Bioquímica y Biología Molecular de Plantas, Centro de Investigación
Científica de Yucatán, Mérida, Yucatán, México.
3
Departamento de Ecología de la Biodiversidad, Instituto de Ecología, Universidad
Nacional Autónoma de México, México, D.F., México.
4
Laboratorio de Biología Molecular de Plantas, Unidad Académica de Ciencias
Biológicas, Universidad Autónoma de Zacatecas, Zacatecas, Zacatecas, México.
* Corresponding author
E-mail: lcrz@cicy.mx (LRZ)
PLoS ONE (10)11: e0141866
DOI 10.1371/journal.pone.0141866
35
Capítulo II
2.1 ABSTRACT
NAC proteins constitute one of the largest groups of plant-specific transcription factors
and are known to play essential roles in various developmental processes. They are
also important in plant responses to stresses such as drought, soil salinity, cold, and
heat, which adversely affect growth. The current knowledge regarding the distribution
of NAC proteins in plant lineages comes from relatively small samplings from the
available data. In the present study, we broadened the number of plant species
containing the NAC family origin and evolution to shed new light on the evolutionary
history of this family in angiosperms. A comparative genome analysis was performed
on 24 land plant species, and NAC ortholog groups were identified by means of
bidirectional BLAST hits. Large NAC gene families are found in those species that have
experienced more whole-genome duplication events, pointing to an expansion of the
NAC family with divergent functions in flowering plants. A total of 3,187 NAC
transcription factors that clustered into six major groups were used in the phylogenetic
analysis. Many orthologous groups were found in the monocot and eudicot lineages,
but only five orthologous groups were found between P. patens and each
representative taxa of flowering plants. These groups were called basal orthologous
groups and likely expanded into more recent taxa to cope with their environmental
needs. This analysis on the angiosperm NAC family represents an effort to grasp the
evolutionary and functional diversity within this gene family while providing a basis for
further functional research on vascular plant gene families.
Keywords: NAC transcription factors, Angiosperms, basal orthologous groups (BOG),
Whole-Genome Duplication (WGD)
36
Capítulo II
2.1 INTRODUCTION
Environmental abiotic stresses, such as water deficit, soil salinity, and extreme
temperatures, have adverse effects on the growth, development, and grain yields of
crops worldwide [1, 2]. To cope with these stresses, land plants have developed
molecular mechanisms to protect cellular activities and maintain plant integrity [3].
Transcriptional control under environmental stresses plays a major role in plant
adaptation. During abiotic stress, many transcription factors (TF) are involved in the
induction of stress-responsive genes that play important roles under stress conditions
such as drought, cold, heat, soil salinity, and flooding. Among the proteins involved in
abiotic stress responses are the AP2/ERF [4, 5, 6], ABF [7, 8], HSF [9], bZIP [7, 10],
MYB [11], NAC [12, 13, 14], and the WRKY families [10, 15].
NAC proteins constitute one of the largest groups of plant TFs. They are ubiquitously
expressed across plant organisms and are known to participate in various
developmental processes and stress responses. The NAC acronym is derived from
three genes that were initially discovered to contain a particular domain (the NAC
domain): NAM (no apical meristem), ATAF1/2 (Arabidopsis transcription activator factor
1/2) and CUC2 (cup-shaped cotyledon, [16, 17]). Typically, the NAC family contains a
highly conserved NAC DNA-binding domain located in the N-terminal region and
consists of approximately 150-160 amino acids divided into five sub-domains (A-E)
encoding a twisted β-sheet surrounded by a few helical elements [18]. The C-terminal
domain contains the transcriptional activation region (TAR), which is non-conserved
among plants and can act as either a transcriptional activator or repressor [19, 20]. In
many cases, NAC TFs are inactively stored in the cytoplasm and translocated into the
nucleus after stimulation. The NAC's TAR contains transmembrane motifs (TMM) that
help anchor the protein to the plasma membrane and provide an efficient method for
gene regulation, which is an adaptive strategy that allows for prompt responses to
environmental changes [21, 22, 23]. NAC TFs play several essential roles in plant
development [24], senescence [25], auxin signaling [26], floral time control [27], floral
morphogenesis [28, 29], lateral root development [26], nutrient mobilization [30], leaf
margin development [31], fruit ripening [32], longevity control [33], embryo development
[34], postembryonic shoot meristem formation [35], organ boundary formation [35], leaf
movement [36], vascular element formation [37], and tolerance to multiple biotic [38,
39] and abiotic stresses [25, 26, 27, 40, 41], and so on. Although NAC TFs have been
characterized and described in several plants species, such as Arabidopsis [19],
37
Capítulo II
populus [42], citrus [43], rice [19], and barley [44] (ranging from 16-289 NAC
sequences [45]), a systematic classification is still lacking, and genome-wide analysis
of this gene family keeps being applied within the plant lineage.
Polyploidy or whole-genome duplication (WGD) is now recognized as a major
evolutionary force in angiosperm genome development [46]. In fact, researchers have
long recognized that polyploidy is an inseparable part of angiosperm biology. Over
time, polyploids may become diploidized, such that they behave like diploids at the
cytogenetic and genetic levels [47]. Given this genome duplication trend, the genome
conservation in terms of gene number and chromosomal organization is astonishing.
After the duplication of all genes by the WDG process, redundant copies get lost
(fractionation), retained, or fixed with modified functional properties in contrast to the
original genes. Therefore, the gene family size can vary greatly between species due to
the number of WGD events that their genomes have experienced through evolution
[48, 49]. Despite the relatively recent origin of angiosperms during the Early
Cretaceous period ~130 to >385 million years (MYr) ago, [50, 51, 52] land plant
evolution has become extremely diverse both in morphological and ecological terms.
Over the past 130 and 150 MYr, angiosperms have diversified to occupy all habitable
terrestrial and many aquatic environments [53].
The current knowledge regarding the NAC distribution in the plant lineage comes from
a relatively small sampling [1, 49, 54, 55]. To shed new light into the evolutionary
history of the NAC family in angiosperms, we broadened the number of plant species to
assess the origin and evolution of this family in the present study. We conducted a
comprehensive phylogenetic analysis through this lineage, and defined the orthologous
groups (OGs) between 24 green plant genomes in order to examine the groups that
were identified from the early-diverging plant Physcomitrella patens as an out-group
genome to inspect the species-specific expansion along the angiosperms lineage. Our
results revealed that an increased number of predicted NAC family members with
probable divergent functions are present in those species with more WGD events,
suggesting that a significant expansion of the NAC family occurred shortly before the
rapid radiation of flowering plants.
The lack of knowledge regarding the origin of the NAC family has impeded our
understanding of the evolution of this family across the history of plant development.
38
Capítulo II
Therefore, given our conception of the evolutionary history of the NAC family as part of
a much more diverse set of evolutionarily plants, we can update our knowledge of this
family and determine the expansion of this lineage over time. The main focus of this
work was to conduct a comparative genomics analysis of the NAC family across the
angiosperms.
39
Capítulo II
2.2 MATERIALS AND METHODS
2.2.1 NAC GENE FAMILY SEARCHES AND RETRIEVAL
A Hidden Markov Model (HMM) profile was constructed for the identification of new
members of the NAC TF family in flowering plants. The HMM profile was built using the
Plant Transcription Factor Database v3.0 [45], in which 436 NAC proteins were
predicted from five plants (O. sativa, V. vinifera, A. thaliana, S. moellendorffii, and P.
patens). Sequences were retrieved, and a multiple alignment was completed with
Clustal Omega [56]. Subsequently, the alignment was manually curated, and the
positions that contained gaps or missing data were not considered to build and
calibrate the HMM model by HMMER package (version 3.1; [57]). The model was
calibrated with the required cut-off values and was used to detect NAC sequences in
24 plant species. Gene models of the plant species analyzed in this study are shown in
S1 Table. The EMBOSS 3.0 suite [58] was used to manipulate the sequences. The
genome size and the ploidy level of each plant were obtained from published genome
data and the Plant DNA C-values database [59].
2.2.2 SEQUENCE ANALYSIS, MULTIPLE SEQUENCE ALIGNMENTS AND
EVOLUTIONARY MODEL TESTING
Amino acid sequences were subjected to a motif scan in the Pfam database v27.0 [60]
to confirm the presence of the NAC domain. All retrieved sequences were clustered
using the CD-HIT clustering program [61] with an identity cut-off of 0.7 in order to
exclude isoforms and reduce sequence redundancy. Multiple sequence alignments
were completed using MUSCLE [62] and were manually curated. They were then
tested with the ProtTest 2.4 statistical package [63] to find the best evolutionary model
for the maximum likelihood (ML) analysis. The MEME software [64] was used to
identify conserved motifs in the amino acid sequences of interest, with an occurrence
parameter for a single motif of “one per sequence” and the maximum number of motifs.
The TMHMM Server v. 2.0 (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/) was used to
predict the TMM for all retrieved NAC sequences. HMM logos of the NAC domain were
plotted with the Skylign tool [65] for each of the 24 plant species as well as for the
global set of all the NAC sequences. The amino acid alignments of the selected
sequences
were
visualized
using
BOXSHADE
v3.31C
(http://boxshade.sourceforge.net/).
40
Capítulo II
2.2.3 DEFINING ORTHOLOGOUS GROUPS (OGs)
We used a reciprocal best BLAST hits (BBH) approach [66, 67] to identify possible
orthologous groups among the 24 plant genomes. Significant hits were filtered
according to the following criteria: we retained all potential OGs where the BLASTP bitscore of the compared proteins was more than 200 and had sequence coverage of at
least 50% of their lengths [66]. Protein pairs were labeled as orthologs when both
sequences were each other's bi-directional best hit. Moss P. patens, a basal lineage of
land plants, was used as a reference outgroup to perform all the comparison analysis
and to establish the BBH approach. Additionally, O. sativa and V. vinifera NAC proteins
were used as reference sequences for analysis into monocot and eudicot species,
respectively [48]. Each NAC protein of P. patens was compared with the NAC protein
set of the basal Magnoliopsida (Vitis vinifera) and Liliopsida (Oryza sativa) species. On
the other hand, a BLASTP search was performed against Coccomyxa subellipsoidea,
Chlamydomonas reinhardtii, Ostreococcus lucimarinus, Cyanidioschyzon merolae
(http://www.phytozome.net,
[68]),
Cyanobacteria
(NCBI
taxid:1117),
and
Alphaproteobacteria (NCBI taxid:28211) to determine the origin of the NAC proteins. A
Venn diagram was created on R (v3.0.1; [69]) using the Vennerable package (https://rforge.r-project.org/projects/vennerable/).
2.2.4 EVOLUTIONARY ANALYSIS AND ANGIOSPERM TREE OF LIFE
The phylogenetic reconstructions were completed using RAxML v.8.0.26 suite [70] with
a JTT substitution model and 100 parametric bootstrap (BS) replicates. The gammadistributed rates were estimated from the dataset. The topology of the best-scoring tree
was visualized in FigTree v1.4 (http://www.molecularevolution.org) and PhyloWidget
(http://www.phylowidget.org, [71]). An evolutionary tree of the 24 plants used in the
analysis of the NAC proteins was constructed with the PhyloT tree generator
(http://phylot.biobyte.de/index.html) and manually corrected according to the APG III
[72] tree topology.
.
41
Capítulo II
2.3 RESULTS AND DISCUSSION
2.3.1 GENOME-WIDE IDENTIFICATION OF NAC GENES
We analyzed whole-genome sequences of algae and bacteria, and no sequences
containing the NAC domain were found. In early diverging plants, we identified 35 NAC
proteins in the moss P. patens used as an out-group, and seven of those sequences
contained a TMM, providing evidence of this basal mechanism in green plants.
However, no TMMs were found in the 20 predicted NACs of S. moellendorffii, the
earliest evolutionary branch of vascular plants for which genome information is
available. In contrast, studied flowering plants possess an average of 140 NAC genes,
with a minimum of 71 and a maximum of 288 genes, suggesting a lineage-specific
expansion into the NAC family shortly before the rapid radiation in Angiosperms history
[53, 73], likely due to the numerous WGDs that have occurred through the angiosperm
lineage [46, 74]. According to our results, the extent and nature of this expansion varies
between the different plant lineages. A total of 3,187 sequences were identified and
retrieved from 24 plant species (Fig. 1). These species included; 16 eudicots plants
(Class Magnoliopsida), 6 monocots (Class Liliopsida), one fern (Lycopodiopsida), and
a moss (Bryopsida). All identified NAC homologs host the expected NAM domain
(Pfam PF02365), while some contained additional domains. The complete list of NAC
proteins analyzed in this study, the additional annotation of each sequence, and the
sequences used in the phylogenetic analysis are available in S2 Table. A HMM LOGO
of the NAC domain was completed for each species to analyze the prevalence of
specific residues per lineage (S1 Fig).
42
Capítulo II
Fig. 1 Phylogenetic relationships among 24 land plant species and the distribution of
NAC proteins identified in this study, based on the HMM-generated profile. The total
number of NAC proteins identified in each genome; the plant genome size, ploidy and
chromosome number of each species; and the number of NAC sequences with
Transmembrane motifs (TMM) for each genome are indicated on the right in colored squares.
Ancient WGDs are represented by colored stars (details were taken from CoGepedia,
https://genomevolution.org). Species names are color-coded as follows: blue – Moss, purple –
pseudofern, red - monocots, and green - eudicots. *Genome size in Gb.
43
Capítulo II
The monocot lineage revealed a similar number of NAC sequences in the six analyzed
species, regardless of their genome size. Maize was found to contain the greatest
number of NAC sequences from the analyzed monocot species, with 186 NAC genes.
However, it also was found to contain an additional WGD event compared to the other
grass species. Regarding the TMM sequences, no correlation was found between the
number of these sequences and the genome size, as seen in the case of A. tauschii,
which only possesses three TMM sequences in a 4.3 Gb genome, and B. distachtion,
which has seven TMM sequences in a 0.27 Gb genome. The regulated activation of
preexisting dormant TFs by TMM is a versatile system for accurate stress signal
perception and transduction. It provides an efficient method for gene regulation and is
considered to be an adaptive mechanism in response to environmental changes [23,
75]. On the other hand, 43 of the 3,187 NAC sequences contained additional domains,
mainly in the C-terminal region (see S2 Table). The Ataus42 NAC sequence of A.
tauschii contained a zinc-binding motif in its reverse transcriptase domain (zf-RVT,
Pfam PF13966) and a Reverse transcriptase-like domain (RVT-3, Pfam PF13456) on
its C-terminus. The Zmays146 NAC sequence has four TMM helixes and an additional
motif called MatE, which is annotated as a Multi antimicrobial extrusion protein (Pfam
PF01554) and is involved in the detoxification of secondary metabolites including
alkaloids. This last mechanism is poorly studied in plant systems and can help us
understand how plants have evolved to cope with toxins in their environment [76, 77].
It is well known that eudicot plants have a smaller genome size than monocot plants;
nevertheless, we found that the number of NAC sequences was greater in the eudicot
lineage. In the case of the TMM sequences, we found a 1:2 ratio in the monocot plants
compared to the eudicot plants. In some cases, the TMM sequences further increased
for those species that experienced more WGD events, such as some rosid species
(e.g., apple tree, populus, and B. rapa).
A detailed study of genome size reveals a dynamic pattern of genome evolution. An
increase in the genome size occurred over the course of vascular plant development,
with an independent genome reduction in Selaginella and angiosperms and
subsequent increases within some groups of monocots [78]. Hence, there appears to
be a greater relative expansion of the NAC gene family (140:35:20) in the
spermatophyta (seed plants) compared to moss and fern species [79], demonstrating
that duplicated genes contributed to the expansion of large families in grapevine
44
Capítulo II
species. These duplications were produced by WGD and tandem, proximal,
retrotransposed, and DNA-based transposed duplications. In Arabidopsis, it has been
shown that several gene families have expanded by tandem duplication [80], retaining
many of their genes after WGD and transposition [81]. Each of these gene family
expansion modes creates paralogs that potentially duplicates the function of the
original gene. If retained, this functional duplication sets the stage for biased gene
expansion and subsequent subfunctionalization [82]. Some gene families in eudicot
plants are much larger, suggesting differential expansion (e.g., the NAC family in
Poplar is represented by 288 members, soybean by 246 sequences, and apple tree by
245 NAC sequences). On the other hand, some rosid species, such as grapevine,
papaya tree, and soybean, contain the lowest NAC sequence numbers of their families,
with 71, 77, and 75 sequences, respectively. The Eurosid group contains many
economically important flowering plants, such as legumes and brassicales; all of these
species share a palaeo-hexaploid common ancestor that emerged after divergence
from the monocots and before the radiation of the eurosids [83]. Grapevine and papaya
tree serve as evolutionary important model plants for fruit tree genomics [83, 84]. With
only 24,746 predicted genes for the papaya tree genome (the lowest predicted gene
number for the eudicot plants [85]) and 26,346 predicted genes for the grapevine [83],
these two plants appear to have experienced only one WGD shared by all monocot
and eudicot lineages. This observation allows us to better understand the ancestral
traits of this lineage. However, the grapevine genome is also the closest to the palaeohexaploid ancestral arrangement by far [83], suggesting that the duplication patterns of
ancestral genes and the addition of new activities in their functions were common
occurrences in the evolution of this genome [79]. For these reasons, the papaya tree
was proposed as an excellent outgroup for Arabidopsis, while grapevine was proposed
as a useful outgroup for Brassicales [86]. A resent report [85] demonstrated a reduction
in most gene families and biosynthetic pathways in the papaya plant and highlighted
the value of this plant as model to study complex pathways and networks. Papaya
contains no recent WGDs, explaining its lower opportunities for subfunctionalization
and implying that papaya genes may be more representative of basal angiosperms
than Arabidopsis genes and those of many other sequenced plants. Here, we found
that the papaya tree's genome contains 77 NAC proteins. This study is the first to
report and characterize the NAC family in the papaya tree genome. All the identified
NAC genes were named using the prefix CpNAC, and the complete set of the papaya's
NAC proteins is available in S3 Table.
45
Capítulo II
The major difference between the NAC protein family numbers within the angiosperms
and within the outgroup P. patens could be due to common selective pressures such
as environmental stresses, which may have guided the regulation of plant growth and
development [87]. Another explanation for the NAC gene family differences could be
the release of selective pressures due to gene redundancy. The ease of subfunctionality among the duplicated TFs could also be a contributing factor. After
duplication, TFs are capable of acquiring different functions from their ancestors and
could be naturally selected for their new functions, thus resulting in the indispensability
of both copies [82]. Gene family number differences suggest the genes in question may
be involved in plant-specific regulatory functions. The differences also highlight the
importance of TF duplication, due its contribution to the regulatory novelties that could
be involved in development, and responses to external stimuli [88, 89]. Other authors
[79] have found that large gene families in grapevine and others plant species are
essential and are involved in the basic processes of plant growth. These authors have
also suggested that these families have undergone large expansions during their
evolutionary history, as supported by our report for the NAC family.
2.3.2 ORTHOLOGOUS GROUPS AND DUPLICATIONS IN THE NAC FAMILY
Orthologous Groups (OGs) were calculated by means of a BBH using all 24 analyzed
proteomes. Then, a matrix containing presence information from all predicted OGs was
built and used to define the shared core of OGs for the NAC proteins. According to
previous work [90], evolutionary genomics compares a set of genomes with an
outgroup genome. To test the minimum content of orthologous proteins in monocots,
we used rice (O. sativa) as a reference because its phylogenetic position is closest to
the tested plants in terms of the hypothetical basal monocots genome. O. sativa is
thought to have an original monocot chromosome number (12) and has not evolved
through independent nested chromosome fusion (NCF) events [48]. On the other hand,
grapevine (V. vinifera) was used as a pivotal genome for eudicots because the
grapevine genome contains the ancient genome-wide duplications shared by all
eudicots and has the lowest number of NCF events [48, 83, 91, 92]. P. patens was
used as an outgroup for comparing these two pivotal genomes for monocots and
eudicots and to identify OGs in the S. moellendorffii plant. The comparison across
multiple outgroups is a useful tool that permits us to unambiguously discrimination
46
Capítulo II
between gene additions and losses in any group [86]. We ruled out the 39 homologous
genes that did not have significant hits according to the criteria previously established
(see Materials and Methods).
Four OGs were identified between P. patens and S. moellendorffii, which branched off
earlier in plant evolution. Two of the sequences in S. moellendorffii were orthologous to
the PpVNS1 and PpVNS5 proteins of P. patens. These genes were found to be
involved in hydroid cell differentiation by inducing cell death, water conducting and
tissue support in vascular plants [54]. PpVNS1 gene expression has been found in the
rhizoid tissues of P. patens, although this gene is not shared with vascular plants. In
flowering plants, we identified seven OGs shared between P. patens and each
representative taxa of monocots (rice) and eudicots (grapevines) (Fig. 2). Among the
seven OGs shared by P. patens and rice, two of them belonging to the PpVNS related
proteins (PpVNS6 and PpVNS8) were found to act as cell-specialized regulators for
water-conduction and plant support. All six analyzed monocots share 24 OGs, among
which are the rice characterized sequences OsNAC7 (SND-related protein), OsNAC4,
OsNAC6, and OsNAC10 (stress-related proteins). However, only six OGs were shared
pairwise (Osat-other species). A total of 43 NAC sequences were rice specific (not
shared with other species). The complete list of OGs and their paralogous genes in
monocots is available in S4 Table.
47
Capítulo II
Fig. 2 Schematic representation of NAC OGs shared among Angiosperms. A) Venn
diagram showing the orthologous gene number shared between the P. patens outgroup and
rice and grapevine genomes as the selected representatives for monocot and eudicot plants,
respectively. The total overlap consisted of five proteins that define the basal core of the NAC
genes. B) The number of orthologous proteins detected by means of BBH in 24 green plants.
Green lines indicate the OGs shared between the moss P. paten, S. moellendorffii, and the
basal taxa of the monocot and eudicot lineages. The number below the red line indicates the
number of OGs shared between the rice and grapevine species. Black lines indicate the number
of OGs shared among the monocots and eudicots with their respective selected pivotal species.
In the case of eudicot plants, we found seven OGs among the P. patens and grapevine
sequences, two of which belonged to the PpVNS related proteins (PpVNS6 and
PpVNS7, [54]), which play a key role in water conducting. These proteins are
preferentially expressed in the midrib of the central region of newly emerged leaves
and in the developing leaf midrip of P. patens. We found that the PpVNS6 protein was
shared for both monocot and eudicot plants, unlike PpVNS7 and PpVNS8 proteins that
were specific for eudicots and monocots, respectively. We identified 13 OGs among
the 16 analyzed eudicot species (S5 Table), including the Arabidopsis-characterized
sequences ANAC029 (cell death related protein), ANAC033 (SOMBRERO), ANAC037
48
Capítulo II
(VND1), and ANAC040 (NTL8). Only two OGs were shared pairwise (Vvin-other
species), and 10 sequences were specific to grapevine. On the other hand, we found
31 OGs shared between rice and grapevine, the two selected representative taxa for
monocots and eudicots, respectively (S6 Table). All studied taxa in flowering plants
host paralogous genes, showing evidence of large expansions in this family. Finally,
only five OGs were shared among the P. patens-rice-grapevine (see Fig. 2). We
decided to call these the Basal Orthologous Groups (BOGs).
The BOGs were taken as the core NAC sequences, from which evolution progressed
through different events of genome-duplication. Functional divergence events among
the duplicated genes were likely the source of evolutionary innovations and specific
adaptation processes for each lineage [46].
Comparative analysis of each BOG was done by sequence alignment. P. patens
sequences were used as basal group to underline character changes along plant
evolution. We included the orthologous sequences from the analyzed angiosperm
plants with the orthologous proteins shared in rice and grapevine to broaden the scope
of the analysis. Plesiomorphic amino acids were detected along the NAC domain and
in the C-terminal region through diverse lineages of plants, and lineage-specific
synapomorphies for monocot/eudicot species were detected in the NAC domain (S2
Fig). However, the evolutionary distance of the plant lineages and amino acids in the
NAC domain were very similar, confirming the importance of this domain along its
evolutionary history. Overall, the NAC domain in all five BOGs has structural
conservation, giving evidence of the importance of this DNA-binding domain through
the plant lineage.
Furthermore, a visual inspection of the C-terminal region of each BOG was performed
using the MEME software [64], identifying several conserved motifs that could be
considered as the signature of these basal groups (S3 Fig). In the case of BOG1, all its
members
have
the
signature
LP-box
(LP[QX]L[ED]SP)
and
the
WQ-box
(W[RA]ALD[KR][FL][VL]ASQL) that were previously defined as the responsible motifs
for the transcriptional activity of gene ANAC012 (SND1; [93]). Some conserved motifs
were present both in early diverging plants and in more recent flowering plant lineages,
suggesting they originated before the split of the monocot and eudicot lineages.
Members of each OG are supposed to be derived from the same ancestor gene,
49
Capítulo II
sharing well-conserved motifs, structures and likely functions [49]. Our findings reveal
the presence of five ancestral proteins preserved both in monocot and eudicot
lineages. These proteins probably played key roles in the adaptation and survival of
flowering plant lineage and expanded through different duplication mechanisms to cope
with the environment challenges.
2.3.3 NAC PHYLOGENETIC ANALYSES
We conducted a phylogenetic tree reconstruction from 24 green plants in order to
understand the NAC family evolution and distribution through the angiosperms lineage
and identify species-specific NAC gene expansions or reductions. The global set of
NAC sequences was clustered by CD-HIT software ([61]; see Materials and Methods)
to reduce sequence redundancy, resulting in 2016 non-redundant sequences used for
the phylogenetic analyses. The phylogenetic tree was arranged into six major clusters,
as shown in the Fig. 3.
50
Capítulo II
Fig. 3 Phylogenetic relationships of the NAC gene family. A) Maximum likelihood
phylogenetic tree derived from a MUSCLE alignment of the NAC domains from 24 plant
species. The unrooted phylogenetic tree of the 2106 NAC proteins was clustered into six major
families. Specific motifs found in the C-terminal region of the NAC proteins are shown next to
each group. Blue lines and blue asterisks indicate sequences of P. patens in the tree, green
circles show Arabidopsis proteins, and purple and red circles show grapevine and rice
sequences, respectively. B) Schematic depiction of the proposed NAC family classification.
Names of each subgroup are shown next to each clade. Triangles represent the NAC
51
Capítulo II
subgroups (detailed phylogenetic analysis is available in S4 Fig; branch lengths are arbitrary).
C) Schematic representation of the five NAC's BOGs detected in the plant lineage and their
affiliation into the major groups. Paralogous proteins for rice and grapevine are shown below
each colored box. The affiliation of each BOG into the phylogenetic tree is available in S5 Fig.
C) HMM LOGO of the NAC domain of 2106 proteins used in the phylogenetic tree.
There were some conserved residues in the NAC domain, suggesting a vital role in
their structure due to their prevalence through distinct lineages, as in the case of the
GxxFxP residues into A-motif, the W residue into the C-motif, and the WxMHEY
signature in the D-motif. The importance of these residues should be regarded in future
studies to unravel the origin and evolution of the NAC domain in plant lineage.
In the phylogenetic analysis, sequences from monocots and eudicots tend to cluster in
the same clades, suggesting a lineage-specific expansion after divergence from their
common ancestor (see S4 Fig). Arabidopsis sequences were used as references for
the phylogenomic analysis of the NAC family because of the experimental support of
this model species. The NAC group I (see Fig. 3) contains proteins involved in
controlling cell wall composition, biosynthesis, and xylem development [94]. According
to our results, Group I is proposed as the basal NAC group, given the essential
angiosperm-specific innovations in water conduction controlled by a Vascular NAC
Domain (VND) subgroup of NAC family. Previous authors [54] determined that NAC
transcription factors may have contributed to the evolution of both water conducting
and cell supporting during the adaptation of plants to land. In Group I, P. patens' 12
sequences were clustered, with only one sequence with a TMM, and this group
contains 8 grapevine and 12 rice sequences. We determined that OG Vvin21-Athal22
(ANAC070, BEARSKIN2, BRN2; S7 Table) is involved in root cap maturation and cell
wall modifications. Athal22 contains only one paralogous sequence: Athal35
(ANAC070, BEARSKIN1). All eudicot species share the orthologous sequence BRN2,
except for the papaya tree [95]. The OG Vvin27-Athal40 (ANAC043, NST1) has two
paralogous sequences, Athal44 (ANAC012, NST3) and Athal46 (ANAC066, NST2),
which are involved in secondary wall synthesis, and have redundancy with the VND
proteins in Arabidopsis [96]. We could only detect one NST in papaya tree, cucumber,
and cacao; two sequences for rice, soybean and tomato; three sequences in barley,
Arabidopsis, cassava and Poplar tree; four sequences for maize; and five sequences
for banana tree.
52
Capítulo II
We determined the OG Vvin25-Athal34 (ANAC037, VND1) has two paralogous
sequences, Athal30 (ANAC076, VND2) and Athal45 (ANAC105, VND3). The other
VND sequences of Arabidopsis are in the OGs Vvin16-Athal28 (VND4, ANAC007),
which has only one paralogous sequence Athal33 (VND5/ANAC026), and Vvin28Athal42 (VND7, ANAC030). Other researchers [54] found eight NAC sequences in P.
patens with similarity to the VND/NST/SND proteins, and they named the sequences
PpVNS [VND-, NST/SND-, SMB (SOMBRERO)-related protein]. These sequences
have a conserved transcriptional regulation and cellular function between moss and
Arabidopsis water-conducting cells. Ppat23 (PpVNS7) can regulate many putative
orthologous
to
the
VND/NST/SND
direct
targets,
such
as
MYB46/83/103;
transcriptional activators for secondary wall formation; CesA, a cellulose synthase
subunit; IRX7/FRA8, a glucuronoxylan biosynthesis protein; 4CL, a lignin biosynthesis,
and XCP, a papain-like cysteine peptidase. According to our analysis, the Ppat23
(PpVNS7) sequence of P. patens, which was specific to eudicot plants, is orthologous
to the Vvin25 protein, which in turn is orthologous to the VND1 sequence in
Arabidopsis. The OG PpVNS7-Vvin25 appears to be the basal group of the VNDrelated proteins, suggesting the expansion of this group through concerted evolution.
We hypothesize that Vvin25, Vvin16 and Vvin28 (group I-A) were the principal NAC
VND sequences that expanded through angiosperm lineage. We found three VND
genes for papaya tree, tomato, and cucumber, seven genes for Arabidopsis, and 15
VND genes for Poplar. In previous work, it was determined that only two VND genes
are present in P. abies (Gymnosperm) compared with seven genes in Arabidopsis [78].
The NAC group II (see Fig. 3) hosts 8 P. patens sequences, 9 grapevine sequences
and 24 rice sequences. The OG Vvin6-Athal2 (ANAC100, an ethylene responsive
gene; see S7 Table), contains the paralogous sequence Athal6 (ANAC080). ANAC080
has a characterized orthologous RhNAC100 in Rosa hybrid, and it is involved in cell
expansion in flower petals via ethylene network [97]. The Vvin38 protein is orthologous
to Athal62 (ANAC22), which is involved in auxin signaling promoting lateral root
development [98]. This group II hosts the CUC1-3 (Cup-shape cotyledon) proteins that
are involved in shoot apical meristem (SAM) formation and cotyledon separation during
embryogenesis in Arabidopsis [35, 99]. The OG Vvin10-Athal16 (CUC2, ANAC098)
has the paralogous sequence Athal27 (CUC1, ANAC054) in Arabidopsis. This protein
has orthologous sequences in all analyzed eudicot plants, except in the Medicago
plant. The OG Vvin30-Athal39 (CUC3, ANAC031) contains other characterized CUC3
53
Capítulo II
proteins in the model species A. thaliana. Within group II functions, there are processes
of specific development among the different organs, such as leaf, root, and floral
development, and other processes are probably involved in ethylene-auxin pathways.
For the NAC group III (see Fig. 3), 5 P. patens sequences were identified, while 17 and
12 sequences were found for grapevine and rice respectivelye, respectively.
Furthermore, 142 of the 164 sequences containing TMMs were clustered into this
group. Therefore, we named it the TMM Group. The TMM group possesses all the NTL
reported sequences from Arabidopsis (NTL1-NTL14). These TMM motif sequences are
regulated by proteolytic cleavage of the anchor by intra-membrane proteases and are
often mediated by environmental factors and stress signaling, such as high salinity
(NTL4, NTL5, NTL6 and NTL8), heat (NTL1 and NTL11), cold (NTL2, NTL3, NTL6,
NTL7 and NTL9), drought (NTL2, NTL6 and NTL9), H2O2 (NTL4, NTL5, NTL7 and
NTL9), ABA (NTL6-regulating PR genes), cell division (NTL12), mitochondrial
retrograde signaling mediating primary stress responses (NTL7), and gibberellic acid
(NTL8) [23, 100, 101, 102, 103, 104]. This strategy ensures rapid transcriptional
responses to environmental fluctuations, and it would be an efficient way to maximize
plant survival under adverse conditions [22]. We determined five sequences in
grapevine (Vvin35, Vvin36, Vvin41, Vvin46, and Vvin48) that host the basal NTL
sequences in Arabidopsis (see S7 Table), which most probably expanded differently
through each plant lineage by different duplication mechanisms to adapt to the needs
of each open niche in the environment. The Populus and apple tree are the two
species with the highest number of gene expansions into the group of eudicot plants
analyzed, with 34 and 26 NTL sequences, unlike grapevine, papaya tree, common
bean, and M. truncatula that contain a lower number of NTL sequences in their
genomes.
The NAC group IV (see Fig. 3) hosts a P. patens sequence (Ppat27), 15 grapevine
sequences and 13 rice sequences. The Ppat27 sequence belongs to BOG3, which is
shared with the Vvin34 sequence of grapevine and Osat44 from rice. The Vvin34
sequence is orthologous to Athal59 (ANAC035, LOV1; see S7 Table). LOV1 controls
the flowering time by negatively regulating CONSTANS (CO), a floral promoter in the
circadian light pathway and cold response [105]. Another OG hosted in this clade is
Vvin31-Athal48 (ANAC009, FEZ), which controls the reorientation and timing of cell
division in a subset of stem cells [106]. The Athal63 gene from Arabidopsis (ANAC042,
JUNGBRUNNEN1/JUB1) is orthologous to the Vvin42 sequence in grapevines. JUB1
54
Capítulo II
is a hydrogen peroxide (H2O2)-induced NAC transcription factor that plays a central
role in the longevity regulation of Arabidopsis, and its over-expression delays
senescence and enhances tolerance to various abiotic stresses [33].
The NAC group V (see Fig. 3) hosts 8 P. patens sequences, 14 grapevine sequences,
and 16 rice sequences. The OG Vvin3-Athal4 (ANAC056, NARS1, ORS1; see S7
Table) contains a Jasmonic Acid (JA) regulatory protein [107]. The OG Vvin59-Athal93
(ANAC104, XND1) contains a characterized Arabidopsis protein that acts as a negative
regulator of ligno-cellulose synthesis and programmed cell death in the xylem. A
previous [108] report found four putative orthologs to XND1 in Poplar's genome,
suggesting the presence of a more complicated xylem in Poplar versus Arabidopsis.
We found the same four XND-related sequences in Poplar contained in the OG Vvin59Ptric191. This sequence also contained three paralogous genes: Ptric195, Ptric198 and
Ptric199. Grapevine, papaya tree, E. salsugineum, Ricinus, cassava, and cucumber
plant all have only one XND-related sequence. The OG Vvin2-Athal1 (ANAC029,
AtNAP) is responsible for controlling leaf senescence and is involved in programmed
cell death (PCD) in Arabidopsis [109]. This gene has orthologous members in all the
analyzed angiosperms, with several paralogous genes each. The heterologous
overexpression of PvNAP (common bean) and OsNAP (rice) was able to restore the
Arabidopsis atnap null mutant to wild-type, suggesting that NAP may be a universal
regulator in plant leaf senescence. Additionally, AtNAP controls stomatal movement
and water loss during leaf senescence via the ABA pathway [110]. We defined the OG
Vvin12-Athal7 (ANAC072, RD26) as an important abiotic stress-responsive gene from
Arabidopsis, which has two paralogous sequences, Athal19 (ANAC019) and Athal18
(ANAC055). All the analyzed eudicot plants, with the exception of M. truncatula,
contain this orthologous sequence, suggesting the importance of this mechanism to
cope with abiotic stress. These proteins improve tolerance against several abiotic
stresses in plant systems [20, 111]. Athal10 (ANAC002, ATAF1), another Arabidopsis
stress responsive gene, negatively regulates several stress related genes as COR47,
ERD10, KIN1, RD22 and RD29. The ataf1 mutants displayed a recovery rate about
seven times higher than wild-type plants in a drought response test [40]. This gene is in
the OG Vvin7-Athal10 and has orthologous sequences in all the studied plants except
the apple tree. Furthermore, the group V contains many others sequences that have
been characterized in other species and have improved tolerance against abiotic
stresses in tomato proteins Slyc6 (SlNAC1) and Slyc3 (SlNAM1), soybean proteins
55
Capítulo II
Gmax24 (GmNAC20) and Gmax109 (GmNAC11), and rice proteins Osat16 (OsNAC5),
Osat5 (OsNAC6, SNAC2), and Osat1 (OsNAC10) [112, 113, 114, 115]. According to
our results, Group V is proposed as Stress Group of NAC family.
Finally, the NAC group VI contains one P. patens sequence (belonging to BOG5), 5
grapevine sequences, and 18 rice sequences. This group hosts many species-specific
sequences for rice and contains a great abundance of species-specific sequences for
the rest of angiosperms, especially Populus, apple tree, Nicotiana, and tomato. These
species have experienced various WGDs through their evolutionary history, resulting in
the expansion of their gene families. Our results show that each lineage continued
expanding after divergence from the common ancestor, resulting in species-specific
innovations according to their needs.
The fate of paralogous genes is poorly understood. The prevailing theory predicts that
duplicated genes will eventually be lost or mutated. However, several duplications are
retained in the genome, probably via new functionalities or sub-functionalities [116]. In
Arabidopsis, it has been demonstrated that many genes involved in signal transduction
and transcription were preferentially retained after the most recent WGD event [117,
118], suggesting the important roles of TF duplications in plant evolution. Genomic
comparisons allow us to transfer genomic knowledge and generate functional
hypotheses, moving from acquired experimental information on model species to lessstudied taxa. The analysis of orthologous groups in all the other plant species, both
monocots and eudicots, thus helped us study the evolutionary dynamics of NACs and
to understand shared patterns across the analyzed genomes. This analysis also
allowed us to predict each member’s functions using the overall generated knowledge
of the model species.
56
Capítulo II
2.4 CONCLUSIONS
Comparative genomic analysis and gene functional analysis have shed new light on
many aspects of how gene and genome duplicates have contributed to the rapid
diversification of the NAC family into the angiosperm lineage by functional innovations
such as key pathways, linked to the origin of flowering plants. In this study, we have
broadened the number of analyzed species to unravel the origin, evolutionary history,
and fate of the expanded NAC family. We observed that the expansion of the NAC
family occurred shortly before the origin and rapid radiation of flowering plants. We also
observed a gradual increase in the gene number, from the early diverging P. patens, to
more complex trees, such as the Poplar, which wastree consistent with the occurrence
of a WGD event in angiosperm history. We have identified 3,187 NAC TFs in 24 green
plants and identified the principal sequences from the early diverging P. patens plant,
termed basal sequences, which most likely expanded through the flowering plant
lineage by different duplication mechanisms, thus allowing the diversification and
adaptation of angiosperms to almost all environments. We found evidence, which had
remained unknown before this work, of these five basal sequences in both monocot
and eudicot plants. Comparative genomic analysis of the NAC family has opened new
possibilities for the systematic functional analysis of new members while providing the
basis for further functional research on this vascular plant gene family. Learning how
regulatory proteins acquire new molecular functions is essential for developing an
understanding of how organisms adapt to new biological niches. The NAC family
represents a useful framework in which to address this question. This work is a starting
point for characterizing the function of many neglected NAC genes and has provided
us with a better understanding of the origin and evolution of the NAC family.
2.5 ACKNOWLEDGMENTS
We thank the anonymous referees for their constructive comments and suggestions.
The authors would also like to thank the Centro de Investigacion Cientifica de Yucatan,
Mexico, for supporting this research.
57
Capítulo II
2.6 AUTHOR CONTRIBUTIONS
Conceived and designed the study: APS and LRZ. Performed the bioinformatics
analyses: APS. Supervised the bioinformatic analyses: LDA. Analyzed the data: APS,
LSC and FST. Wrote the manuscript: APS and LDA. Supervised the project: LRZ and
EC. All authors have read and approved the final manuscript.
58
Capítulo II
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73
Capítulo II
2.8 SUPPORTING INFORMATION
S1 Table. Plant species used for the retrieval and analysis of the NAC
sequences. AEnsemblPlants, the BPhytozome database V.9.1, and the CSol Genomics
Network were used to collect sequences. (PDF)
S2 Table. List from 24 plants used in this study. This file contains the IDs assigned
for the retrieved NAC sequences, the names of the protein annotation files for each
species, the amino acid sequences for each NAC protein, and short descriptions and
annotations generated in this study. (XLS)
S3 Table. List of NAC sequences detected in C. Papaya. The sequences were
named using the prefix CpNAC and a denoting their order of discovery. Above each
column, the CpNAC ID, the Phytozome V9.0. database ID number, the best BLASTP
hit in a nr-database (GenBank), and the E-value of the best hit are shown. (PDF)
S4 Table. Complete list of the NAC OG proteins in monocots. NAC OG proteins in
the Liliopida Class. Oryza sativa NAC sequences were used as references. Red
colored blocks represent orthologous genes. Species-specific duplications of each
gene are shown below the colored blocks. Sequences belonging to the basal
orthologous groups are numbered and marked with yellow stars. (PDF)
S5 Table. Complete list of NAC OG proteins in eudicots. List of OG proteins from
the Class Magnoliopsida using the Vitis vinifera sequences as references. Purple
colored blocks represent orthologous sequences. Species-specific duplications of each
gene are shown below the colored blocks. Sequences belonging to the basal
orthologous groups are numbered and marked with yellow stars. (PDF)
S6 Table. Complete list of NAC OGs shared by monocots and eudicots. List of 31
NAC OG proteins in basal angiosperm species. Sequences of rice and grapevine are
marked in red and purple boxes, respectively. Sequences with the reciprocal BBH are
shown in colored boxes. Paralogous sequences are shown below the colored boxes.
The five BOGs are marked with yellow stars. (PDF)
74
Capítulo II
S7 Table. Complete set of NAC OGs identified in this study. This file contains the
OGs identified in the monocot lineage, the eudicot lineage, and between the monocot
and eudicot lineages, as well as the OGs detected between P. patens as an outgroup
and each representative taxa for the monocot and eudicot lineages. The Arabidopsis
sequences were annotated to compare with the eudicot OGs. The basal sequences of
P. patens are shown next to their respective orthologous sequences in both the
monocot and eudicot lineages. (XLS)
S1 Fig. HMM LOGO analysis of the NAC domains of 24 plant species. This file
contains the HMM NAC domain LOGOS of each of the 24 plant species analyzed.
(PDF)
S2 Fig. Comparative analysis of the BOGs and their relative sequences.
BOXSHADE analysis of the BOGs and their relative sequences in monocot and eudicot
plant species. Plesiomorphic characters are shown in black shadow boxes, principal
synapomorphies are shown in red and green letters, and autapomorphies are shown in
yellow letters. Similar sequences are colored in gray shadow boxes. The TMM region is
shown in blue letters. (PDF)
S3 Fig. Motifs found outside the NAC domain in the five BOGs. Motifs scan of the
BOGs and their relative sequences in monocot and eudicot plants. A) BOG1, B) BOG2,
C) BOG3, D) BOG4, and E) BOG5. Motifs are shown in gray boxes. (PDF)
S4 Fig. Phylogenetic tree of the NAC proteins in the 24 land plant species. The
tree was arranged in six major clades (I-VI) and subclassified in minor groups. Major
clades are highlighted in different colors. The ID sequences for moss P. patens are
shown in blue, for S. moellendorffii in pink, for monocots in red and for eudicots in
green. (PDF)
S5 Fig. Phylogenetic tree of the NAC TF proteins in the basal plant lineages.
Maximum Likelihood phylogenetic tree of NAC transcription factor proteins.
Phylogenetic analysis was carried out with sequences of three basal plant groups:
grapevine (Magnoliopsida), rice (Liliopsida), and P. patens (Bryophyta). The tree was
arranged into six major clades and was then subclassified in minor groups. The ID
sequences for P. patens, rice and grapevine are shown in blue, red and green,
75
Capítulo II
respectively. Black asterisks indicated the BOGs shared in the three species and are
indicated by red and purple dashed lines. Green colored asterisks and dashed lines
indicate the OG for the P. patens-grapevine; the cyan colored asterisks and dashed
lines indicate the OG for the P. patens-rice. (PDF)
76
Capítulo III
CAPÍTULO
III
CARACTERIZACIÓN
IN
SILICO
DE
FACTORES
DE
TRANCRIPCIÓN NAC INVOLUCRADOS EN RESPUESTA A ESTRÉS
ABIÓTICO
3.1 INTRODUCCIÓN
Los factores de transcripción NAC se encuentran exclusivamente en las plantas, no se
han hallado evidencias de su presencia en bacterias y algas. Estos factores se
encuentran distribuidos en gran número de especies y en diversos estudios se ha
demostrado la participación de estas proteínas en un gran número de procesos de
desarrollo, así como en respuesta a distintos tipos de estrés biótico y abiótico
(Nakashima et al, 2012). El dominio NAC carece de un motivo clásico helix-turn-helix
(hélice-giro-hélice), por el contrario, éstas poseen un nuevo tipo de plegamiento
descrito para FT's, el cual se conforma por un trenzado de láminas beta, rodeadas por
unos pocos elementos helicoidales los cuales tienen la capacidad de unirse
específicamente al ADN (Han et al, 2011). Actualmente se ha determinado la
estructura cristalográfica del dominio NAC de una sola proteína de esta familia
(ANAC019) perteneciente a A. thaliana (Morishita, et al, 2009).
Dentro algunas de las funciones que han sido reportadas para esta familia de FT's, se
encuentran las respuestas frente a diferentes tipos de estrés biótico y abótico. Los
genes de Arabidopsis ATAF1 y ATAF2 se encuentran involucrados en la respuesta
ante el ataque de diversos tipos de patógenos (Lu et al., 2007). Varios genes NAC de
Brassica napus y de Saccharum sp., resultan altamente inducidos por las bajas
temperaturas, la deshidratación y el ataque de patógenos, mientras que los genes
ANAC019, ANAC055 y ANAC072 de Arabidopsis son altamente regulados por ABA,
sequía y estrés salino (De Oliveira et al., 2011).
Desde que el primer miembro de esta familia fue descrito por Souer et al., en 1996,
diversos grupos se han enfocado en describir las características particulares de sus
miembros, elucidar el rol que desempeñan en el metabolismo vegetal y comprender la
evolución de esta familia génica. Para este objetivo, es esencial comprender los
mecanismos que subyacen el origen de nuevos genes, como son el nacimiento de
genes de novo y la hipótesis de duplicación-divergencia. Los modos de duplicación
génica pueden ser sumarizados en seis mecanismos: duplicación global del genoma
(whole genome duplication, WGD), duplicación en tándem, duplicación proximal,
77
Capítulo III
duplicación basada en ADN transpuesto, duplicación por retrotransposones y
duplicación dispersa (Wang et al., 2011). La consecuencia de estos eventos de
duplicación da lugar a la expansión de las familias génicas, afectando en muchos
casos las características de los genes duplicados, pudiendo conllevar a la divergencia
funcional, subfuncionalización, neofuncionalización, pseudogenización y evolución
concertada de los genes (Abrouk et al., 2010). Dichos cambios resultan de gran
importancia para el entendimiento de la divergencia funcional de los genes y los
cambios que conlleva dicha divergencia son asociados a las características
particulares para cada especie.
Al día de hoy se ha caracterizado esta familia de FT's en diferentes especies vegetales
mediante diversas estrategias de búsqueda, las cuales no siempre suelen ser las más
fiables, por lo que en este trabajo se realizó una amplia caracterización de esta familia
de FT en Angiospermas, resultando en una matriz de datos robusta con las
secuencias ortólogas entre los diferentes miembros del grupo. Dicha matriz nos
permitió estudiar con mayor exactitud las secuencias involucradas en diferentes
procesos de estrés abiótico entre especies, dentro de las cuales se encuentra nuestra
especie de interés: papaya.
En este tercer capítulo tomamos ventaja de los análisis comparativos realizados entre
genomas vegetales en el Capítulo II, con los cuales identificamos secuencias de
Arabidopsis thaliana involucradas en procesos de estrés abiótico y tomamos las
secuencias ortólogas en C. papaya para su caracterización. En el presente capítulo, se
reporta la identificación de 77 genes NAC de Carica papaya, como parte de un
esfuerzo para identificar nuevos genes involucrados en respuesta aL estrés abiótico,
especialmente en sequía, salinidad y temperaturas extremas. Debido al potencial de
los FT's NAC como blanco para la ingeniería genética en la búsqueda de la tolerancia
al estrés ambiental, cinco diferentes genes NAC de C. papaya cv. Maradol fueron
ampliamente caracterizados mediante análisis in silico con el fin de comprender el rol
que desempeñan en la señalización en respuesta al estrés. Para ello fue necesario
visualizar los elementos en cis presentes en las respectivas cajas promotoras de los
cinco genes, así como identificar los motivos característicos en la región C-terminal
con respecto a la subfamilia de su pertenencia.
78
Capítulo III
3.2 MATERIALES Y MÉTODOS
3.2.1 DETERMINACIÓN DE SECUENCIAS NAC CARACTERIZADAS EN
DISTINTAS
ESPECIES
VEGETALES,
E
IDENTIFICACIÓN
DE
LAS
SECUENCIAS ORTÓLOGAS EN C. papaya L. cv. MARADOL
Para comprender las relaciones funcionales de las proteínas NAC, se realizó una
búsqueda
en
la
literatura
científica
sobre
secuencias
NAC
caracterizadas
funcionalmente en distintos modelos vegetales, los cuales hayan presentado fenotipos
tolerantes en distintos tipos de estrés abiótico. La búsqueda se realizó dentro de las
siguientes bases de datos: NCBI (National Center for Biotechnology Information,
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/),
EBI
http://www.ebi.ac.uk/),
v3.0
PTFDB
http://planttfdb.cbi.edu.cn/index.php),
Database,
(European
(Plant
AtTFDB
Bioinformatics
Transcription
(Arabidopsis
http://arabidopsis.med.ohio-state.edu/AtTFDB/)
Factor
Insitute,
Database,
transcription
y
STIFDB
Factor
(Stress
Responsive Transcription Factor Database, http://caps.ncbs.res.in/stifdb/search.html).
Con base en las anotaciones realizadas, se desarrolló un conjunto de datos de dichas
secuencias conteniendo la siguiente información: secuencia nucleotídica, región
codificante (CDS), secuencia proteica, función, número de acceso, nombres y
sinonimias de la secuencia, y por último los artículos científicos en los cuales se
encuentra citada dicha información. Para la selección de los genes candidatos en este
estudio, se utilizaron como referencia aquellas secuencias obtenidas de la literatura
cuyos niveles de expresión transcripcionales en respuesta a estrés abiótico (sequía,
deshidratación, frio, altas temperaturas, salinidad, adición de ABA) haya sido
significativos, y con base en las diferentes evidencias experimentales para dichos
genes. Posteriormente se determinaron las secuencias ortólogas para papaya
mediante el uso de la matriz obtenida para Angiospermas en este trabajo (ver Capítulo
II), con el fin de tener una aproximación in silico de la funcionalidad de las secuencias
en papaya.
Una vez obtenidas las predicciones para papaya se procedió a caracterizar dichas
secuencias. Se realizaron comparaciones contra los genes ortólogos en diferentes
especies de angiospermas, mediate alineamientos múltiples en Clustal Omega, y
visualizados mediante BOXSHADE v3.21 (http://www.ch.embnet.org). De igual modo,
se señalaron el número y la posición de los intrones, las posibles regiones no
79
Capítulo III
traducidas 5' y 3', se caracterizó la región promotora de cada gen y finalmente se
procedió a diseñar iniciadores específicos para cada uno de los genes seleccionados
en C. papaya.
3.2.2 MODELOS ESTRUCTURALES DE LAS PROTEÍNAS NAC DE C.
papaya SELECCIONADAS
Nuestras estructuras tridimensionales propuestas fueron modeladas en el predictor
Phyre2 (Lawrence y Sternberg, 2009) y presentadas mediante Chimera 1.5.3
(Pettersen et al., 2004). De igual manera, cada una de las secuencias de aminoácidos
predichas fue comparada contra la base de datos PBD, Proteina Data Bank
(http://www.wwpdb.org/) para la asociación con alguna secuencia reportada y
caracterizada cristalográficamente.
3.2.3 ANÁLISIS DE PROMOTORES
La secuencia de los promotores de los genes NAC seleccionados fue utilizada para
determinar la ocurrencia de los motivos conocidos en cis mediante la base de datos
PLACE (Higo et al., 1999) y AGRIS (Palaniswamy et al., 2006)
80
Capítulo III
3.3 RESULTADOS
3.3.1 DETERMINACIÓN DE SECUENCIAS NAC CARACTERIZADAS E
IDENTIFICACIÓN DE SECUENCIAS ORTÓLOGAS EN C. papaya L. cv.
MARADOL
De acuerdo con la literatura, se identificaron 35 secuencias NAC caracterizadas, cuyas
funciones han sido demostradas mediante distintas evidencias experimentales, así
como análisis de expresión transcripcional, sobreexpresión en plantas y silenciamiento
de dichos genes (Tabla 3.1). Muchas de estas secuencias caracterizadas, responden
a procesos de desarrollo de la planta, otras en respuesta a algún tipo de estrés
abiótico y otras más actúan en procesos de resistencia a patógenos, induciendo en
uno de los casos, la activación de los genes PR (pathogenesis-related). De entre estas
secuencias, los genes de Arabidopsis ANAC019, ANAC055 y ANAC072 presentan una
alta expresión transcripcional en respuesta a estrés por altas temperaturas, sequía y
salinidad (Jensen et al., 2010). Por otra parte el gen ANAC002 o ATAF1 muestra una
clara actividad en la respuesta al estrés por sequía, durante el daño mecánico y la
infección por patógenos; presenta una estructura proteica totalmente diferente a las
otras NAC involucradas en estrés abiótico, siendo ésta única en su clase (Lu et al.,
2007).
Tabla 3. 1 Genes funcionales NAC reportados en la literatura, involucrados en diversas
respuestas ambientales.
No. Acceso
GenBank
Nombre
Función
Referencia
NM_100054
ANAC002, ATAF1
Sequía, Daño mecánico, patógenos
Lu et al., 2007
NM_103011
ANAC012, NST3, SND1
Regulador negativo del engrosamiento de pared
secundaria y formación de xilema
Ko et al., 2007
NM_104167
ANAC019
Sequía, salinidad, ABA, JA, defensa-patógenos
Jensen et al.,
2010
NM_104479
ANAC022, NAC1
Señalización auxinas para desarrollo de raíces
laterales
Xie et al., 2000
NM_105616
ANAC029, ATNAP
Regulador de senescencia foliar
Guo y Gan, 2006
NM_105851
ANAC030, VND7
Interruptor transcripcional de la transdiferenciación
de células de metaxilema y protoxilema
Kubo et al., 2005
Yamaguchi et al.,
2010
NM_128289
ANAC040, NTL8
NM_129861
ANAC042,
JUNGBRUNNEN 1
Regulador negativo de la germinación en estrés
salino (GA signaling)
Responsivo a especies reactivas de oxígeno,
regulador de longevidad en A. thaliana
NM_130243
ANAC043, NST1
Regulador en la formación de pared secundaria
Kim et al., 2008
Wu et al., 2012
Mitsuda et al.,
2005
81
Capítulo III
Tabla 3.1 Continua
NM_112418
ANAC055, ATNAC3
Sequía, salinidad, ABA
Liu et al., 2011
Tran et al., 2004
NM_114813
ANAC062, NTL6, NTM1
Inducción de genes PR asociados a frio
Seo et al., 2010
NM_116056
ANAC066, NST2
Regulador en la formación de pared secundaria
Mitsuda et al.,
2005
NM_116384
ANAC068, NTM1
Regula la división celular mediante señalización por
citocininas
Kim et al., 2006
NM_116385
ANAC069
Estrés salino
Jiang y Deyholos,
2006
NM_118875
ANAC072, RD26
Sequía, salinidad, ABA
NM_120523
ANAC078, NAC2, NTL11
NM_122134
ANAC089, NTL
NM_123323
ANAC092, ATNAC6,
ATNAC2, ORE1
Regulación de la vía de Flavonoides en alta
luminosidad
Regulador negativo en la vía de la fructosa,
regulador negativo de la floración en A. thaliana
Regulador de senescencia foliar, controlado por
etileno
NM_124774
ANAC098, AtCUC2
Diferenciación y separación de órganos
NM_125632
ANAC101, VND6
NM_125849
ANAC104, XND1
NM_001125650
AtNTL9
Respuesta a estrés osmótico y senescencia foliar
Yoon et al., 2008
AY974350
GmNAC002
Altamente regulado por salinidad y deshidratación
Tran et al., 2009
AY974351
GmNAC003
Altamente regulado por salinidad y deshidratación
Tran et al., 2009
AY974352
GmNAC004
Altamente regulado por salinidad y deshidratación
Tran et al., 2009
AK376297
HvNAC013
Regulador de la senescencia foliar
Kjaersgaard et al.,
2011
AB362161
HvIDEF2
AK069257
OsNAC10
AB362160
OsIDEF2
CT829509
ONAC045
XM_002302636
PtrWND2B
XM_002325955
PtrWND6B
EU670749
SlNAM1
Altamente inducido por estrés salino
Yang et al., 2011
EU670750
SlNAC1
Altamente inducido por estrés salino
Yang et al., 2011
AY625683
TaNAC2
Confiere aumento en la tolerancia a múltiples tipos
de estrés abiótico
Mao et al., 2012
Interruptor transcripcional de la trans-diferenciación
de células de metaxilema y protoxilema
Regulador negativo en la diferenciación de
elementos traqueales
Regula la expresión de genes involucrados en la
homeostasis de hierro ante su deficiencia.
Aumenta el rendimiento de granos en arroz bajo
condiciones en campo de estrés por sequía
Regula la expresión de genes involucrados en la
homeostasis de hierro ante su deficiencia.
Aumenta la tolerancia en arroz a sequía y estrés
salino
Regula la expresión de otros FT’s involucrados en la
síntesis de la pared secundaria
Regula la expresión de otros FT’s involucrados en la
síntesis de la pared secundaria
Liu et al., 2011
Tran et al., 2004
Morishita et al.,
2009
Li et al., 2011
Balazadeh et al.,
2011
Aida et al., 1997
Kubo et al., 2005
Zhao et al., 2005
Ogo et al., 2010
Jeong et al., 2010
Ogo et al., 2010
Zheng et al., 2009
Zhong et al., 2010
Zhong et al., 2010
Con base en los antecedentes citados, se decidió hacer la caracterización in silico en
papaya, de los genes ortólogos ANAC002, ANAC019, ANAC029, ANAC040,
ANAC055, ANAC072 y ANAC092 de Arabidopsis thaliana.
82
Capítulo III
De acuerdo con los resultados obtenidos, las secuencias ANAC019, ANAC055 y
ANAC072 (RD26), de A. thaliana, con función definida ante el estrés abiótico, se
encuentran representadas por un solo candidato en C. papaya cv. Maradol, siendo
dicha predicción nombrada como CpNAC4. De acuerdo a los análisis comparativos
realizados en el capítolo II, CpNAC4 resultó ser la secuencia ortóloga a ANAC072, y
los genes ANAC019 y ANAC055 resultaron ser las secuencias parálogas de
ANAC072. El resultado de las predicciones se muestra en la Tabla 3.2.
Tabla 3. 2 Secuencias seleccionadas de C. papaya ortólogas a genes de A. thaliana
responsivos a estrés abiótico
Gen
C. papaya ID (Phytozome)
Gen
ortólogo de
Arabidopsis
Subdominios
pb
Intrónes
Intrón
pb
CpNAC1
evm.model.supercontig_1.48
ANAC029
A BCDE
756
3
117
165
29
97
86
CpNAC4
evm.model.supercontig_80.93
ANAC019
ANAC055
ANAC072
A BCDE
1020
2
CpNAC5
evm.model.supercontig_64.115
ANAC002
ABCDE
906
2
119
593
CpNAC12
evm.model.supercontig_14.101
ANAC092
A BCDE
1041
2
86
102
CpNAC39*
evm.model.supercontig_195.35
ANAC040
ABCD
1308
3
1106
419
80
*(MA = Membrane-Associated)
De las secuencias seleccionadas de Arabidopsis, ANAC072 es una de las principales
responsables, junto con ANAC019 y ANAC055, de conferir tolerancia a diferentes tipos
de estrés abiótico. En papaya, la secuencia ortóloga CpNAC4 presenta claramente
diferencias en su secuencia de aminoácidos, en comparación con las de Arabidopsis
como se puede observar en la Figura 3.1.
83
Capítulo III
NAC072
CpNAC4
NAC019
NAC055
1
1
1
1
MGVREKDPLAQLSLPPGFRFYPTDEELLVQYLCRKVAGYHFSLQVIGDIDLYKFDPWDLP
MGVQQMDPLAQLSLPPGFRFYPTDEELLVQYLCRKVAGQQFSLQIIAEIDLYKFDPWVLP
MGIQETDPLTQLSLPPGFRFYPTDEELMVQYLCRKAAGYDFSLQLIAEIDLYKFDPWVLP
MGLQELDPLAQLSLPPGFRFYPTDEELMVEYLCRKAAGHDFSLQLIAEIDLYKFDPWVLP
NAC072
CpNAC4
NAC019
NAC055
61
61
61
61
SKALFGEKEWYFFSPRDRKYPNGSRPNRVAGSGYWKATGTDKIITADGRRVGIKKALVFY
SKAIFGEKEWYFFSPRDRKYPNGSRPNRVAGSGYWKATGTDKIITTEGRRVGIKKALVFY
NKALFGEKEWYFFSPRDRKYPNGSRPNRVAGSGYWKATGTDKIISTEGQRVGIKKALVFY
SKALFGEKEWYFFSPRDRKYPNGSRPNRVAGSGYWKATGTDKVISTEGRRVGIKKALVFY
NAC072
CpNAC4
NAC019
NAC055
121
121
121
121
AGKAPKGTKTNWIMHEYRLIEHSRSHGSSKLDDWVLCRIYKKTSGSQRQAVTPVQACREE
VGKAPKGTKTNWIMHEYRLIESSRKNGSSKLDDWVLCRIYKKNASSQKPMLSNISS--KE
IGKAPKGTKTNWIMHEYRLIEPSRRNGSTKLDDWVLCRIYKKQSSAQKQVYDNGIANARE
IGKAPKGTKTNWIMHEYRLIEPSRRNGSTKLDDWVLCRIYKKQTSAQKQAYNNLMTSGRE
NAC072
CpNAC4
NAC019
NAC055
181
179
181
181
HSTNG--SSSSSSSQLDDVLDSFP-EIKDQSFNLPR------MNSLRTILN--------YSNNG--SSSSSSSHLDDVLESLP-AIDDRFFSIPR------INSLRTLQQDDIKTGVIP
FSNNGTSSTTSSSSHFEDVLDSFHQEIDNRNFQFSN--PNRIS-SLRPDLT-EQKTGFHG
YSNNG-SSTSSSSHQYDDVLESLH-EIDNRSLGFAAGSSNALPHSHRPVLT-NHKTGFQG
NAC072
CpNAC4
NAC019
NAC055
223
230
237
238
----GNFDWASLAG----LNPIPELAPTNG-----LPSYGGYDAFR-------------NLGTGNFDWASLAG----LNSVSSVVPSDHTQSQCIPSYTDTDVFVPSLPPISHVNKLCN
LADTSNFDWASFAGNVEHNNSVPELGMSHV-----VPNLEYNCGYL-------------LAREPSFDWANLIG----QNSVPELGLSHN-----VPSIRYGDG----------------
NAC072
CpNAC4
NAC019
NAC055
256
286
278
273
AAEGEAESGHVNR--------QQNSSGLTQSFGYSSS---GFGVSGQT----FEFRQ
AVDEEVQSGFRSQRIDNSGFLQPNSNALSQNFTNSVD---PFGFRYPTQPAMFEFRQ
KTEEEVESSHGFN----------N-SGELAQKGYGVD---SFGYSG-QVGG-FGFMGTQQQTEGIPRFN----------NNSDVSANQGFSVDPVNGFGYSGQQSSG-FGFI-
Figura 3. 1 Análisis comparativo entre las tres secuencias caracterizadas de A. thaliana
ANAC019, ANAC055 y ANAC072 con la secuencia ortóloga CpNAC4 de C. papaya (color
naranja).
La secuencia de papaya CpNAC4, pertenece al grupo V de la familia NAC, de acuerdo
con nuestra propuesta de clasificación (ver Capítulo II), dentro del cual se encuentra
agrupada dentro de la subfamilia B, llamada "Stress-related family". Dentro de este
subgrupo se encuentra una gran variedad de secuencias reportadas específicamente
en respuesta a procesos de estrés abiótico, compartiendo el clado con GhNAC4 de
algodón, GmNAC3 y GmNAC4 de soya, y ANAC019, ANAC055 y ANAC072 de A.
thaliana. Dichas secuencias han demostrado experimentalmente ser inducidas por
aplicación exógena de ABA, responder ante la sequía, las bajas temperaturas y el
estrés salino, permitiendo la tolerancia a dichos factores mediante su sobreexpresión
en plantas modelo. CpNAC4 posee un marco de lectura abierto de 1020 pb
codificando 339 aminoácidos y comparte un 73.6% de identidad y un 83.4% de
similitud con GhNAC4 de algodón (Gossypium hirsutum). Aunado a esto, la secuencia
CpNAC4 comparte las características conocidas del dominio NAC, incluyendo los
cinco motivos (A-E) en la región N-terminal y los tres motivos característicos de la
subfamilia "Stress NAC" en la región C- terminal o de activación transcripcional de
acuerdo con la clasifcación de Ooka et al. (2003).
84
Capítulo III
La secuencia CpNAC5 de papaya, es ortóloga a la secuencia ANAC002/ATAF1 de
A.thaliana, la cual posee una secuencia paráloga (ANAC032). ANAC002 se encuentra
dentro de la familia B "Stress-related family" del grupo V al igual que CpNAC4. Dentro
de este subclado se encuentra un gran número de genes reportados para diferentes
especies vegetales en respuesta a estrés abiótico, tales como las secuencias de
tomate SlNAC1 y SlNAM1; GmNAC20 y GmNAC11 de soya, y OsNAC5, OsNAC6,
SNAC2 y OsNAC10 de arroz. Por otro lado, dos de las secuencias NAC seleccionadas
de papaya, pertenecientes a diferentes grupos filogenéticos, participan en procesos de
muerte celular programada (MCP). La secuencia CpNAC1 de papaya es ortóloga a
ANAC029 (AtNAP), secuencia reportada en respuesta a procesos de senescencia, la
cual posee dos secuencias parálogas: ANAC063 y ANAC093. Estas secuencias
pertenecen a la familia C “NARS” del grupo V de acuerdo con nuestra clasificación.
Por otro parte, la secuencia CpNAC12 perteneciente a la familia C “ORE” del grupo II,
está altamente relacionada con la secuencia ANAC092 de A. thaliana la cual se
encuentra implicada en procesos de MCP durante el estrés abiótico inducido .por
salinidad.
Por último, la secuencia CpNAC39 de papaya se ubica dentro del grupo III de acuerdo
a nuestra propuesta de clasificación, y se agrupa dentro de la subfamilia A “NTL
family” nombrada de esta manera debido a que todas las 14 secuencias NTL de A.
thaliana (NTL1-NTL14) se encuentran dentro de este subclado. Esta proteína carece
del subdominio E dentro del dominio NAC.y presenta un dominio transmembrana
(TMM) en su región C-terminal. CpNAC39 es la secuencia ortóloga a ANAC040
(NTL8), la cual presenta tres proteínas parálogas: ANAC049, ANAC060 (NTL5) y
ANAC089 (NTL14).
Por otra parte, el número de intrones, la posición y el tamaño de los mismos para cada
uno de los cinco genes seleccionados de C. papaya se muestra en el anexo 1.
85
Capítulo III
3.3.2
MODELOS
ESTRUCTURALES
DE
LAS
PROTEÍNAS
NAC
SELECCIONADAS
Se realizó una comparación de modelos estructurales mediante el programa Phyre2 de
los cinco genes seleccionados para C. papaya y los cinco genes ortólogos de A.
thaliana (Figura 3.2 y 3.3).
A)
B)
C)
D)
Proteínas NAC
de C. papaya
E)
G)
F)
H)
Proteínas NAC
de A. thaliana
Figura 3. 2 Comparación de las estructuras secundarias de las proteínas de A. thaliana con
respecto a sus secuencias ortólogas en C. papaya. A y E corresponden a la proteína CpNAC5
y ANAC002 respectivamente; B y F, proteínas CpNAC1 y ANAC029; C y G, proteínas
CpNAC39 y ANAC040; D y H, proteínas CpNAC12 y ANAC092 respectivamente.
A)
B)
C)
D)
E)
Figura 3. 3 Comparación de modelos tridimensionales de las proteínas NAC seleccionadas A)
Ensamble biológico del dominio NAC de la proteína ANAC019 (Crystal form IV, PDB), B)
ANAC019, C) ANAC055, D) ANAC072 y E) proteína CpNAC4 de papaya ortóloga a ANAC072.
86
Capítulo III
3.3.3 ANÁLISIS DE PROMOTORES DE GENES NAC
En las cinco distintas secuencias promotoras de los genes analizadas, encontramos
una gran cantidad de elementos en cis en respuesta a estrés biótico y abiótico. Entre
los principales y más conocidos elementos se encuentran los ABRE, MYC, MYB,
DRE/CRT-CBF, ERD1, W-BOX, ERE, EIRE, PRE, ASF-1, entre otros más (Figura
3.4). Los promotores de CpNAC4 y CpNAC5 incluyen en gran número de sitios ABRE
(ABA responsive element) y ERD1 (early responsive to dehydration), involucrados en
distintos tipos de estrés osmótico. Aunado a esto, presentan un gran número de sitios
de unión de los FT's WRKY nombrados W-BOX, los cuales se encuentran
relacionados en la activación de genes en respuesta a estrés biótico. Por otro lado, los
elementos en cis DRE actúan en la respuesta inicial a la deshidratación, estrés salino
o estrés por bajas temperaturas mediante un mecanismo independiente de la
señalización por ABA (Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki, 1994). Con la excepción de
CpNAC5, encontramos el elemento TAAAG, el cuál fue reportado para el gen KST1 de
Solanum tuberosum que codifica para canales de K+ en células guarda. CpNAC39 y
CpNAC5 poseen un sitio PRE (Pro- or hypoosmolarity-responsive element) encontrado
en el promotor del gen que codifica para Prolina Deshidrogenasa (ProDH) de
Arabidopsis, reportando que un miembro de la familia bZIP funciona como activador
transcripcional para este gen (Satoh et al., 2004). CpNAC39 es el único miembro que
reporta sitios LTRE (low temperature responsive element), secuencia encontrada en la
región promotora del gen COR15a de Arabidopsis. CpNAC39 y CpNAC1 presentan el
elemento CGCG-BOX, el cual se reporta como secuencia reguladora en la
señalización por calcio.
87
Capítulo III
Figura 3. 4 Resumen de los diversos elementos en cis presentes en la región promotora de los
genes NAC seleccionados. Los nombres de los diferentes elementos en cis se señalan dentro
de cajas en color verde, y el sitio dentro del promotor se señala con figuras para cada uno de
los elementos encontrados. (Análisis realizado 1.5 Kb río arriba a partir del ATG de la
secuencia codificante)
88
Capítulo III
3.4 DISCUSIÓN
Aunque varios miembros de la familia NAC han sido caracterizados en Arabidopsis y
en arroz, la caracterización de genes NAC en especies tropicales sigue siendo aún
escasa. Con el objetivo de identificar nuevos genes involucrados en respuesta a estrés
abiótico en papaya, se construyó un modelo HMM, con el cual llevamos a cabo un
análisis exhaustivo en 24 genomas. Dicho análisis dio como resultado la identificación
de 77 miembros de la familia NAC en papaya. Este estudio resulta de gran importancia
debido a que las distintas bases de datos de FT no reportan secuencias “curadas”
(curación de secuencias = proceso mediante el cual se verifican la veracidad de los
datos mediante corroboración manual y mediante criterios establecidos para la
inclusión de cada secuencia), tal es el caso de la base de datos Plant Transcription
Factor Database (PTFDB versión 2.0, http://planttfdb.cbi.edu.cn/index.php?sp=Cpa), la
cual reporta 82 miembros para la familia NAC en papaya, de los cuales solamente el
56.4% presenta los cinco subdominios, aunado a que un gran número de secuencias
se encuentran truncadas, o no presentan la región activación transcripcional TAR.
Dentro estas secuencias, se encontró que algunas de ellas no presentan la
conservación esperada en el dominio NAC, de modo que algunas bases de datos de
dominios proteicos, como es el caso de la base Prosite (http://prosite.expasy.org/), no
reconocen motivo alguno dentro de las secuencias. Debido a esto la base de datos
PTFDB en su versión 3.0 reporta un número menor de miembros probables para esta
familia en papaya (70 secuencias), aunque otras bases de datos como TreeTFDB
(versión 1.0 http://treetfdb.bmep.riken.jp/index.pl) reporta 80 secuencias NAC para
esta especie.
Una gran variedad de secuencias NAC han sido implicadas en diversos roles en
respuesta a estrés abiótico, defensa contra diversos patógenos, y en la regulación de
los programas de desarrollo (Yang et al., 2011; De Oliveira et al., 2011). He et al.
(2005) reportaron un miembro de la familia NAM involucrado en el desarrollo de raíces
laterales y en respuesta a estrés salino. Balazadeh et al., (2010) demostró que el gen
ANAC092 está involucrado en la senescencia inducida por estrés salino, sugiriendo
que junto con otras proteínas NAC poseen un rol en la regulación de la expresión de
genes asociados a la senescencia.
89
Capítulo III
Kim et al., (2008) demostraron la participación del gen ANAC040 (NTL8) en el control
del tiempo de floración y de germinación durante estrés salino, mientra que el gen
NTL9 de Arabidopsis desempeña un papel fundamental en la respuesta a estrés
osmótico y durante la senescencia (Yoon et al., 2008).
La mayoría de los genes en respuesta a sequía o estrés osmótico responden a través
de la señalización en respuesta a ABA. Los FT's WRKY, MYC y MYB se encuentran
estrechamente relacionados en dicha señalización mediada por ABA. La sequía y la
salinidad alteran el nivel y la acumulación de este metabolito, el cuál desempeña un
papel importante en la adaptación de las plantas al estrés abiótico. Muchos de los
genes responsivos a ABA contienen el elemento en cis ABRE dentro de su secuencia
promotora.
Se encontró un gran número de elementos en cis en respuesta a estrés abiótico y
biótico (1,500 pb río arriba) en los cinco genes seleccionados (CpNAC1, CpNAC4,
CpANC5, CpNAC12 y CpNAC39). Numerosos sitios ABRE fueron encontrados en las
secuencias promotoras de los genes analizados de papaya. CpNAC4 presentó13
elementos ABRE, nueve sitios ERD1, ocho elementos MYB, seis elementos W-box, un
elemento DRE y un elemento ERE. Fujita et al., (2004) reportaron para el gen
ANAC072, el cual es ortólogo de CpNAC4, cuatro sitios ABRE, un sitio MYC, dos sitios
MYB, y un sitio DRE. De igual manera Yang et al., (2011) reportó numerosos sitios
ABRE en la región promotora de SlNAC3, así como seis sitios de reconocimiento para
los FT's MYB. CpNAC5 presentó ocho sitios ABRE, cinco sitios ERD1, cuatro sitios
MYC, cinco sitios W-Box, dos sitios DRE y un sitio PRE. Muchos genes inducidos por
la sequía y la salinidad, como RD29A, contienen sitios ABRE y DRE/CRT en sus
regiones promotoras lo que significa que son activados por estrés abiótico (Kant et al.,
2007). La aportación de estos análisis es valiosa, ya que permiten la inferencia de la
posible participación de estos genes en respuesta a distintos tipos de estrés, siendo
candidatos
idóneos
para
la
subsecuente
caracterización
de
su
expresión
transcripcional ante diversos tipos de estrés. De todos estos análisis, podemos deducir
que los cinco genes CpNAC seleccionados son candidatos indóneos para su posterior
análisis en la corroboración de su participación frente a distintos tipos de estrés
abiótico, y podemos inferir que las respuestas de cada gen, ante múltiples estreses se
encuentran estrictamente reguladas mediante las secuencias en cis encontradas en
90
Capítulo III
cada uno de sus promoteres. Por otro lado, la evidencia obtenida sugiere un Crosstalk
en las respuestas de estrés biótico y abiótico en Arabidopsis.
Se ha reportado la existencia al menos de 131 genes NAC en Arabidopsis, mientras
que en arroz (var. japónica) han sido identificadas 106 secuencias. Con la
disponibilidad del genoma de papaya, se ha podido realizar un sin número de
aproximaciones funcionales de diversos genes, mediante comparación in silico con
secuencias previamente reportadas. Estas herramientas de última generación, como lo
es el análisis masivo de datos, han permitido dar grandes pasos en la comprensión de
la regulación de los genes, así como de la organización de los genomas. En este
trabajo se reporta la caracterización de una familia de factores de transcripción en una
planta frutal tropical como lo es papaya. Hasta la fecha, no se cuenta con reportes
sobre la caracterización de genes NAC para papaya, ya que son funcionalmente
desconocidos en plantas tropicales.
91
Capítulo III
3.5 REFERENCIAS
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97
Capítulo IV
CAPÍTULO IV EXPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL DE GENES NAC DE C.
papaya ANTE DIFERENTES CONDICIONES DE ESTRÉS ABIÓTICO
4.1 INTRODUCCIÓN
Las plantas son organismos sésiles que se encuentran constantemente expuestas a
cambios ambientales y en ocasiones se ven amenazadas por los distintos factores
ambientales que se presentan en el entorno, estos estímulos guían a una regulación
fisiológica y por lo general a un cambio en el programa de desarrollo. Debido a esto,
las plantas necesitan percibir y procesar los estímulos ambientales tales como la luz,
la temperatura, el estado del agua y la disponibilidad de nutrientes con el fin de crecer
y desarrollarse debidamente, pero en condiciones ambientales adversas varias
señales restringen el crecimiento y el desarrollo de las plantas (Das y Pandey, 2010;
Lefebvre et al., 2009).
Existen dos clases principales de estrés en plantas, el biótico y el abiótico, los cuales
pueden dificultar y amenazar la supervivencia de dichos organismos. El estrés abiótico
es el resultado del impacto negativo de un factor ambiental, factor inerte, sobre un
organismo viviente. Las respuestas que las plantas producen ante las condiciones
específicas de estrés, se encuentran reguladas mediante la activacíon de genes
específicos, que desencadenan mecanismos moleculares de señalización, que tienen
como objetivo proteger al organismo y resarcir el daño ocasionado. Por ejemplo, en el
caso de la sequía, los daños en las plantas pueden ser reducidos considerablemente
mediante la acumulación de osmolitos compatibles, tales como la prolina, el cual
disminuye el potencial osmótico en el citosol facilitando la captación de agua,
protegiendo a las proteínas de la desnaturalización y a la célula de los efectos tóxicos
de las especies reactivas de oxígeno (ROS; Das y Pandey, 2010).
Como resultado de las diversas condiciones ambientales estresantes, el desarrollo y el
crecimiento de las plantas se ve seriamente afectado ocasionando bajos rendimientos
y por lo tanto ocasionando grandes pérdidas en la industria agrícola, esto aunado a los
efectos secundarios adversos en la sociedad, como resultado de una baja o nula
producción agroalimentaria (CGIAR et al., 2012).
Las respuestas ante el estrés varían dependiendo del tipo y de la intensidad de éste,
aunque en algunas ocasiones diferentes estreses poseen mecanismos moleculares
99
Capítulo IV
encontrados (cross-talks), es decir, comparten elementos dentro una ruta de
señalización determinada. Como ejemplo, podemos mencionar algunos mensajeros
secundarios como el (Ca2+), las hormonas y las ROS (Lefebvre et al., 2009). Aunado a
esto, las plantas no solo tienen que hacer frente a un tipo de estrés determinado, sino
que deben lidiar con frecuencia con la combinación de ellos incluido el estrés biótico.
Como ejemplo de las condiciones ambientales adversas, tenemos el efecto de la
temperatura, la cual varía ampliamente desde el congelamiento hasta temperaturas
por encima de los 45°C. No se conoce mucho acerca del mecanismo molecular que
conlleva a la tolerancia natural ante este tipo de estrés. Las bajas temperaturas y el
congelamiento son un factor limitante para la distribución de las especies vegetales,
dicho estrés promueve un cambio en la expresión de genes, en la composición de la
membrana lipídica, en la acumulación de osmolitos compatibles, en el aumento
transitorio de la concentración endógena de ABA y la disminución del crecimiento. Las
bajas temperaturas también conllevan a un estrés por deshidratación, mediante la
reducción de la capacidad de absorción de agua por la raíz y el subsecuente
transporte a través del xilema (Smallwood y Bowles, 2002). Por otra parte, la sequía y
la salinidad de los suelos, se encuentran entre los principales factores ambientales que
limitan la productividad y el potencial de crecimiento de las plantas. Las plantas se han
adaptado a los diferentes retos que impone el medio ambiente mediante respuestas
dinámicas que involucran ajustes a nivel fisiológico, bioquímico y molecular,
permitiendo de este modo sobrevivir bajo estas variables ambientales (Nakashima et
al., 2012).
Las restricciones ambientales inducen la producción de la hormona ácido abscísico
(ABA). Esta molécula desempeña un papel fundamental en la respuesta primaria al
estrés en plantas, mediando la regulación del cierre estomático y guiando la activación
de una gran número de genes, a través de los elementos regulatorios en cis
encontrados en sus cajas promotoras, permitiendo de este modo la tolerancia ante
distintos tipos de estrés (Nakashima et al., 2009). Muchos genes responsivos al estrés
han sido identificados en modelos vegetales como arroz y Arabidopsis, mediante
técnicas tales como análisis de microarreglos. Estos genes inducidos por el estrés
pueden desencadenar la síntesis de proteínas funcionales y/o metabólicas. Entre las
proteínas funcionales se encuentran las proteínas hidrofílicas, incluidas las LEA (late
embryogenesis abundant) y las dehidrinas, y las enzimas que son requeridas para la
síntesis de osmoprotectores tales como la prolina y azúcares (Yamaguchi y Shinozaki,
100
Capítulo IV
2006). Entre las proteínas regulatorias que son activadas en respuesta a estrés se
incluyen los factores de transcripción (FT's) tales como DREBs (dehydrationresponsive
element-binding
proteins),
AREB
(ABA-responsive
element-binding
proteins), NAC (NAM-ATAF1/2-CUC2), WRKY, entre otras. Estas proteínas regulan la
respuesta ante el estrés abiótico y se cree que desempeñan un papel primordial en la
tolerancia a estos factores ambientales adversos en plantas (Morishita, et al., 2009).
Las proteínas NAC has demostrado estar involucradas en una amplia gama de
procesos de desarrollo vegetal así como participar en la regulación a distintos tipos de
estrés abiótico. Hu et al., (2006) reportaron que la sobreexpresión del gen responsivo
al estrés SNAC1 aumentó la tolerancia a la sequía y a la salinidad en plantas de arroz
sin afectar los rendimientos. Nogueira et al., (2005) reportan que el gen SsNAC23, el
cual es homólogo a OsNAC5 de arroz, está asociado con las bajas temperaturas, la
herbivoría y el estrés hídrico en caña de azúcar. Por otro lado Jeong et al., (2010)
reportaron que la sobreexpresión de OsNAC10 mejora la tolerancia en arroz a estrés
abiótico en condiciones de campo, y mediante un análisis de microarreglos,
demostraron que este gen es inducido por ABA, sequía y alta salinidad. En el 2004
Tran et al., identificaron tres genes pertenecientes a la familia NAC de Arabidopsis,
ANAC019, ANAC055 y ANAC072, los cuales eran inducidos por ABA, sequía y alta
salinidad.
Hasta la fecha, la expresión y la función de los genes NAC en C. papaya no ha sido
reportada. En este capítulo se evaluó la expresión transcripcional de cinco genes NAC
de C. papaya cv. Maradol ante cuatro tratamientos de estrés abiótico; temperatura alta
(40ºC), bajas temperaturas (4ºC), salinidad y sequía. Estos cinco genes demostraron
ser homólogos a genes de Arabidopsis involucrados en distintos procesos de estrés
abiótico. Este trabajo es una primera aproximación al estudio de los FT's NAC de
papaya involucrados en diversos tipos de estrés abiótico, y es una exploración de los
mecanismos moleculares que se desencadenan en respuesta al estrés abiótico en
plantas tropicales
101
Capítulo IV
4.2 MATERIALES Y MÉTODOS
4.2.1 TRATAMIENTOS DE ESTRÉS ABIÓTICO PARA C. papaya
Para los experimentos de estrés en papaya (temperaturas extremas de 4°C y 40°C,
sequía y salinidad), semillas de esta planta cv. Maradol (Semillas del Caribe,
Especialistas en papayas, S.A. de C.V.) fueron germinadas siguiendo las indicaciones
del proveedor, las cuales fueron crecidas en un cuarto de cultivo a 27±2°C en un
régimen de 16:8 h luz/oscuridad y una densidad de flujo de fotones de 120 μmol m−2
s−1. Para los experimentos de estrés por temperaturas (4ºC y 40ºC) plantas de cuatro
semanas fueron sometidas a diferentes tiempos de exposición de estrés (0, 2, 4, 8 y
24 horas) en una cámara de incubación de temperatura controlada. Para el tratamiento
de sequía, plantas de cuatro semanas fueron colocadas en cultivo hidropónico con
medio Hoagland-E (fuerza iónica completa) durante tres semanas para su
aclimatación, en las condiciones de temperatura y luz previamente mencionadas. Para
la imposición del estrés por sequía, las plantas de papaya fueron retiradas del cultivo
hidropónico, las raíces fueron secadas sutilmente con papel absorbente para evitar
daños en estas, y posteriormente las plantas se dejaron deshidratar sobre un papel
filtro Whatman 3MM a temperatura ambiente con una humedad relativa de 60% a
diferentes tiempos (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Este tratamiento se llevó a cabo de acuerdo
con Yamaguchi-Shinozaki y Shinozaki (1994). Para los tratamientos de estrés salino,
plántulas de cuatro semanas fueron colocadas en un cultivo hidropónico con solución
nutritiva Hoagland-E, durante tres semanas, en las mismas condiciones de
temperatura y luz. Subsecuentemente las plántulas fueron colocadas en tratamiento
de estrés salino en una solución de Hoagland con 300mM de NaCl, en diferentes
períodos (0, 0.5, 1, 2, 4, 8 y 24 hrs). Las muestras fueron inmediatamente congeladas
en nitrógeno líquido hasta su posterior análisis. El grupo control permaneció en
solución nutritiva Hoagland-E en los mismos períodos.
Para dichos análisis se hicieron cuatro replicas experimentales, teniendo un total de
cinco plantas para cada uno de los tratamientos. Una vez finalizado el tratamiento
correspondiente, se procedió a realizar la extracción del ARN de la hoja y de la raíz de
cada lote de plantas.
102
Capítulo IV
4.2.2 EXTRACCIÓN DE ARN Y SÍNTESIS DE ADNc
El ARN de cada lote de plantas fue extraído de acuerdo a la metodología de TRIzol®
(Cat. 15596-026, Invitrogen) siguiendo las instrucciones del proveedor, usando 200 mg
de tejido de hoja y raíz por separado de cada uno de los diferentes tratamientos y
posteriormente digerido con DNasa (Promega). El ARN de cada muestra fue
cuantificado con mediante un equipo NanoDrop 1000 v.3.7 (Thermo-Scientific) y la
integridad del material fue corroborada en un gel de agarosa al 1.5% (w/v). Para la
síntesis de ADNc se utilizó la tecnología SMART™ (Cat. 635000, Clontech) siguiendo
las instrucciones del proveedor y utilizando 1µg de ARN para la síntesis de la primera
cadena.
4.2.3 CLONACIÓN DE LOS GENES CpNAC SELECCIONADOS
Cinco genes NAC con alta probabilidad de estar relacionados con algún tipo de estrés
abiótico fueron clonados en los vectores TOPO-TA® (Invitrogen, Cat.#K4500-01) y
pGem®-T easy (Promega, Cat #A1360). La clonación positiva fue evaluada mediante
ensayos de plaqueo "Blue/White Colony". Las secuencias resultantes fueron
sometidas al NCBI/GenBank.
4.2.4 DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL
Para la determinación de la actividad transcripcional de los cinco genes NAC
seleccionados, se realizó un análisis de expresión tejido específico, mediante PCR
semicuantitativo, en los diferentes tratamientos de estrés abiótico propuestos. Por otra
parte, se muestrearon en paralelo a las condiciones de estrés, plantas de papaya no
sometidas a ningún tipo de estrés, las cuales se mantuvieron en condiciones óptimas
de crecimiento reportadas en el apartado 4.2.1, y se utilizaron como grupo control para
cada punto de los tratamientos. El gen constitutivo de la subunidad ribosomal 18S, se
usó como control interno de carga. Las concentraciones de los reactivos de la PCR
fueron las siguientes: 5µM de cada uno de los iniciadores, 50 ng de ADNc y 1u de
GoTaq® Flexi DNA polimerase (Promega, Cat. #M829). Los iniciadores para los genes
específicos (Tabla 4.1) fueron analizados en los programas en linea OligoAnalyzer IDT
(v3.1,
http://www.idtdna.com/analyzer/)
y
Oligo
Calc
(http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html) con el fin de descartar la
posible formación de horquillas, dimerización y/o heterodimerización. Posteriormente
103
Capítulo IV
se realizó la amplificación de los genes seleccionados por PCR para los tejidos de hoja
y raíz de C. papaya cv. Maradol.
Tabla 4. 1 Iniciadores usados para clonación y análisis de expresión transcripcional de los
genes NAC seleccionados de papaya
Nombre
Phytozome
Iniciador Forward (5'-3')
Iniciador Reverse (5'-3')
C. papaya ID
CpNAC5
evm.model.supercontig_64.115
5'-ATG ACG TCA CCT
ACA GCC GAT
5'-AAA TGG CTT CTG
CAG GTA CAT G
CpNAC4
evm.model.supercontig_80.93
5'-ATG GGT GTG CAG
CAG ATG G
5' GAC GGA CTT GAG
CTT GTA GC
CpNAC1
evm.model.supercontig_1.48
5'-ATG GCG CGA AAA
TCC AAC TC
5'-TTG AAA AAT ATC
ATC GTA CAA TAT
CpNAC39
evm.model.supercontig_195.35
5'-ATG TCG CGA GAG
ACG CAG AT
5'-CAG AAA GCG AAC
ATG GTC GC
CpNAC12
evm.model.supercontig_14.101
5'-ATG GAT AAT GTT TCA
AAG GAT AAT
5' ATA GTT CCA GAG
GCA ATA TAA AT
104
Capítulo IV
4.3 RESULTADOS
4.3.1 EXTRACCIÓN DE ARN Y SÍNTESIS DE ADNc
Se extrajo ARN total de las plantas de papaya puestas en tratamientos de 40ºC y 4ºC
en diferentes tiempos (Figura 4.1 y 4.2). Se realizaron extracciones tanto para hoja y
raíz para cada uno de los tratamientos de temperatura.
Figura 4. 1 ARN total de plantas de papaya sometidas a 40°C en diferentes tiempos de
exposición (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5%
Figura 4. 2 ARN total de plantas de papaya sometidas a 4°C en tiempos de exposición (0, 2, 4,
8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5%
105
Capítulo IV
En la figura 4.3 se aprecia un gel de agarosa con las muestras de ARN de los
tratamientos de sequía a las 0, 2, 4, 8 y 24 horas.
Figura 4. 3 Muestras de ARN total de plantas de papaya sometidas a diferentes tiempos de
estrés por sequía (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5%
Se obtuvo ARN de los tratamientos de salinidad (300mM NaCl) en los diferentes
tiempos de exposición ante este estrés (0, 0.5, 1, 2, 4, 8 y 24 horas). En la figura 4.4
se aprecia un gel de agarosa con las muestras de ARN total tanto de hoja como de
raíz.
Figura 4. 4 Muestras de ARN total de plantas de papaya sometidas a diferentes tiempos de
estrés por salinidad (300mM NaCl). Gel de agarosa al 1.5%
Se sintetizó el ADN complementario (ADNc) a partir de 1µg de ARN total para cada
uno de los tratamientos. Una vez obtenida la segunda cadena se procedió a cargar 2µl
de cada reacción de síntesis en un gel de agarosa al 1.5% (w/v). En la figura 4.5 y 4.6
se aprecian el ADNc obtenido para cada uno de los tratamientos de temperatura.
106
Capítulo IV
Figura 4. 5 Muestras de ADNc de plantas sometidas a tratamiento de 40ºC en diferentes
tiempos (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5%
Figura 4. 6 Muestras de ADNc de plantas sometidas a tratamiento de 4ºC en diferentes
tiempos (0, 2, 4, 8 y 24 horas). Gel de agarosa al 1.5%
En la figura 4.7 se observa el ADNc de los tratamientos de sequía, sintetizado a partir
de 1µg de ARN total de cada muestra.
107
Capítulo IV
Figura 4. 7 Muestras de ADNc de plantas sometidas a tratamiento de sequía en diferentes
tiempos. Gel de agarosa 1.5%.
En la figura 4.8 se observa el ADNc sintetizado a partir de 1µg de ARN total para cada
uno de los tratamientos de salinidad en papaya.
Figura 4. 8 Muestras de ADNc de plantas sometidas a tratamiento de salinidad (300mM) en
diferentes tiempos. Gel de agarosa 1.5%.
4.3.2 DETERMINACIÓN DE LA EXPRESIÓN TRANSCRIPCIONAL
Se realizaron análisis de expresión transcripcional de los cinco genes NAC
seleccionados de papaya (CpNAC1, CpNAC4, CpNAC5, CpNAC12 y CpNAC39) en
los diferentes tratamientos de temperaturas extremas (4°C y 40°C), sequía, salinidad
(300mM NaCl) y sus respectivos controles sin estrés, para los tejidos de hoja (H) y
Raíz (R). Por otro lado, se visualizó el patrón trnascriptional los genes HSP70 y
DREB2C. Estos dos últimos genes fueron utilizados como controles para los diferentes
estreses, ya que se ha reportado que dichos genes son transcripcionalmente
responsivos ante distintos tipos de estrés como lo es la sequía, temperaturas extremas
y salinidad. En la figura 4.9 se pueden apreciar los distintos patrones de expresión
transcripcional de los cinco genes seleccionados ante los tratamientos de estrés por
baja temperatura (4ºC) en los distintos períodos muestreados (0, 2, 4, 8 y 24 h).
108
Capítulo IV
Figura 4. 9 Patrón de expresión transcripcional en dos diferentes tejidos, hoja y raíz, de los
cinco genes NAC seleccionados de C. papaya sometidos a estrés por baja temperatura (4°C).
Los nombres de los genes homólogos de Arabidopsis se encuentran a un lado del nombre del
gen de papaya. Se utilizó el gen de la subunidad ribosomal 18S como control de carga.
Del mismo modo, en la figura 4.10, se puede apreciar el patrón de la expresión
transcripcional de los cinco genes NAC de papaya, CpNAC1, CpNAC4, CpNAC5,
CpNAC12, CpNAC39, ante el tratamiento de estrés por alta temperatura (40°C) en los
distintos períodos muestreados (0, 2, 4, 8 y 24 h.), utilizando como control de carga el
gen de la subunidad ribosomal 18S.
Figura 4. 10 Patrón de expresión transcripcional en dos diferentes tejidos, hoja y raíz, de los
cinco genes NAC seleccionados de papaya sometidos a estrés por alta temperatura (40°C).
109
Capítulo IV
Los nombres de los genes homólogos de Arabidopsis se encuentran a un lado del nombre del
gen de papaya. Se utilizó el gen de la subunidad ribosomal 18S como control de carga
Para el tratamiento de estrés por sequía se observa en la figura 4.11, para los
períodos propuestos (0, 2, 4, 8 y 24 horas) los distintos perfiles de la expresión
transcripcional de los genes NAC seleccionados de papaya (CpNAC1, CpNAC4,
CpNAC5, CpNAC12 y CpNAC39),
Figura 4. 11 Perfil de expresión transcripcional en dos diferentes tejidos, hoja y raíz, para los
cinco genes NAC seleccionados de papaya sometidos a estrés por sequía así como para el
grupo control. Se utilizaron los genes HSP70 y DREB2C como control positivo ante el estrés
por sequía. Los nombres de los genes homólogos de Arabidopsis se encuentran a un lado del
nombre del gen de papaya. Se utilizó el gen de la subunidad ribosomal 18S como control de
carga
De igual modo, para el estrés por salinidad (300mM NaCl) se obtuvieron los perfiles de
expresión transcripcional para los tejidos de hoja y raíz de los cinco genes NAC de
papaya seleccionados y de los dos genes utilizados como control positivo (HSP70 y
DREB2C), los cuales se pueden observar en la figura 4.12 mostrada a continuación.
110
Capítulo IV
Figura 4. 12 Perfil de expresión transcripcional de los genes NAC seleccionados de papaya
para el estrés por salinidad así como para el grupo control. Se utilizaron los genes HSP70 y
DREB2C como control positivo ante el estrés. Los nombres de los genes homólogos de
Arabidopsis se encuentran a un lado del nombre del gen de papaya. Se utilizó el gen de la
subunidad ribosomal 18S como control de carga
Como se aprecia en las figuras 4.10 y 4.11, existe una expresión basal en la raíz en el
tiempo cero para el gen CpNAC5. La expresión transcripcional de este gen, para el
tratamiento en bajas temperaturas, no se aprecia un cambio notorio en la hoja, siendo
constante la expresión en la raíz durante los períodos de tratamiento. La expresión
relativa del gen CpNAC5 aumentó en el tratamiento por alta temperatura (40ºC) desde
las dos h. en la hoja, manteniéndose constante en los tratamientos, y teniendo una
mayor expresión que en raíz. Para el tratamiento por sequía (figura 4.11), se aprecia
un aumento gradual con respecto al tiempo de exposición del estrés, empezando
desde el tiempo cero para hoja y desde las dos horas en la raíz, a diferencia del
control, el cual presenta una expresión relativa basal muy tenue. De la misma forma
que en la sequía, para el tratamiento de salinidad (Figura 4.12) se aprecia un aumento
gradual en la expresión de este gen, conforme al tiempo de exposición del estrés,
alcanzando una mayor expresión a las 24 horas en la hoja y a las cuatro horas para la
raíz, a diferencia del lote control.
Para el gen CpNAC4, en el tratamiento por bajas temperaturas (Figura 4.9), hubo un
aumento en la expresión transcripcional en la hoja y en la raíz desde las dos horas.
Para el tratamiento por alta temperatura (Figura 4.10) se obtuvo un incremento en la
111
Capítulo IV
expresión a partir de las dos horas, el cual aumenta con respecto a los tiempos de
tratamientos, y para el caso de la expresión en raíz, esta aumenta a partir de dos
horas y se mantiene uniforme en los tiempos de tratamiento posteriores. Para el
tratamiento de sequía (Figura 4.11) se observó un incremento gradual en la expresión
del gen de un modo más tardío en comparación con el gen CpNAC5, apreciándose el
nivel más alto de expresión en hoja a las ocho y 24 horas de tratamiento, esto es
similar en raíz pero con una expresíon relativa menor que en hoja. Para el tratamiento
por salinidad (Figura 4.12) se obtuvo un perfil de expresión que va en aumento con
respecto al tiempo de tratamiento, teniendo una expresión baja en el tiempo cero para
hoja y una expresión transcripcional más elevada a las 24 horas, este patrón de
expresión es similar en raíz, pero con intensidades relativas de expresión más bajas.
Para el gen CpNAC1, para los tratamientos por temperaturas (Figura 4.9 y Figura
4.10), no se aprecia expresión transcripcional en ninguno de los puntos muestreados.
Para el caso de sequía (Figura 4.11) se observa que los patrones de expresión
transcripcional van en aumento con respecto a los tiempos de exposición al estrés
tanto para hoja como para raíz, teniendo el mayor nivel de expresión relativa a las 24
horas para ambos casos. De igual forma para salinidad (Figura 4.12) se observó la
inducción transcripcional de este gen a partir de las dos horas en hoja y a las cuatro
horas en la raíz.
El gen CpNAC12, para el tratamiento por baja temperatura (Figura 4.9) al igual que
CpNAC1, no se observa expresión en el tiempo cero, en hoja. Por el contrario,
tenemos que la expresión transcripcional de este gen en raíz es alta y activa para
todos los tiempos del tratamiento en el grupo control, manteniéndose constante a lo
largo de los períodos analizados. Por otra parte, la expresión transcripcional en raíz
encondiciones de estrés posee una tendencia disminuir a medida que avanzan el
tiempo en exposición ante dicho estrés, y posteriormente tiende a aumentar hasta
retomar los valores iniciales de expresión a las 24 horas. Para el tratamiento por alta
temperatura (Figura 4.10), al igual que el gen CpNAC4, se observó un incremento en
la expresión transcripcional a las cuatro horas de exposición al estrés. De igual forma
que en el tratamiento por baja temperatura en raíz, se obtuvo un perfil continuo en la
expresión de este gen en el grupo control, y una disminución de la expresión a las dos,
cuatro y ocho horas, incrementándose a las 24 horas. Para el caso de sequía (Figura
4.11) se hubo un incremento en la expresión transcripcional de este gen en la hoja,
112
Capítulo IV
teniendo su valor relativo máximo a las ocho horas, en
comparación con el
tratamiento control el cual presenta una expresión basal ligera para hoja. En cuanto a
la raíz, este gen presentó un nivel de expresión transcripcional alto, similar al del grupo
control, disminuyó a las cuatro horas pero incrementó a las ocho horas, teniendo su
valor máximo de expresión a las 24 horas de exposición al estrés. En el estrés por
salinidad (Figura 4.12) se observa un incremento en la expresión de este gen en la
hoja a partir de las cuatro horas teniendo su valor máximo de expresión transcripcional
a las 24 horas, en comparación con el grupo control que se mantiene a un nivel basal
bajo y constante. Para la raíz, el perfil de expresión sigue un patrón similar al de
sequía, disminuye a la hora del tratamiento y aumentando a las cuatro horas del
tratamiento, seguido de un leve descenso a las ocho y 24 horas.
El gen de papaya CpNAC39 (asociado a membrana), la respuesta transcripcional no
fué activada en los tratamiento de temperaturas (Figura 4.9 y 4.10). Para el caso del
estrés por sequía (Figura 4.11), la expresión relativa de este gen incrementó a las
ocho horas en hoja y a las 4 horas en raíz, en comparación con el grupo control, el
cual presenta una expresión basal baja en la raíz. Para estrés salino (Figura 4.12) se
observó un incremento en la expresión a partir de los 30 min para hoja, teniendo su
nivel máximo de expresión a las cuatro horas. Para el caso de la raíz hubo una
expresión baja a los dos horas la cual disminuye en los posteriores tiempos de estrés.
113
Capítulo IV
4.4 DISCUSIÓN
Los Factores de Transcripción y las moléculas de señalización, son consideradas
como la categoría más importante de genes involucrados en la regulación de la
expresión en cascada de genes responsivos a los diversos tipos de estrés (Gong et
al., 2010).
Con solo 24,746 genes predecidos, papaya contiene el menor número de genes para
la mayoría de la plantas eudicotiledoneas secuenciadas. Ming et al., (2008) reportan
una reducción en la mayoría de sus familias génicas y rutas biosintéticas, quienes
proponen esta planta como un modelo para estudiar rutas y redes de señalización
complejas. Papaya no contiene duplicaciones genómicas globales (WGD) recientes,
dando explicación de las bajas oportunidades de subfuncionalización, lo que implica
que los genes de papaya sean más representativos en Angiospermas que los propios
genes de Arabidopsis. El genoma de papaya contiene 77 secuencias con el dominio
conservado NAC, los cuales fueron identificadas en este trabajo como CpNAC’s.
En este estudio caracterizamos cinco genes de la familia NAC de C. papaya cv.
Maradol con base en la homología a genes NAC de Arabidopsis involucrados en
respuesta a estrés abiótico (ANAC002/ATAF1,
ANAC019,
ANAC029/ATNAP,
ANAC040/NTL8, ANAC055/ATNAC3, ANAC072/RD26 y ANAC092/ATNAC2/ORE1).
Subsecuentemente determinamos los perfiles de expresión transcripcional de los cinco
genes de papaya en dos diferentes tejidos de acuerdo a los tratamientos de estrés
planteados. El patrón de expresión de los cinco genes, en los cuatro diferentes
tratamientos de estrés, reflejó una diversificación de la respuesta transcripcional de
cada uno de los genes de la familia NAC de papaya.
El gen CpNAC4 codifica para una proteína de 339 aa, la cual se predijo con base en la
homología a los genes de Arabidopsis ANAC019, ANAC055 y ANAC072 responsivos
durante diversos tipos de estrés abiótico. CpNAC4 mostró un perfil de expresión bajo,
pero diferencial con respecto al tiempo cero, para ambos tratamientos de frío como de
calor, con una expresión transcripcional mayor a las dos horas a 4ºC. Esto no es de
sorprenderse debido a que existen reportes como el de Nakashima et al., (1997)
quienes señalan que el gen ERD1, el cual es activado por un factor de transcripción
NAC, es fuertemente inducido por deshidratación pero no por frío, calor, metales
114
Capítulo IV
pesados, ni es inducido por reguladores de crecimiento tales como auxinas,
citocininas, ácido giberélico y ABA, sugiriendo que dicho gen pertenece a la ruta
independiente del ABA. Dicho gen fue altamente regulado por los tratamientos de
sequía y salinidad similar a lo reportados por Fujita et al., (2004), los cuales señalan
una fuerte activación de este gen a los 30 min de estrés por deshidratación,
incrementando hasta las 24 horas y empleando el mismo protocolo que el utilizado en
este estudio. Para el caso de salinidad, este gen de papaya incrementó su actividad
transcripcional a partir de los 30 min. y mantuvo un nivel alto de expresión para los
posteriores tiempos de exposición al estrés.
Tran et al., (2004) reportaron que la expresión del gen ANAC055 es ligeramente
inducida a las dos horas de tratamiento por sequía, ABA y ácido jasmónico (JA), pero
es fuertemente inducido por el tratamiento de salinidad. ANAC019 es fuertemente
inducido por deshidratación, ABA y salinidad dentro de las 2 h de tratamiento y es
ligeramente inducido por JA a las 5 h. El gen ANAC072 fue el que mostró una
activación transcripcional más temprana (1 h) en los tratamientos de deshidratación,
salinidad y ABA. ANAC072 fue inducido ligeramente por frío a las 10 horas, mientras
que ANAC055 y ANAC072 no mostraron acumulación alguna de transcrito, señalando
que la expresión de estos tres genes es inducida principalmente por deshidratación y
estrés por salinidad. Los datos anteriores hacen suponer que nuestro gen CpNAC4, el
cual es homólogo a ANAC072, desempeña un papel similar en el estrés abiótico, y
muy probablemente sea la causa por el cual no se encuentre relacionado fuertemente
con el estrés por temperaturas bajas, pero si por estrés hídrico y estrés salino.
CpNAC4 presenta numerosos sitios ABRE, MYC, ERD1 y W-box, al igual que la
secuencia homóloga ANAC072 la cual ha sido reportada y caracterizada por Fujita et
al., en 2004.
La expresión de genes duplicados está más correlacionada a las respuestas de los
programas de desarrollo que a los estreses ambientales, como es el caso de las
diferentes respuestas transcripcionales en los genes parálogos de Arabidopsis
ANAC019, ANAC055 y ANAC072, sugiriendo una rápida evolución de los genes
duplicados en respuesta a factores externos (Blanc and Wolfe, 2004). ANAC072 posee
una fuerte expresión transcripcional en varios tipos de estrés abiótico, incluyendo
estrés por bajas temperaturas, pero sus parálogos ANAC019 y ANAC055 muestran
baja expresión transcripcional ante sequía, NaCl y ABA, y no poseen actividad
115
Capítulo IV
transcripcional ante estrés por bajas temperaturas (4°C), en comparación con
ANAC072 (Tran et al., 2004). Ha et al., (2009) propusieron un modelo en el cual la
expresión de los genes duplicados diverge rápidamente en respuesta a los cambios
ocasionados por estreses bióticos y abióticos, mientras que las respuestas
transcripcionales asociadas a cambios en el desarrollo, asociadas a redes complejas
de regulación, cambian muy lento. Por otro lado, el gran número de genes duplicados
expanden las redes de regulación transcripcional y facilitan al organismo adaptarse a
los cambios del medio ambiente (Ha et al., 2009). Por otro lado, hay que considerar
que un gen ortólogo seleccionado, puede no tener una función conservada, y este
aspecto es dependiente de la distancia filogenética y por lo tanto de la divergencia en
el tiempo de la rápida evolución de las redes regulatorias génicas (Price et al., 2009).
Por otro lado, el gen CpNAC5 fué fuertemente inducido por las temperaturas altas,
tanto para hoja como para raíz, desde los 15 primeros min., y mantuvo un perfil de
expresión constante hasta las 2 h del tratamiento. Por el contrario, no hubo inducción
por las temperaturas bajas, teniendo un nivel de expresión similar al tiempo cero. Lu et
al., (2007) reportaron que para el gen ANAC002/ATAF1, gen ortólogo a nuestro gen de
CpNAC5, es fuertemente inducido por sequía y ABA pero inhibido al ser restaurado el
riego con agua. Las mutantes ataf1 sobreexpresan fuertemente los genes responsivos
a estrés COR47, ERD10, KIN1, RD22 y RD29, sugiriendo que dicho gen participa
como regulador negativo en la señalización del estrés por sequía. Hasta la fecha, no
se había determinado el patrón de expresión de este gen ante el estrés provocado por
la salinidad, dándonos muestra de la participación de este gen ante una gran
diversidad de estreses y con una respuesta transcripcional temparana.
Para el caso de CpNAC12, para hoja, fue inducido fuertemente hasta las 24 horas del
tratamiento por calor. Para el caso de raíz, CpNAC12 presentó una expresión
transcripcional alta y constante en todos los puntos de los tratamientos, sugiriendo una
expresión basal fuete para este órgano vegetal. En el caso de CpNAC1, obtuvimos
una expresión transcripcional alta a las 2 h. de tratamiento por sequía y salinidad,
teniendo una expresión constante para los demás puntos. Guo y Gan (2006)
reportaron que el gen ANAC029/AtNAP, ortólogo a nuestro gen CpNAC1, está
involucrado en los procesos de senescencia en Arabidopsis, encontrando su expresión
solamente en hojas en proceso de senescencia en tiempos largos (2-3 semanas de
emergidas), demostrando que AtNAP es fuertemente inducido por la cascada de
116
Capítulo IV
señalización de Muerte Celular Programada (PCD, Programmed Cell Death). Los
autores reportaron que genes de la misma familia poseen funciones similares.
Balazadeha
et
al.,
(2011)
reportaron
que
la
sobreexpresión
de
ANAC092/AtNAC2/ORE1, gen ortólogo a CpANC12, causó la modificación en los
niveles de expresión de 78 de 170 genes (46%) conocidos en la senescencia (SAG's,
Senescence-Associated Genes). Este gen fué inducido por salinidad y por
acumulación de ROS.
Por último el gen CpNAC39 no presentó alteración alguna en los perfiles de expresión
llevados a cabo para los tratamientos de frío y calor. Esto pudiera ser debido a que su
homólogo en Arabidopsis, el gen ANAC040/NTL8, el cual es el octavo NAC con motivo
transmembrana según Kim et al., (2007a), se encuentra involucrado en estrés salino.
Kim et al., (2007b) reportaron que este gen controla la floración durante el estrés
salino, evitando la formación de brotes florales durante dicho estrés. La distribución de
este gen se limita a los tejidos vasculares de los tallos de la inflorescencia, raíces en
los pecíolos y en las nervaduras de las hojas. Kim y Park (2008) reportan que ANAC40
se expresa en la semilla en concentraciones elevadas de sal e inhibe la germinación.
Por otro lado, los autores reportan que este gen funciona como un regulador negativo
del ácido giberélico (GA, Gibberellic Acid).
La gran mayoría de los miembros de la familia NAC son conocidos por estar
involucrados de alguna u otra manera como reguladores transcripcionales en el estrés
biótico y abiótico. Un análisis detallado de la expresión de estos genes, en diferentes
condiciones ambientales, tales como estrés por sequía, estrés por salinidad, estrés por
deficiencia de nutrientes y estés biótico, nos ayudará a especular la función biológica
de cada uno de estos genes. Aunado a esto, es esencial la evaluación funcional de
cada uno de estos genes en las diferentes condiciones estresantes antes
mencionadas, esto con el fin de tener plena certeza de la participación de dichos
factores en la cascada de señalización en respuesta a los diversos tipos de estrés, y el
papel que desempeñan en la tolerancia o regulación de los factores ambientales
estresantes. Sin la corroboración física antes mencionada, todos los perfiles de
expresión de cada gen en cada uno de los tratamientos se quedan como predicciones
de una posible participación del gen en cierta condición o como una mera deducción
de la funcionalidad de un gen ante un estrés determinado.
117
Capítulo IV
4.5 REFERENCIAS
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121
Capítulo V
CAPÍTULO V DETERMINACIÓN DE LA FUNCIONALIDAD DE LOS GENES
NAC SELECCIONADOS
5.1 INTRODUCCIÓN
El estrés abiótico, es el factor más importante que afecta negativamente el crecimiento
y la productividad de las plantas, este puede reducir los rendimientos de un cultivo
hasta en un 70% (Agrwal et al., 2006). Los tipos de estrés abiótico más comunes que
afectan a las plantas son la sequía, las temperaturas extremas y la salinidad. A nivel
mundial, cerca del 22% de la tierra utilizada para cultivo es salina (FAO, 2004) y la
expansión de las áreas afectadas por la sequías se encuentran en aumento (Burke et
al., 2006).
Por otra parte, la transformación genética de plantas, la cual tiene sus orígenes en los
años 90, se ha convertido en una herramienta indispensable en la biología molecular
de plantas y en la investigación en el campo de la genómica funcional. (De Block et al.,
1984). La tecnología de la transformación genética es considerada como una
extensión de las tecnologías de mejoramiento en plantas (Zhong, 2001). Esta ofrece
una oportunidad única de mejoramiento, con la que se puede introducir material
genético foráneo, independientemente de las barreras entre especies, y mediante la
cual poder crear fenotipos con las características deseadas, que no se encuentran
disponibles en el germoplasma de las especies cultivables (Mishra y Slater, 2012).
Estas herramientas han sido ampliamente usadas en la búsqueda de plantas
tolerantes a los diversos tipos de estrés que impone el ambiente. Dentro de las
estrategias de la biología molecular y la genética, se encuentra el uso de proteínas
reguladoras capaces de modificar el metabolismo de la planta con el fin de poder
sobrellevar dichas condiciones. Los factores de transcripción, son una opción
altamente viable para estos fines, ya que desempeñan un rol importante en la
regulación de la expresión de genes en respuesta a una condición dada, por tal
motivo, son considerados como un poderoso blanco para la ingeniería genética en la
tolerancia a la sequía, las temperaturas extremas y los suelo salinos, debido a que la
sobreexpresión de estos puede desencadenar la regulación de un gran número de
genes en respuesta a dichos estreses (Nakashima et al., 2009).
Las proteínas NAC has demostrado estar involucradas en una amplia gama de
procesos de desarrollo vegetal, así como participar en la regulación de respuestas a
123
Capítulo V
distintos tipos de estrés abiótico. Numerosos estudios han demostrado que la
sobreexpresión de algunas de estos factores conduce al mejoramiento de la tolerancia
para un estrés dado. Wu et al., (2012) demostraron que la sobreexpresión del gen
ANAC042/JUNGBRUNNEN1 conlleva a una tolerancia a varios factores abióticos, ya
que este gen responsivo a daño mecánico, salinidad y a las especies reactivas de
oxígeno (ROS), desencadena la expresión de genes DREB2C, HSP, acumulación de
prolina y trehalosa, acumulación de citocininas, reducción en los niveles de
antocianinas, y varios genes responsivos a las ROS. Liu et al., (2011) reportan que la
sobreexpresión de un gen NAC de crisantemo DgNAC1 en tabaco incrementó la
tolerancia a salinidad. Tran et al., (2004) demostraron que los genes ANAC019,
ANAC055 y ANAC072 confieren mayor tolerancia a la sequía en Arabidopsis.
El principal objetivo del uso de la ingeniería genética en este trabajo es la
corroboración de la funcionalidad de dos de los genes NAC de C. papaya cv. Maradol
seleccionados, debido a que dichos genes presentan perfiles transcripcionales
responsivos a los tratamientos de estrés propuestos en el capítulo IV, y los ortólogos
de estos genes en Arabidopsis presentan características muy marcadas ante el estrés.
Para dicho fin, se recurrió a la transformación genética de plantas de N. tabaccum con
los genes CpNAC4 y CpNAC5, y se obtuvieron plantas de progenie F1 para su
subsecuente evaluación ante diversas condiciones estresantes.
124
Capítulo V
5.2 MATERIALES Y MÉTODOS
5.2.1 SOBREEXPRESIÓN EN N. tabaccum.
5.2.1.1 ESTANDARIZACIÓN DE LA TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE
TABACO
Se realizó la estandarización de la transformación de discos foliares de tabaco para la
expresión de la β-glucuronidasa (GUS) mediante el vector binario pCambia2301
conteniendo el gen gusA de E. coli. La cepa de A. tumefaciens (EHA105 +
pCambia230135SGUS) fue crecida en medio YEP con 50 mg L-1 Kanamicina y 100 mg L-1
Rifampicina. Se siguió el protocolo de Clemente, 2006. Para la infiltración con
Agrobacterium, se pusieron los explantes de tabaco en medio líquido de infiltración y
se colocaron en la cámara de vacio a 40cm Hg durante 5 min, la infiltración se realizó
tres veces. Posteriormente, los explantes fueron colocados en medio sólido de
inducción de brotes sin antibióticos y se dejó co-cultivando con la bacteria durante tres
días a 25ºC en oscuridad. Después del co-cultivo con A. tumefaciens, todos los
explantes fueron lavados con agua destilada estéril, por tres veces, para remover los
residuos de bacterias, y durante 5 min con una solución al 0.9%de NaCl.
Subsecuentemente
los
explantes
-1
fueron
colocados
en
medio
sólido
de
-1
selección/inducción, con 100 mg L de Cefatoxima, 200 mg L de Timentina y 150 mg
L-1 de Kanamicina. Posteriormente las plantas se pasaron a frascos gerber con medio
sólido de regeneración.
5.2.1.2 VECTOR DE TRANSFORMACIÓN PARA SOBREEXPRESIÓN DEL
GEN DE INTERÉS
Para la elaboración de la construcción o cassette de transformación, se usó el sistema
de clonación por PCR "Gateway®Tecnology" (Cat. 12535-019, Invitrogen). Dicha
tecnología altamente eficiente y rápida, facilita la construcción y expresión de un gen
de interés mediante la recombinación en sitios específicos de un clon, permitiendo la
clonación de múltiples fragmentos de material genético en un orden y una orientación
definida; presenta una manera eficiente de mover una secuencia de ADN dentro de un
sistema de múltiples vectores con el cual poder llevar a cabo diversos tipos de análisis
funcionales y de expresión de proteínas. Para dicha elaboración se siguieron las
indicaciones del proveedor.
125
Capítulo V
5.2.1.3 TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE N. tabacum CON LOS GENES
CpNAC’s
Para llevar a cabo la transformación genética de tabaco se usó la cepa de
Agrobacterium tumefaciens "EHA 105". Para dicha transformación se empleó el
protocolo de Clemente (2006) modificado mediante infiltración al vacio. Para este
experimento se siguieron los lineamientos básicos descritos en dicho protocolo. Las
líneas transgénicas generadas fueron verificadas mediante PCR contra el gen nptII
(Neomicina fosfotransefrasa), el cual es parte del cassette de transformación insertado
en el genoma vegetal.
5.2.2 LOCALIZACIÓN NUCLEAR DE LAS PROTEÍNAS CpNAC-GFP
Las proteínas CpNAC’s fueron fusionadas en la región C-terminal de un vector de
sobreexpresión de la tecnología Gateway, el cual incluye una región codificante para
GFP (exitación 488 nm – emisión 505-530 nm). Plantas transgénicas de las lineas
CpNAC4 y CpNAC5 de 5 días post-germinación, se fijaron en FAA (Formaldehído
10%, Ac. Acético 5% y Etanol 50%) durante 30 minutos en oscuridad a 4°C,
posteriormente las plántulas se sometieron a lavados con etanol al 30%, 50%, 70%,
95% y 100% durante dos hora en cada paso de lavado a 4°C, dando un último lavado
con etanol al 100%. Posteriormente las muestras fueron montadas en un portaobjetos
a las cuales se les añadió VECTASHIELD® Mounting Media DAPI (VECTOR
Laboratories) durante 30 minutos, y posteriormente fueron fijadas con un cubre objeto
y selladas con esmalte comercial. Las muestras fueron visualizadas en un microscopio
confocal marca Olympus Fluoview FV1000. Se utilizaron plantas no transformadas
como grupo control.
5.2.3 ENSAYOS DE ESTRÉS EN LÍNEAS TRANSGÉNICAS DE TABACO
Semillas transgénicas de N. tabacum fueron crecidas en medio de selección (sales
MS, 3% sacarosa, 10 ml L-1 Vitamins B5, 200 mg L-1 Timentina, 150 mg L-1 Kanamicina
y 3g L-1 Gelzan) de acuerdo con el protocol descrito por Clemente (2006). Plántulas
(transformadas y no transformadas) fueron transferidas en botes con mezcla de Peat
moss-Sunshine-Vermiculita-agrolita (1:1:1:2), y posteriormente crecidas bajo un
régimen de fotoperíodo de 16h luz/8 h oscuridad a 25 °C durante seis semanas. Para
los ensayos de germinación en ABA (Ácido abscísico), plántulas de diferentes líneas
126
Capítulo V
fueron germinadas en medio MS (1/10) conteniendo ABA a una concentración de 0.1
µM, y crecidas bajo un régimen de fotoperíodo de 16h luz/8 h oscuridad a 25 °C
durante 24 días. Para los ensayos de elongación de la raíz en condiciones de estrés
salino, plántulas de 20 días post-germinación, se colocaron en medio MS (1/10) con
diferentes concentraciones de NaCl (40 mM, 100 mM y 300 mM) bajo un régimen de
fotoperíodo de 16h luz/8 h oscuridad a 25 °C durante 7 días. Para los ensayos de
temperatura en placas, las semillas de tabaco fueron germinadas en medio MS (1/10)
y posterior a los 15 días de germinación las placas fueron puestas en una cámara de
temperature controlada a 42°C durante 8 horas. Para dicho análisis de utilizaron 20
plantulas para cada una de las líneas transgénicas, así como para el control.
Para el ensayo de temperatura, plantas de 45 días post-germinación (transformadas y
no transformadas) fueron puestas en una cámara de temperatura controlada a 44
±1°C durante 7 días. Las plantas fueron regadas con 200 mL de agua diariamente.
127
Capítulo V
5.3 RESULTADOS
5.3.1 TRANSFORMACIÓN GENÉTICA DE PLANTAS DE TABACO
Como resultado de los experimentos de estandarización de la transformación de
tabaco (Figura 5.1), se obtivueron diversas líneas transformadas con el gen marcador
gusA. Dichos explantes fueron regenerados en medio selectivo con el antibiótico
kanamicina, para evitar el crecimiento inespecífico de tejido no transformado.
Figura 5. 1 Explantes de tabaco transformados en medio semisólido de inducción de brotes,
con los respectivos antibióticos para cada tratamiento.
Después de tres meses de regeneración, diferentes hojas y raíces de las plántulas de
tabaco, se cortaron para la posterior verificación de la transformación. En las figura 5.2
se aprecian hojas, tallos y raíz de tabaco debidamente transformados con el gen
marcador gusA.
128
Capítulo V
Figura 5. 2 Plantas de N. tabacum transformadas con el gen gusA, mediante el protocolo de
Clemente, 2006.
Se obtuvieron diferentes plantas de tabaco transformados con los genes CpNAC4 y
CpNAC5, usando el vector de sobreexpresión PK7FWG2.0, bajo el control del
promotor 35S y teniendo a la GFP como proteína marcadora. En la figura 5.3 se
pueden observar el proceso de crecimiento de las plantas transformadas así como los
fenotipos adquiridos durante la fase de inducción-regeneración de plántulas de tabaco.
129
Capítulo V
A)
B)
Figura 5. 3 Desarrollo de plantas de tabaco transformadas con genes CpNAC4 y CpNAC5 de
C. papaya. A) Regeneración mediante organogénesis directa de plantas transformadas, B)
plantas de tabaco transformadas de 8 semanas en medio de enraizamiento.
Se obtuvieron distintas líneas transgénicas para cada gen. En la Figura 5.4 se pueden
apreciar plantas de tabaco de 5 meses, transformadas con los genes NAC de papaya,
sembradas en una mezcla de sustrato posterior a su aclimatación, con el fin de
obtener las líneas transgénicas de la progenie F1.
Figura 5. 4 Plantas transgénicas de N. tabacum (progenie F0) después de su aclimatación
130
Capítulo V
5.3.2 LOCALIZACIÓN NUCLAR GFP-CpNAC’s
Para examinar la localización de las proteínas NAC, las plantas de tabaco
sobreexpresantes de las proteínas CpNAC4 y CpNAC5, fusionadas a GFP, fueron
preparadas para su posterior visualizacíon (ver Materiales y Métodos) mediante
microscopia confocal. Se determinó que ambas proteínas NAC de papaya se
localizaron en los estomas de las hojas, no habiendo ninguna señal de GFP para el
tejido control (Figura 5.5). Para todos los casos se puede apreciar claramente los
núcleos de las células mediante la tinción de DAPI.
Figura 5. 5 Localización de la proteína CpNAC4 y CpNAC5 en hojas de tabaco. Proteínas de
papaya fusionadas a la proteína GFP bajo el control del promotor 35S.
En raíz, las proteínas CpNAC4 y CpNAC5 se localizaron en los nucleos de las células
(Figura 5.6) señalando una actividad intrínseca en dicho organelo. De igual manera, se
puede observar los núcleos celulares teñidos con el reactivo DAPI.
131
Capítulo V
Figura 5. 6 Localización nuclear de la proteína CpNAC4 y CpNAC5 en raíz de tabaco.
Proteínas de papaya fusionadas a la proteína GFP bajo el control del promotor 35S.
5.3.3 ENSAYOS DE ESTRÉS ABIÓTICO EN LAS LÍNEAS TRANSGÉNICAS
DE TABACO
En la Figura 5. 7 se pueden observar tres líneas de tabaco para el gen CpNAC5 (a, b y
c) sometidas a estrés por temperatura a 42°C durante ocho horas. Las plántulas de
tabaco pertenecientes a la líneas CpNAC5 presentaron un mayor daño con respecto al
control (Wild-type) no transformado, siendo las líneas b y c las que mostraron
evidencia de clorosis y un mayor deterioro de las hojas.
132
Capítulo V
Wild type
CpNAC5c
CpNAC5a
CpNAC5b
Figura 5. 7 Trantamiento de estrés por temperatura (42°C) para plantas de tabaco
sobreexpresantes del gen CpNAC5 de papaya. Tres líneas pertenecientes al gen CpNAC5 (a,
b y c) fueron sometidas junto con un grupo control a un ensayo por calor durante 8 horas.
En la Figura 5. 8 se aprecian las tres líneas de tabaco pertenecientes al gen CpNAC5,
sometidas a estrés por salinidad en diferentes concentraciones de NaCl. En un
recuadro rojo se señalan las diferencias más marcadas para las plantas
sobreexpresantes. Como se puede apreciar, las plantas transformadas de tabaco
mostraron una menor enlongación de la raíz en presencia de 40 mM de NaCl, con
respecto a la planta de taba control no transformada. A los 100 mM de NaCl el
crecimiento de la raíz es menor para todas las plantas, pero sinendo más afectada las
líneas transgénicas CpNAC5. Para 300 mM no se percibe cambio alguno en el
crecimiento radicular ni de la parte aérea de las plantas de tabaco
.
133
Capítulo V
Figura 5. 8 Tratamiento de salinidad para plantas de tabaco sobreexpresantes del gen
CpNAC5 de papaya. En cajas rojas se señalas las diferencias más notorias en la afectación del
crecimiento de la raíz en las líneas transgénicas de tabaco. En recuadro verde (100 mM) se
muestra la diferencia del crecimiento de la parte aérea de la planta control con respecto a las
sobreexpresantes.
En los ensayos de germinación para el gen CpNAC4 (ortólogo a ANAC072), en medio
con 0.1 µM de ABA, seis diferentes líneas de tabaco sobreexpresantes (CpNAC4_1,
CpNAC4_3, CpNAC4_4, CpNAC4_5, CpNAC4_6 y CpNAC4_8) fueron puestas a
germinar durante 6 días en medio MS (1/10) adicionado con ABA (+ ABA), y se les
tomó registro del crecimiento a los 18, 21 y 24 dias post-germinación. En la figura 5.9
se puede observar que la línea CpNAC4_5 no germinó en el medio control sin ABA (–
ABA), (B). Por otro lado, las líneas CpNAC4_1 y CpNAC4_3 presentaron un mayor
crecimiento que las demás líneas y que el control no transformado (al centro de la
placa). CpNAC4_1 sin embargo, mostró una notable diferencia en crecimiento al final
del tratamiento (G y H).
134
Capítulo V
Figura 5. 9 Tratamiento de germinación de plantas de tabaco transformadas con el gen
CpNAC4 de papaya. A) Disposición de las líneas transgénicas y el control (wild-type) en la
placa; B) placa con medio MS sin ABA a los 18 días; C y D) placas con 0.1 µM de ABA a los 18
135
Capítulo V
días; E y F) placas con 0.1 µM de ABA a los 21 días de germinación; G y H) placas con 0.1 µM
de ABA a los 24 días de germinación.
Por otro lado, para los ensayos de temperatuda a 44°C, las plantas de tabaco de la
línea CpNAC4_1 que fueron sometidas a estrés durante siete días, no presentaron
daños visibles mayores en comparación con el grupo control no transformado (Figura
5. 10). La sobreexpresión de este gen, demostró su importante participación en el
sistema de regulación molecular que desencadena respuestas favorables ante estas
condiciones desfavorables para la planta.
Figura 5. 10 Fenotipos resultantes de plantas de tabaco no transformadas y plantas
sobreexpresantes del gen CpNAC4_1 después de siete días de estrés por temperatura a 44°C.
A) Plantas no transformadas de tabaco después de siete días de estrés; B) Plantas de tabaco
que sobreexpresan el gen CpNAC4_1 despues de siete días a 44°C. Las plantas fueron
regadas diariamente con 200 mL de agua.
136
Capítulo V
5.4 DISCUSIÓN
La tecnología de la transformación genética tiene aplicaciones potenciales para
conferir caracteres deseados en plantas de importancia agroeconómica, como lo es C.
papaya. Dentro dichos caracteres deseados, se encuentra la tolerancia a
enfermedades ocasionadas por patógenos, la tolerancia a sequía o estrés hídrico,
bajas temperaturas, entre muchas otras más. La transformación de plantas representa
hoy en día una gran ventaja para el mejoramiento de los cultivos como por ejemplo; en
el área nutricional dichos cultivos pueden incrementar el valor nutricio y la calidad de
las bebidas, por otra parte el uso de estos cultivos híbridos en la agricultura molecular
(Molecular Farming) pueden reducir el tiempo de crecimiento y aumentar productividad
de los cultivos de interés. La identificación de genes candidatos para la aplicación de
dichas herramientos moleculares, es uno de los prerrequisitos de mayor importancia
para el desarrollo de cultivos transgénicos (Mishra y Slater, 2012).
La introducción de genes, mediante la transformación genética, que conlleven a la
tolerancia de múltiples tipos de estrés abiótico, sigue siendo un reto para los grupos
enfocados en el estudio de estos caracteres deseados. Diversos grupos de
investigación, se encuentran hoy en día, llevando a cabo estudios orientados a
identificar nuevos genes involucrados en la tolerancia al estrés biótico y abiótico. El
enfoque más prometedor de la ingeniería genética, para la tolerancia a los estreses
como la sequía y las temperaturas extremas incluye el uso de genes funcionales o
regulatorios, como es el caso de los factores de transcripción (Chaves et al., 2003).
Numerosos estudios han demostrado que la familia de proteínas NAC desempeña un
rol importante en la tolerancia al estrés hiperosmótico. Tran et al, (2004) reportaron
que los genes ANAC019, ANAC55 y ANAC072 de Arabidopsis confieren una mayor
tolerancia a la sequía en esta planta modelo. En este capítulo reportamos la
transformación genética de dos genes de la familia NAC de C. papaya en la planta
modelo N. tabacum. Nuestro gen de papaya CpNAC4 fue elegido de acuerdo a su
actividad transcripcional a la alza en los diferentes expretimentos de estrés propuestos
en el Capítulo IV. CpNAC4 es el gen ortólogo a ANAC072 de Arabidopsis, el cual
confiere tolerancia a las plantas de tabaco expuestas a temperaturas extremas (44 °C)
durante siete días. Este gen de papaya mostró tener un comportamiento similiar a su
ortólogo en Arabidopsis, señalando una conservación funcional dentro este orden
137
Capítulo V
taxonómico, y llevando su función más allá de su grupo taxómico hasta la subcalse de
las Asteridas dentro la cual se encuentra Nicotiana.
Otros estudios en monocotiledóneas señalan que los genes SNAC1 y OsNAC10
aumentan significativamente la tolerancia ante estrés por sequía en plantas de arroz
(Jeong et al., 2010). Nakashima et al., (2007) demostraron que la sobreexpresión de
SNAC2/OSANC6, OsNAC45 y OsNAC063 resulta en el aumento en la tolerancia a
múltiples tipos de estrés abiótico.
Por otro lado, el gen de papaya CpNAC5, el cual es ortólogo al gen ANAC002,
desmostró tener una redundancia funcional con respectoa su ortógolo en Arabidopsis.
El gen ANAC002 actúa como un represor transcripcional ante diversas condiciones de
estrés, siendo sus genes blancos las proteínas COR47, ERD10, KIN1, RD22 y RD29,
involucradas en diferentes procesos que conllevan a la adaptación o tolerancia ante
situaciones ambientales adversas. La sobreexpresión de este gen resulta en fenotipos
sensibles al estrés abiótico (Lu et al., 2007). Nuestro gen CpNAC5 produjo fenotipos
sensibles ante estrés por temperatura, y por otra parte las raíces de las líneas
transgénicas para este gen, mostraron una inibición en el crecimiento y elongación de
estas antes condiciones de estrés salino. Al igual que el gen CpNAC4, el gen CpNAC5
mostró tener una función conservada dentro las diferentes subclases taxonómicas de
las Asteridas y las Eurosidas.
Los estudios realizadon en este capítulo, son una primera aproximación a la
funcionalidad de nuestros genes candidatos, los cuales podrían tener efectos
pleiotrópicos perjudiciales en el desarrollo de la plántula, al estar regulados por un
promotor constitutivo como es el 35S, lo cual podría conllevar a fenotipos no
deseados. Diversos estudios señalan la importancia del uso de promotores inducibles,
los cuales acumulen el producto transgénico solamente bajo la condición deseada. Los
promotores inducibles por estrés son considerados como los ideales para regular la
expresión de genes candidatos para lo tolerancia a estrés abiótico (Ganguly et al.,
2011).
El tema de los transgénicos es ampliamente debatido por expertos y por la misma
sociedad, debido a la falta de información de calidad. En el caso de café, el cual se
encuentra en su estado inicial de comercialización, debe integrarse a los programas de
138
Capítulo V
mejoramientos para su evaluación, lo que tardará de 15-20 años por lo menos para su
liberación en el campo. Sin embargo, el principal obstáculo será la aprobación del
consumidor y la aceptación de un cultivo genéticamente modificado. Con un rápido
aumento en la labranza de diversos cultivos transgénicos alrededor del mundo, la
percepción de los consumidores hacia los transgénicos podría ser más positiva de lo
que es hoy día. Indudablemente, los organismos genéticamente modificados (OGM)
deben someterse a pruebas rigurosas, sobre los efectos sanitarios y ambientales
antes de ser liberados para su comercialización. La expresión del transgen debe ser
monitoreada en todos los estados del desarrollo de la planta. Adicional a esto, la
tecnología genómica como lo es la transgénesis, el mejoramiento asistido por
marcadores moleculares, la genómica, la proteómica y la metabolómica deben
complementar
los
esfuerzos
del
mejoramiento
tradicional
para
acelerar
el
mejoramiento de plantas de importancia agronómica (Mishra y Slater, 2012).
Un punto que no podemos pasar por alto, es la integración de los programas de
mejoramiento y de investigación a la inversión pública y a las compañías privadas. Al
mismo tiempo, los investigadores y los científicos deben hacer un esfuerzo para
educar a la sociedad y ayudar a comprender las grandes ventajas y riesgos asociados
con el uso de OGM.
139
Capítulo V
5.5 REFERENCIAS
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Capítulo V
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141
Capítulo VI
CAPÍTULO VI
6.1 DISCUSIÓN GENERAL
En este trabajo se tuvo como objetivo esclarecer el origen, la diversificación y el papel
que desempeñan una de las familias de factores de transcripción con mayor número
de miembros y con mayor diversificación funcional. Las proteínas NAC han jugado un
papel enmascarado en las funciones vitales de las plantas debido a la escasa
información que se tenía sobre ellas desde la última década. Sin embargo, en los
últimos años, diversos grupos de investigación en todo el mundo se han enfocado en
esclarecer las relaciones y mecanismos funcionales de estás protínas en la regulación
del metabolismo y desarrollo vegetal. En este trabajo se determinó el número de
genes pertenecientes a esta familia de FT NAC en 24 plantas, dentro de estas se
encontraban 22 Angiospermas, una licofita y un musgo, no encontrando evidencia en
algas y microorganismos. Si bien esta familia de Factores de transcripción es
específica para plantas, encontramos una gran expansión de estás secuencias
durante su historia evolutiva, poco antes de la rápida radiación de las Angiospermas.
Estas proteínas, muy probablemente desempeñaron un rol fundamental en la
adaptación y supervivencia del linaje de las plantas con flores, las cuales se
expandieron mediante los diversos mecanismos de duplicación permitiendo lidiar de
esta forma con los diversos factores ambientales adversos y lograr su establecimiento
y diversificación
Los análisis de genómica comparativa, junto con el análisis funcional de genes de la
familia NAC, han arrojado luz sobre como las duplicaciones de los genes y de los
genomas, han contribuido a la rápida diversificación de esta familia en Angiospermas
mediante innovaciones funcionales, como es el caso de rutas claves ligadas al origen
de esta familia. Este patrón se hace evidente al observar el incremento gradual en el
número de genes, desde la especie ancestral P. patens hasta árboles más complejos
como el Álamo. El conocimiento de cómo las proteínas regulatorias adquieren nuevas
funciones moleculares, es esencial para el entendimiento de cómo los organismos se
adaptan a nuevos nichos ecológicos. La familia NAC representa un marco de
referencia útil para dar respuesta a estas interrogantes. Este trabajo es un punto de
partida para la caracterización de la función de múltiples secuencias NAC que han sido
descuidadas y el cual nos ha proveído de un mejor entendimiento del origen y
evolución de esta familia.
143
Capítulo VI
En este trabajo, de acuerdo con las filogenias elaboradas, se determinaron seis
principales familias de secuencias NAC con características definidas ante diversos
patrones de desarrollo vegetal. Dentro de estos grupos, la familia V alberga a la
subfamilia “Stress-related family”, la cual contiene múltiples secuencias involucradas
en procesos en respuesta a estrés abiótico para diversas especies.
Para nuestro modelo de estudio, C. papaya, se identificaron 77 secuencias con el
dominio conservado NAC, las cuales fueron nombradas bajo el prefijo CpNAC. Dentro
de estas secuencias, dos de ellas presentaban una alta similitud con respecto a
proteínas de otras especies involucradas en procesos de tolernacia a múltiples
estreses abióticos, las cuales se agruparon dentro de la subfamilia “Stress-related
family” del grupo V.
Como pudimos constatar para el caso de nuestros dos genes seleccionados de
papaya (CpNAC4 y CpNAC5), pertenecientes a la subfamilia “Stress-related family”,
estos genes presentaron una respuesta transcripcional a la alza ante múltiples
tratamientos de estrés abiótico. Dichas secuencias de papaya al ser ortólogas de
genes de Arabidopsis involucrados en procesos en respuesta a estrés abiótico, y
sabiendo que, genes ortólogos presentan un menor cambio entre sus secuencias y por
lo tanto una menor distancia evolutiva, pudimos inferir su probable participación en
procesos responsivos al estrés ambiental. Por otra parte, ambas species pertenecen al
orden de las Brassicales, lo cual es una característica de vital importancia al momento
de seleccionar genes canditados para el estudio. Los análisis en plantas de tabaco
sobreexpresantes de los genes de papaya, nos confirmaron que la distancia evolutiva
juega un papel primordial en la función de los genes, ya que para ambos genes
encontramos la respuesta esperada en los fenotipos. CpNAC4 al igual que ANAC072
son genes que actúan confiriendo tolerancia ante diversas situaciones ambientales
estresante, por otro lado, CpNAC5 al igual que ANAC002 actúan como represores
transcripcionales en situaciones de estrés, cuya sobreexpresión lleva a la planta a un
proceso de muerte celular acelerado.
La determinación de las funciones de esta familia de genes es de vital importancia
para lograr una pronta tolerancia en cultivos susceptibles a factores ambientales
adversos. La selección de promotores específicos en respuesta al estrés abiótico se
hace necesaria para maximizar los efectos positivos de los transgenes y minimizar los
negativos La combinación de herramientas tales como la genética reversa, la
144
Capítulo VI
genómica, la proteómica y los avances en la secuenciación de última generación nos
permitirá tener un panomara más completo del complejo sistema de regulación
vegetal, dentro el cuál las proteínas NAC juegan un papel crítico en la adaptación,
diversificación y permanencia de las plantas en distintos hábitats. Dicha información
nos permitirá poder generar un conocimiento más detallado con el cual poder tener
planteamietos más certeros para la elaboración de nuevos proyectos biotecnológicos y
una mayor asertividad en la búsqueda de plantas tolerantes al estrés abiótico en un
medio ambiente cada díá más severo. Para esto es necesario continuar con el uso de
estas herramientas genómicas e insistir en la educación y difusión del conocimiento a
las futuras generaciones.
,
145
Capítulo VI
6.2 CONCLUSIONES GENERALES
1. Se determinaron las expansiones génicas de la familia de FT NAC en 24 plantas,
así como la historia evolutiva de esta familia a través del linaje de las
Angiospermas.
2. Se determinaron las secuencias ortólogas de la familia NAC en 22 especies de
Angiospermas y en el musgo P. patens, así como las posibles secuencias
parálogas para cada espeice.
3. Se presentó por primera vez las secuencias de la familia NAC de C. papaya, así
como los posibles genes incolucrados en procesos en respuesta a estrés
abiótico.
4. En este estudio se analizó el patrón transcripcional de cinco genes NAC de C.
papaya, en respuesta a cuatro diferentes tipos de estrés abiótico (sequía,
salinidad y temperaturas extremas), y se determinó que todos ellos presentan
un aumento en su expresión durante el estrés.
5. En este estudio se determinó la participación del gen CpNAC4 de papaya, en el
mecanismo de tolerancia al estrés por temperatura extrema (44°C), mediante
su sobreexpresión en N. tabaccum.
6. Se determinó la acción del gen CpNAC5 de papaya, como un represor
transcripcional de posibles vías de señalización en la tolerancia al estrés,
mediante su sobreexpresión en plantas de N. tabaccum expuestas a
conciciones de estrés por temperatura extrema.
146
Capítulo VI
6.3 PERSPECTIVAS
Este trabajo abre la posibilidad para plantear nuevas preguntas con respecto al
mecanismo de acción de las proetinas NAC de papaya, y su participación en la
regulación de los procesos de tolerancia al estrés. Como perspectivas de este trabajo,
tenemos las siguientes apremiantes:
1. Caracterizar los promotores de los genes reportados en este esudio, con una
actividad transcripcional a la alza ante múltiples eventos de estrés abiótico.
2. Elaborar construccioens de vectores de transformación para plantas, guiados
por promotores específicos para cada situación estresante, como es el caso de
los promotores de las proteínas NAC de papaya.
3. Generación de plantas inter y cisgénicas de papaya cv. Maradol, que
sobreexpresen los genes NAC previamente caracterizados en este estudio.
4. Caracterizar esta familia de FTs en otros modelos vegetales de importancia
económica, como lo es tomate y caña de azúcar.
147
Anexos
ANEXO 1 REGIONES INTRÓNICAS DE LOS CINCO GENES PREDICHOS
EN C. papaya
Gene
Phytozome C.
papaya ID
Intrones
5'GTGAATTTCTTATTCTTTTTTTTTTTAAATGTTCT
Posición
Tamaño de
de intrón
intrón (pb)
4828-4946
119
960-4552
593
5104-5200
97
5469-5554
86
3589-3705
117
3182-3316
165
3112-3140
29
CGTGGTATTTTCGAAACATGTATGTTATGATGAT
TAGTGAAATGAATTCATTATTTGTCGTTATTTTGA
ATGGTGAAACTACAG-3'
5'GTACGGTTTCAGTTTTCTTCTTCCTCTTTCAGA
TTATTAGTTTTAATTGTACAGTCACCTTTCTCTGC
ATGATGAGCTTTGCTCCACGATGTGGAATTTGAA
ATGACAATTTTGCCCCTTCACGCTGTTAAAGCCT
GTAGGGGTCCACAACTGTCAATTTTCTTTTCGGC
CpNAC5
evm.model.supercontig_
64.115
GGCCGCAGAAGACAGCTAAGGATTTGACGGTAT
ACCGAGGGAATTAGCCAATGGTATAACGTCGTC
GGTAGATCCGTTTACCAACGGTGAACTGTATAG
GGTCAGTAGATTTATAGTCGGTGGGGTTCTAGT
GGTCCCCGCCATGGTTAATTGCGTGTGGTCCCC
ATTTGGTACCAGTTATACGGCTAATAAATAATCC
ACGTCATTGGAAAAAGGACGTCACCGTTTATATG
TCTGAAGCAGTCGCCCGTCACATTAGCAAAACC
CATCAATCAAATATTATTAATCTCCAGTTTAGGAA
AATATTCCTTCTTATCTCCTCCGACGTGGGTGGC
ACAAGGAGATAGCGATGAAATCAGATTTTCAAAT
ATGTCAACATAATGCATTTTATTAGTGACTAAACC
AACGGTGTTGATTTTGCAG-3'
5'GTAAGGAACCCTCAACCATTGCCAATTTTGAAT
TTCTTCCGATTTTATCTTCTCTGGGTTTGGTTTG
CpNAC4
evm.model.supercontig_
80.93
GTAAATAGAATTCGTTTGATATTTTGACAG-3'
5'GTACGAATTTACGGAAACTCATGAATTATTTAT
CACGTTTTTTGATGTTGAGCGCGAGTGGTGAGT
TGACGCGGTGTCTTTTGCAG-3'
5'GTTTGTAACCAAACATTCCTCTCCTCATTCATTT
TATTTCGTTTTTACTAAAATATTAACTGACTGTAC
ATAAATATATATATATATATATGTGTGTGTGTGTG
TATACATATACAG-3'
CpNAC1
evm.model.supercontig_
5'GTGCGTTTCTCTTTTTTTCTCTTTTTTCGTAGTT
1.48
AGATCGTCAAACATTATGTTATTTGAATCAAATAC
GTATAATTTTTTCACATTCCATTTTTACTTACTGG
TTGCATATGCTTTTGTTTTTGTGAGTTTCAG-3'
5'GTCAAAAGTTTTGGAATCTCATAAATTAG-3'
148
Anexos
5'GTTCGGAATTTCATTTCCTTTCTCTTCACCTCTT
TTAATTTATCTTCTGCTTCTGCTTCTGTTTCTTTC
8036-9141
1106
9397-9899
503
TTTACTTCTTAAATTTAACTCTTTTTTAAAATTAAT
AGAAAAAGGAAAATCTGAGAGACGAACTTAATAC
CCGCCATAATTAAGTCTGAGTTAAACATTTAATG
GTAAATACTTAAATTTTTGTAAATATCTTTGTTTTT
TTTTGTTAGAAATTAGTTTTTGATCTTTTAAAATT
GTTTCAGAACAGAATCACCGATTAACTGTTACAG
GATGGTAACTTTTCTTCCTCAATCCTGATCCTCT
CTCTTCTCTCCCTGTTTCACTGTTTCGTGAAAAG
GATTTCACTTCATCAAATCTCCTTCTGCTCGACC
ACTTGTTTATCTGAAAACAAACCCACCTATACCC
TATTTCACTATCGGAAAAACAAATACTCGTAGCT
TGTCCTGGAGCTCGGTCGCGTTCGGGTTGCCAT
TGTCCGAATCCCCGTTGCTCTGTTTCTATGTTGC
CCGAGGGAGAAGATGGGAACAGGGCAGGATCG
GGGAGCAGTGAACAGAGCAATGACGCGACAGG
GTTAGGTCCATGAGAGGAGGAGGGCAGAAGAG
GATTCTGAACCCTCGATTTAAACAGTGAATTTTT
ATATATTAAACTACTAAAAAGTTAAGATTAATAGA
ACATAATCATTAAATGTATCATTCTCCTGCCAGA
GCACGAACATATCTGAAAACCATTTTAAAATTTTA
GTTTCACTCTCATCAGAAGTATTTTTGTTTCTGGT
CpNAC39
evm.model.supercontig_
GATCTATTAGATTTCTGCTGTCTGATAATAATAGT
195.35
AATAGTAAAAAAAAAAGAAAAAAGAAATCGAATT
ATCCTAAAAAATTAAGTTGATAAAAAATAGTATAG
ATAAACCCACTAAATCTTGTGCAAAGTTGATTTTT
GAATGAAACAAAGTTGTGAGGAAAACCATAGATC
CCAGCCTTCTTGATGGCTAACTTCATAATTTTAC
TTTAAGAATTTTAAATATGCAGAACACATGATTAT
ATGCATTTTGATTGTCTTAGTAAAGTTGCTGTATA
TCTGGGTACGGCAACTGATGTGCT
CATTTATTTAATCATGATCAG-3'
5'TGACATTTCTTCCTTGTCTTTCTGATTCTTTTTT
CATTTCTGATAAGCTTTCGTTTGAATTGTTGCTC
GTATGTCATCTTTAACGAGATTAAAGTTGGTTTA
AGACGTCGGGTTGGAAGGTTTGCCGTGTAAGTT
TTCACTTTGGCTGCTGTATTTCAGTTCCTTAGAG
CTGCCTTATGCATGCCTTTGTACTTTGATGTGTA
AAAGAGTCATTACTTGTTAGGACAATTTTGTACTT
GGAAGGGCCTTTTTGGACCAGAATGATCCGTCT
TCAATCGCTCTATACAAGACAGCCGAGAGGCAA
TCAAAACGATGATGATTATGCTGAGAAGATCAGT
TACACTGCTATTTCTTATATGTGGTAGAGAGTTTT
TACTAGAAGAAATTCTCTGATTTATGAGATGTGT
GAATTGTTAAGGAATACGACATGGGATTAACTCG
AAAGCTTTGGCCTGAACTGATCACTAGTATTAAT
149
Anexos
TTGCCATTCTTTATTGCAAACTTGAAGG-3'
5'TATGTTTGAGTATTTGTTGGTTTAAATTTCATGA
1019-1027
80
5246-5331
86
5609-5710
102
ATACACAATAACTAACCGTTGTATCTAAACTAAA
CCCAATTCCAGG-3'
5'TAAGTTTTGTCTGAATTCAAATCTCTTTTACACC
CAGAACAAATATATATGTAAGTAACAATTTTTTGG
CpNAC12
evm.model.supercontig_
14.101
GTTTTGTTGAATGAAGG-3'
5'GTAAAATTTATTTCTATCTCTTTCTTTGTTTCCA
AACACCTTTTTAGTTTTGAATATTATTTTGAGATT
TCTTTGCTTCTTTTTCTTGTTTTGTTTTTGCAG-3'
150

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