Download Hidrólisis con cascara de Carica papaya de proteínas de soja

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL NORDESTE
Comunicaciones Científicas y Tecnológicas 2000
Hidrólisis con cascara de Carica papaya
de proteínas de soja desengrasada
Glibota, Gustavo S. - Garro, Oscar A. - Judis, María A.
Facultad de Agroindustrias - UNNE.
Cte. Fernández 755 - (3700) Pcia. R. S. Peña - Chaco - Argentina.
Tel./Fax: +54 (03732) 420137 - E-mail: gglibota@fai.unne.edu.ar
ANTECEDENTES
Una alternativa de aprovechamiento de los restos del fruto de mamón (Carica papaya) es la obtención de
enzimas proteolíticas para la generación de hidrolizados (proteínas modificadas) tanto para la alimentación
animal como humana.
El objetivo de esta experiencia fue utilizar las enzimas presentes en la cáscara del fruto de esta especie,
directamente sumergiendo estos restos en la solución acuosa de proteínas a modificar.
Se midió la actividad de los restos a través de la producción de alfa aminoácidos libres por colorimetría a 570
nm. Por reacción de la ninhidrina.
La intensidad de la coloración determina el grado de hidrólisis sufrida por la proteína.
Se comprobó la proporcionalidad de la concentración de enzima con la concentración de sustancia difundida
en el buffer luego de introducir la cáscara en el mismo.
Se siguió la cinética de la reacción en el momento de disolver la enzima y pasada 24 hs.
MATERIALES Y METODOS
Obtención de la enzima:
La cascara se obtuvo de frutos de Carica papaya con diámetro medio comprendido entre 6 y 10 cm. Recogidas
en plantas, que son cultivadas en jardines y quintas de Pcia. R. Sáenz Peña.
El tamaño de frutos que se utilizaron para extraer la enzima fue el de máximo crecimiento antes de su estado
de maduración (verdes).
En la extracción de la enzima desde la cascara se realizó un pelado, obteniendo un pellet de 1 a 2 mm. de
espesor. Se trituró para favorecer la extracción con buffer.
La extracción se realizó con buffer fosfato ( Na2HPO4-Ac cítrico) 0.05 N Ph. 7.0. La muestra se filtró y se
centrifugó a 3000 g. Todo este proceso se realizó a 25 grados.
La proteína disuelta (papaína) se midió por espectrofotometría a 280 nm.
La cantidad de sustancia seca obtenida se determino por peso seco constante en estufa a 100 °C. Se realizó
una curva de calibración para comprobar la relación.
Sustrato:
La proteína de soja desgrasada (harina) que se utilizó fue la de grado comercial (Esta se obtiene luego del
proceso de extracción de aceite en la industria).
La solución de proteína (soja) fue al 0.2% en buffer fosfato, Ph 7.0.
Se disolvió y filtro con papel de filtro Watman Nro. 10.
Hidrólisis:
La temperatura de la reacción de hidrólisis se mantuvo a 40 ° C con agitación continua.
Para la evaluación de la hidrólisis se utilizo la técnica de la Ninhidrina (Método colorimétrico). Hwang, 1975.
La ninhidrina reacciona con los grupos alfa aminoácidos libres de los aminoácidos, péptidos y proteínas. La
reacción da una coloración azul violeta dependiendo de la cantidad de grupos liberados en la hidrólisis previa.
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Método: en tubos de ensayos se introdujo 5ml de la mezcla de en solución de proteínas y enzima
reaccionando. Para parar la reacción se agregó 1ml de ninhidrina al 0.35 % en solución alcohólica y se lo
calentó entre 80 y 100 ° C.
Preservación de la actividad proteolítica:
Se probó la disminución de la actividad enzimática conservando la enzima a 8°C en heladera durante 24
horas.
DISCUSION DE RESULTADOS
De acuerdo al análisis de los frutos con distintos diámetros (6 - 10 cm) se comprobó que los restos (frutos sin
el mesocarpio) de Carica papaya constituyen entre el 18 a 28% del total, siendo el porcentaje mayor para los
de menor diámetro.
La relación porcentual entre cáscara seca fue de 13% del producto fresco.
Se calculó la equivalencia de unidades de actividad: 0.01 unidad absorvancia/min. es igual a 34000 unidades
BAEE.
La cantidad de sustancia seca extraída con buffer de los restos de frutos (cascara y semillas) fue cercana al 2%
de la cantidad de restos para la extracción ( 10 mg de sustancia seca / gr. de restos frescos). La cantidad de
proteína (con actividad enzimática) medida a 280nm. fue de 5mg de proteína/ gr. de restos.
relacion absorbvancia - concentración
0,6
0,5
Abs
0,4
0,3
0,2
0,1
y = 0,0701x
2
R = 0,9725
0
0
2
4
6
8
ml de enzima agregado
En el gráfico se observa la relación entre la absorvancia (color obtenido en la reacción de los grupos alfa
aminoácidos con la ninhidrina) y la concentración agregada de enzima fue 10ml en 250ml de solución de
proteínas disuelta (la concentración específica de enzima estaba dada por la introducción de 0.18 gr de
cascara fresca/ ml de solución buffer).
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0,3
0,25
abs
0,2
0,15
2
R = 0,9814
0,1
0,05
2
R = 0,8668
0
0
10
20
30
40
tiempo (min)
50
60
70
En el gráfico se observa la evolución de la hidrólisis en el tiempo para una concentración de enzima/ proteína
de mg/ml .
La curva superior se realizó inmediatamente después de disolver y difundir la enzima desde la cascara a la
solución buffer.
La segunda curva se realizó pasadas 24 horas almacenada a 8°C en el buffer.
Se ve la perdida de actividad de la enzima durante el almacenaje en estas condiciones.
CONCLUSIONES
Los restos de fruto (cascara) de papaya se pueden utilizar para la producción de hidrolizados, directamente en
solución acuosa con la proteína a hidrolizar, las enzimas presentes en la cascara se disuelven en el medio y
actúan sobre los enlaces peptídicos.
La conservabilidad de la actividad enzimática disminuye al estar presente con los resto de los compuestos
presentes en la cascara, por lo que su utilización tendría que ser in situ para su mejor aprovechamiento.
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