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Artículo
Revista de Ciencias Naturales y Agropecuarias
Septiembre 2015 Vol.2 No.4 561-567
Clonación y caracterización del gen codificador del transportador de xylose de
Debranomyces hansenii en E.coli.
DE LA RIVA-DE LA RIVA, Gustavo Alberto*†, COLLI-MULL Juan Gualberto y JUAREZSALDAÑA, Eric
Instituto Tecnológico Superior de Irapuato (ITESI). Carretera Irapuato-Silao km 12.5. El Copal, Irapuato, Guanajuato
México. C.P. 36821.Recibido 3 de Julio, 2015; Aceptado 25 de Septiembre, 2015
Resumen
Abstract
El xilitol es un alcohol de 5 C, es un edulcorante no
calórico, es obtenido por la reducción química del azúcar
D-xilosa por hidrogenación. Una alternativa de la
producción química es la utilización de levaduras
altamente productoras de polioles del genero
Debaryomyces y Cándida, aplicando ingeniera genética.
En nuestro proyecto hemos amplificado por PCR y
clonado en E. coli el gen codificador del transportador de
xilosa, para posteriormente transferirlos expresarlos en
cepas de Saccharomyces cerevisiae para estudiar la
capacidad de utilizar xilosa como fuente de carbono y su
posible rol en la producción de de xilitol.
Xilitol is a 5 C alcohols, and noncariogenic noncaloric
sweetener usually obtained by a chemically reaction of
D-xylose hydrogenation. An alternative to this reduction
reaction is the use of highly polyol producing yeast from
genus Debaryomyces and Cándida. In our project we
have amplified by PCR and cloned the gen encoding for
a transmembranal transpoter of xylose. The cloned gene
was sequenced and characterized for further transfer to
Saccharomyces cerevisiae to study the capacity of
transformed yeast to use xylose as a carbon source and its
possible role in xylitol production
D. hansenii, xylose, conveyor
D. hansenii, xilosa, transportador
Citación: DE LA RIVA-DE LA RIVA, Gustavo Alberto, COLLI-MULL Juan Gualberto y JUAREZ-SALDAÑA, Eric.
Clonación y caracterización del gen codificador del transportador de xylose de Debranomyces hansenii en E.coli .
Revista de Ciencias Naturales y Agropecuarias 2015, 2-4: 561-567
* Correspondencia al Autor (Correo Electrónico: gudelariva@itesi.edu.mx)
† Investigador contribuyendo como primer autor.
© ECORFAN-Bolivia
www.ecorfan.org/bolivia
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Artículo
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Introducción
Los procesos fermentativos siempre han sido un
campo de permanente interés en la
investigación biotecnológica y en el desarrollo
de la biotecnología industrial. La producción de
etanol y xilitol mediante procesos fermentativos
es una de las esferas donde se busca
constantemente
mejorar
los
procesos
fermentativos con fines de aplicación tanto en
la industria alimentaria cómo en la producción
de biocombustibles. Actualmente, existen
procesos fermentativos que se utilizan para
convertir los residuos de los productos
primarios
forestales
en
subproductos
industriales como etanol y xilitol. En un
esfuerzo por mejorar este tipo de proceso
buscamos crear cepas de Saccharomyces
cerevisiae genéticamente modificadas capaces
de utilizar xilosa como fuente de carbono. Estas
tentativas no han resultado en procesos más
eficientes porque S. cerevisiae es una levadura
muy eficiente en los procesos de fermentación
de hexosas, pero incapaz cuando se trata de
utilizar pentosas como fuente de carbono. Por
esta razón tratamos de mejorar esta situación
transfiriendo a cepas de S. cereviciae el gen
codificador del transportador de la xilosa de
Debaryomyces hansenii. Esa es una levadura
halotrófica que eficientemente utiliza las
pentosas y en particular la xilosa como fuente
de carbono.
El xilitol es un producto secundario
principal en la producción del etanol de
subproductos lignocelulósicos de amplia
utilización en las industrias alimentarias y
farmacéuticas, ya que tiene características
útiles, incluyendo su uso para la prevención de
la caries dental, como un sustituto del azúcar
para los diabéticos independientes de la
insulina, y como edulcorante de alimento
natural (Makinen, 1992).
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El xilitol es producido actualmente a
escala industrial por una reducción catalítica
(hidrogenación) de la xilosa, obtenida a partir
de fuentes de madera tales como abedules
blancos. Cándida intermedia ha sido reportada
(Leandro et al; 2006) como una levadura con la
capacidad de crecer en medios ricos en xilosa y
transportar esta pentosa por dos sistemas de
transporte diferentes uno de alta afinidad; en el
cual, se realiza con un simporte de H+, también
se tiene un sistema de baja afinidad que se da
por difusión facilitada; ambos sistemas utilizan
glucosa como sustrato. D. hansenii ha sido
descrita como una levadura halofílicahalotolerante (González-Hernández, J. C. y col.,
2004, 2005), ésta puede metabolizar D-xilosa
en xilitol (Gírio y col., 2000). Está
característica es un aspecto interesante y
potencial en el aspecto biotecnológico debido a
las características dietéticas y clínicas del
xilitol. En el mismo tiempo, un acercamiento
molecular será seguido para identificar los
genes implicados en este proceso (GXF1,
GXS1, XR). Nuestro objetivo es tener
conocimiento básico de los sistemas de
transporte y metabolismo de xilosa en D.
hansenii; y en un futuro inmediato establecer y
proponer esta tecnología para la producción de
xilitol. La enzima xilosa reductasa (XR) es
responsable del primer paso en el metabolismo
de la xilosa en levaduras (Chiang and Knight,
1960). En una reacción catalizada por esta
enzima, la xilosa es reducida a xilitol que puede
ser oxidado a xilulosa por la enzima xilitol
deshidrogenasa (XDH) ó puede ser liberado al
ambiente, dependiendo de las condiciones del
medio de cultivo (Kern y col., 1997; Ho y col.,
1998). Estudios sobre la extracción y
purificación de XR de levaduras, han sido
conducidos con el objetivo de caracterizar la
enzima para implementar mejores procesos
fermentativos u obtener una solución purificada
de XR para ser utilizada directamente para la
conversión de xilosa a xilitol (Mayerhoff y col.,
2001; Cortez y col., 2001).
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codificador del transportador de xylose de Debranomyces hansenii en E.coli.
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Cándida magnoliae es una levadura
capaz de crecer y utilizar la xilosa como fuente
de carbono y, por otra parte acumular el xilitol,
evitando que se transforme en D-xilulosa. D.
hansenii, es una levadura altamente productora
de polioles que puede tener un uso potencial
para el aprovechamiento de hidrolizados
lignocelulósicos, lo cual ha sido ampliamente
estudiado para que se lleve a cabo esta
bioconversión.
Hemos diseñado una estrategia para el
estudio y la caracterización del gen del
transportador de la xilosa de D. hansenii. Se
realizó la amplificación por PCR del gen
completo y por separado de los fragmentos
correspondientes al promotor y a la región
codficadora. Los fragmentos amplificados se
clonaron en un vector de E. coli y secuenciados.
También incluimos una estrategia de
manipulación de estos fragmentos para su
trasferencia a una cepa de de Saccharomyces
cerevisiae sobreproductoras de etanol aisladas
de procesos industriales para evaluar su
comportamiento
y la eficiencia de la
fermentación en las mismas tanto en la
producción de etanol cómo en la de xilitol.
Materiales y Métodos
Cepas y medios de cultivo
Se utilizaron 4 diferentes cepas de levaduras, 2
de ellas de D. hansenii y C. magnoliae, las
cuales crecen eficientemente utilizando xilosa
como fuente de carbono y dos de
Saccharomyces cerevisiae, una de ellas,
Saccharomyces cerevisiae W303-1 Ura-, es una
mutante
auxotrófica
para
probar
las
construcciones a ensayar y la otra es la cepa
Saccharomyces cerevisiae ITM 2014, y se
carateriza por su elevada eficiencia en la
producción fermentativa de etanol (Tabla 1).
Las capas se crecieron en varios medios de
cultiivo siendo YPD el más adecuado.
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En él se incluye extracto de levadura,
normalmente
un
1%
en
proporción
masa/volumen con el agua, 2% de peptona, 2%
de glucosa. Cuando se requirió la glucosa fue
sustituida por 2% xilosa y se le llamó YPX. La
cepa E.coli DH5 alfa fue utilizada para realizar
las clonaciones. Y crecidas en medi LB.
Cuando se requirió el medio fue suplementado
con 75 mg/l de ampicilina, y/o 40 µg/l de 5bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranoside
(X-Gal) y 40
µg/l de isopropil-β-Dthiogalacpiranoside (IPTG).
Cinética de las levaduras en medios YPD y
YPX.
Se realizó una cinética de crecimiento de dis de
las levaduras de interés para realizar este
proyecto con el fin de determinar su
comportamiento tanto en usando en glucosa
cómo usando xilosa en el medio de cultivo.
Dichas levaduras se crecieron en lotes de 50
mL de medios YPD (Extracto de Levadura,
Peptona y Glucosa 2%) ó YPX (Extracto de
Levadura, peptona y xilosa 2%) a 110 rpm y
temperatura de 28°C. Se tomaron muestras
durante 24 horas cada 2 horas y se midieron los
parámetros de densidad óptica a 595 por
espectrofotometróa a luz visible. Tambien se
midieron el pH, se determinó el número de
células por mL de cultivo (sembrando
diluciones cada 4 horas).
Diseño y síntesis de primers para la
amplificación por PCR
A partir del análisis comparativo de la
información de las secuencias nucleotídicas de
C. intermedia y D. hansenii tomada de las bases
de datos del GenBank del NCBI y del EMBL
(www.ncbi.nlm.nih.gov; www.embl.de) se
diseñan diferentes pares de primers u
oligonucleótidos para facilitar las tareas de
clonación de las regiones reguladoras y
codificantes de los genes a partir del ADN total.
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Las características de los primers se
resumen y su finalidad se resumen en la Tabla
Extracción de ADN total de Debaryomyces
hansenii
Establecimos las condiciones óptimas de
crecimiento de D. hansenii mediante la
utilización de dos métodos: uno basado en un
kit comercial de extracción (Yeastar Genomic
DNA kitTM, Zymo Research) y otro basado en
la ruptura con perlas de vidrio y solución de
detergentes (Solución Winston: 2% Tritón, 1%
SDS, 100 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl pH 8,
1mM EDTA).
Amplificación por PCR de los fragmentos de
ADN correspondientes al gen completo del
transportador de la xilosa, su región
promotora y la región codificante.
Se optimizaron las condiciones para la
amplificación por separado de la región
promotora (1’-95°C, 1’-53°C, 1’-72°C), la
codificadora y su terminador (1’-95°C, 1’53°C, 2’-72°C) y el gen completo (1’-95°C, 1’53°C, 3’-72°C). La reacciones se llevaron a
cabo a mediante la metodología estándar de la
Reacción en Cadena de la Polimerasa usando
DreamTaq™
(ThermoscietificTM).
Los
fragmentos amplificados fueron analizados por
electroforesis en buffer TA y purificados por un
kit comercial (ZymocleanTM Gel, Biosys
TM).
Clonación en E.coli y secuenciación.
Los fragmentos purificados se ligaron a un
vector TOPO comercial (TOPOTM PCR
Cloning, Life Science) y la ligación fue
transformada en células competentes E. coli
DH5 alfa y seleccionadas en medio LB,
suplementado con 100 mg/l de ampicilina, 40
µg/l
de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-Dgalactopiranoside (X-Gal) y 40
µg/l de
isopropil-β-D-thiogalacpiranoside (IPTG).
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E incubadas a 37°C durante 18 horas.
Las colonias blancas relevan cuales clonas
presentan el inserto.Los posibles clones fueron
analizados por restricción con las enzimas
Xho1, Spe1 y Sac1 y por PCR analítico
utilizando los primers correspondientes a cada
tipo de fragmento amplificado (Tabla 1). Las
clonas en E. coli seleccionadas fueron
purificadas y enviadas a secuenciar (T4
OligoTM).
Resultados y Discusión
Obtimización de las condiciones de cultivo.
Cinética de las levaduras en medios YPD y
YPX.
Se establecieron las condiciones óptimas de
crecimiento de Debaryomyces hansenii y
Candida magnoliae y de las dos cepas de
Saccharomyces
cerevisiae. Se probaron
diferentes medios ricos entre ellos medio YNB
(Yeast Nitrogen Base) y medio YPD (Extracto
de Levadura, Peptona y Glucosa ó Xilosa). El
medio más adecuado resultó ser el pero en el
caso de cepa Saccharomyces cereviciae W3031 Ura-, el crecimiento, aún en YPD siempre
fue más lento en comparación con las otras
cepas.
Cinética de las levaduras D. hansenii y S.
cereviciae en medios YPD y YPX.
Se verificó que Debaryomyces hansenii y
Candida magnoliae crecen satisfactoriamnte
tanto en presenia de glucosa (medio YPD)
cpomo en presencia de xilosa (YPX) mientras
que S.cereviciae screce eficientemente solo en
presencia de glucosa como fuente de carbono.
Con este experimento verificamos que nuestra
cepas de Debaryomyces hansenii y Candida
magnoliae poseen realmente la capacidad de
internalizar la xilosa.
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Primeramente se optimizaron las
condiciones de crecimiento para cada una de las
cuatro cepas de levadura que utilizaremos en
todo este proyecto. Los resultados muestran que
las cepas (Figura 1).
La cinética de crecimiento (Fig. 1)
permitió determinar el comportamiento tanto de
las cepas que serán fuentes del gen de interés
como de aquellas que serán hospederas del gen
heterólogo determinándose que las primeras
poseen la capacidad de internalizar xilosa y
metabolizarlas y las segundas no puedes aunque
cierto nivel basal de interalización de la xilosa
se observa. Esto se debe a que el mmedio YPX
posee cierta candidad de hexosas que permiten
un crecimiento basal. A partir de este resultado
hemos elaborado un medio mínimo, similar al
M9, compuesto por sales y donde podremos
manipular completamente la fuente de carbono
para cada tipo de levadura que transformemos.
De esa manera las transformantes que crezcan
en medio con xilosa solamente serían las ue
hallan recibido y expresado correctamente el
gen gfx y que este codifica para una proteína
completamente funcional en el hospedero.
Estudio comparativo de las secuencias de
proteínas transportadoras de xilosa.
Realizamos un análisis comparativo de las
secuencias conocidas de los transportadores de
xilosa (GenBank www.ncbi.nlm.nhi.gov) de
Cándida intermedia con las secuencias
correspondientes a los dos genomas completos
reportados de D. hansenii. El análisis permitión
determinar la región y secuencia nucleitídica
predicha de ests genes homólogos. Utilizaos
los genes de C. intermedia PYCC 4715
denominados gxf1 (glucosa/xilosa facilitador) y
gxs1 (glucsa/xiloa symporter, número de acceso
AJ875406) asi como las secuencias del genoma
de D. hansenii reportados (D. hansenii MTCC
234 y D. hansenii CBS767). A partir de este
análisis diseamos los primers que se usaron en
la amplificación por PCR (Tabla 2)
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Amplificación del gen gfx de D. hansenii por
PCR y clonación en vector de E.coli.
Primeramente estandarizamos condiciones para
la extracción de DNA total de la levadura.
Como esta es una levadura novencional
utilizamos el método de extracción de ADN
total con perlas de vidrio y solución Winston
pero introduciendo el uso de ximolasa y las
columnas del kit comercial.
Con los primers diseñados se llevó
acabo la amplificación por PCR para amplificar
los fragmentos correspondientes a Región
Promotora, región codificadora, él terminador
y gen completo (Figura 2), los cuales fueron
posteriormente ligados a un vector TOPO
comercial (TOPOTM PCR Cloning, Life
Science)
y
transformado
mediante
electroporación en células electrocompetentes
E. coli DH5 alfa. Estas fueron sembradas sobre
placas de medio LBA xgal/IPTG y fueron
seleccinadas las colonias blancas, las cuales nos
indicaron que esas células contenían el inserto
de DNA.
Los clones seleccionados fueron
analizados por restricción con las enzimas
Spe1, Sac1 y Xho1 y por una PCR analítico lo
que dio certeza a los clones de las series pPTX,
que cotienen al fragmento del promotor,
pRCTX que contienen el fragmento
correspondiente a la región codificante y PGTX
que contienen el gen completo. El resultado fue
corroborado por la secuenciación de los
fragmentos
clonados
y
su
posterior
comparación con las secuencias conocidas de
los genes homólogos.
La manipulación posterior de este gen se
dirige a clonarlo en el vector plasmídico de
pYES e introducirlo en S. cerevisiae W303-1A
Ura-la que permite la selección por auxotrofia y
evaluar en ete sistema la expresión del gen y el
funcionamiento de la proteína recombinante en
medio usanso xilosa como fuente de carbono.
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Posteriormente se usará un vector
integrativo para transformar la cepa S.
cerevisiae ITM 2014 que ser´capaz de usar
tanto hexosas como xilosa como fuente de
carbono, esto unido a que es una cepa muy
eficiente en la producción de etanol ofrece una
posibilidad de optimizar procesos industriales
de fermentación alcohólica en las industrias
mezcaleras, vinícola usado diversos sustratos
frutícolas, la producción de biocombustibles y
la producción de xilitol.
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D.hansenii y C. magnoliae pueden usar
indistintamente hexosas (glucosa) ó pentosas
(xilosas) como fuente de carbono mientras que
S. cerevisiae solamente crece eficiente mente en
sustratos que tengan hexosas Si S. cerevisiae
adquiere la capacidad de internalizar de manera
más eficiente la xilosa esto puede resultar en
una otimización de diversos procesos
fermentativos industriales, incluyendo un mejor
aprovechamiento
de
los
hidrolizador
lignocelulósicos, producción de vinos y mezcal,
y la posibilidad de diseñar un proceso
alternatiivo en la producción del xilitol.
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Agradecimientos.
Este proyecto está siendo financiado mediante
fondos del Consejo Nacional de Ciencia y
Tecnología de México 2012-2015 y por
aportecs internos del Instituto Tecnológico
Superior de Irapuato (ITESI).
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