Download ingeniería genética: grado biotecnología.

INGENIERÍA GENÉTICA:
GRADO BIOTECNOLOGÍA
Teoría.
(También se dispone de los
contenidos para los grados de
Biología, Biomedicina y Bioquímica).
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ÍNDICE DE TEORÍA.
1. Introducción. Conceptos fundamentales, herramientas de la ingeniería
genética y repaso.
2. Purificación de ácidos nucléicos. Obtención y cuantificación.
3. Manipulación de ácidos nucleicos. Enzimas que cortan, modifican y
polimerizan los ácidos nucleicos. Ejemplo sencillo de clonaje.
4. Estudio del DNA. Marcaje de ácidos nucleicos, Southern Blot,
secuenciación, FISH.
5. PCR. Concepto, proceso, usos.
6. Vectores. Características generales, uso de los vectores con ejemplos,
vectores fágicos y Eucariotas.
7. Cribaje de genotecas: obtención de librerías y selección de clones.
8. Expresión génica (i): mRNA. Genes Eucariotas, estudio del mRNA, análisis
de secuencias reguladoras.
9. Expresión génica (ii): proteínas. Obtención y análisis.
10. Expresión heteróloga de proteínas. Sistemas in-vitro, en E. Coli y en
levaduras.
11. Mutagénesis dirigida y estudios funcionales: doble híbrido.
12. Terapia génica.
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1. INTRODUCCIÓN.
La ingeniería genética es la manipulación de los ácidos nucléicos (DNA y
RNA) para obtener material genético recombinante, es decir, distinto al que
había inicialmente.
Momentos clave en la historia de la genética:
- S. XIX-XX: Mendel. Establece las leyes de la herencia y determina
factores heredables (genes) que se transmiten entre generaciones. Sutton
y Morgan. Los genes están dispuestos linealmente en los cromosomas.
- 1944: Avery, McLeod y McCartey; 1952: Hersey y Chase. Los
cromosomas están formados por DNA.
- 1952-66: Chargraff, Crick… Biología molecualr. Se descifra el código
genético (tres nucleótidosà un aminoácido), su degeneración, etc.
- 1971-73: desarrollo de la tecnología del DNA recombinante. Se puede
copiar, cortar y pegar el DNA.
- 1985: K. Mullis. Se desarrolla la técnica de la PCR gracias al enzima TAQ
polimerasa. Sirve para obtener muchas copias de una secuencia.
- 1990: secuenciación masiva de genomas.
- 20XX: mejora en la secuenciación, optimización en la obtención de
información genética de individuos.
Etapas del clonaje.
i) Obtener DNA original del organismo A.
ii) Modificarlo: se copian regiones, se cortan fragmentos, etc.
iii) Insertar el fragmento en un vector (molécula de DNA circular que contiene
mi fragmento) el cual se introduce en el huésped (organismo B).
iv) Selección de los huéspedes donde el proceso ha funcionado.
A partir de una única bacteria recombinante, se reproduce y genera una
colonia donde todos los individuos son clones (iguales entre sí). En una
misma placa puede haber colonias diferentes entre sí, pero todas las
bacterias de una misma colonia son iguales.
Herramientas de la IG.
Cuatro grupos de enzimas muy importantes:
- Enzimas de restricción (ER): cortan al DNA.
- Polimerasas: copian una molécula de DNA. Particularmente, la TAQ
polimerasa se usa en la PCR.
- Ligasas: unen dos nucleótidos contiguos sintetizando un enlace
fosfodiéster 5’P-3’OH entre ellos.
- Transcriptasa reversa (RT): a partir de mRNA, sintetiza cDNA.
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2. PURIFICACIÓN ÁCIDOS NUCLEICOS.
Antes de realizar cualquier experimento, debo disponer de DNA o RNA en
cantidad suficiente. Para ello, las vías de obtención más comunes:
Obtención DNA cromosómico Procariota.
Obtener bacterias en etapa de crecimiento máximo. Las bacterias deben
estar creciendo en un medio líquido para facilitar su multiplicación. Se deben
separar las bacterias mediante centrifugación para que precipiten y después
se resuspenden en un buffer para proceder a la extracción de DNA.
Lisarlas: las bacterias Gramm + se lisan con métodos físicos como
ultrasonidos o altas presiones por tener pared de mureína que dificulta la
acción de los agentes químicos; pero tiene el riesgo añadido de que también
podría romper el DNA.
Sin embargo, para las Gramm – se usan métodos químicos:
- Lisozima: degrada pared.
- EDTA: ácido etilendiaminotetraacético, quelante de cationes que
estabilizaban membranas y activaban enzimas DNasas.
- SDS (dodecilsulfato sódico) ó Triton X10: detergentes que disuelven
bicapas lipídicas.
Así obtenemos el extracto citoplasmático que contiene DNA + RNA + prots.
(imagen)
Después, hay que incubar con ribonucleasa A (RNasaA) para degradar
RNA. Me queda DNA y proteínas.
Posteriormente para degradar proteínas, uso proteinasa K (proteasa de
amplio espectro poco específica) y/o fenol con cloroformo (F:C, el fenol
desnaturaliza las proteínas y las hace precipitar a la fase orgánica). También
podría hacer una cromatografía de sílica (tricinato de guanidina) ó de
sepharosa que se adhieren al DNA en una columna y permiten separarlo de
las proteínas. Me queda el DNA en la fase inorgánica (sobrenadante)
claramente separado de las proteínas degradadas (fase inorgánica).
(imagen)
Añado etanol (70%) en frío y en presencia de sales para precipitar DNA.
Hago sucesivos lavados precipitándolo y descartando sobrenadantes.
Finalmente se resuspende en agua o tampón, y se conserva en frío.
Obtención DNA plasmídico Procariota.
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3. MANIPULACIÓN DE ÁC. NUCLEICOS.
Para manipular los ác.nucleicos podemos usar enzimas que cortan, copian,
pegan y modifican ligeramente las moléculas de material genético.
Enzimas que cortan los ácidos nucleicos.
Se debe reducir el tamaño del ácido nucleico para poder procesarlo. Existen
métodos físicos (ultrasonidos, agitación…) y químicos (hidrólisis ácida para
DNA y RNA, y básica para RNA). Sin embargo, el método más usado es la
digestión química con nucleasas, ya sea con exonucleasas (cortan desde
fuera hacia dentro) ó endonucleasas (cortan por dentro).
RNasa H: degrada el RNA de un híbrido de DNA+RNA.
(imagen)
Exonucleasa 3: degrada los extremos 3’ de un dsDNA deja extremos:
(imagen)
RNasa A: degrada ssRNA.
Nucleasa S1: con Mg2+ como cofactor genera gap en un dsDNA; pero con
Mn2+ corta todo el dsDNA; y con Zn2+ es endonucleasa de ssDNA, ssRNA y
dsDNA con gap.
(imagen)
DNasa 1: la exonucleasa 1. Con Mg2+ como cofactor genera nicks sobre el
dsDNA y degrada el ssDNA; y con Mn2+ corta el dsDNA.
(imagen)
Pero con diferencia, los más usados son los enzimas de restricción (ER). Se
trata de enzimas que cortan al dsDNA en puntos específicos. Cortan en
dianas concretas: secuencias de nucleótidos palindrómicas (se leen igual en
ambas cadenas). El corte se realiza en cada una de las dos cadenas del
dsDNA: se cortan enlaces fosfodiéster y enlaces de H. Requieren que el DNA
a digerir no esté metilado (es decir, que no sea reconocido como propio).
Requieren Mg2+ como cofactor.
Ejemplo: el enzima de restricción llamado EcoR1 se aisló de E. Coli, cepa R,
fue el 1º. Reconoce y corta la diana 5’GAATCC3’. Los 6 nt son la diana, si no
están estos 6 así ordenados, no se corta nada. En este caso, el corte se
realiza entre la G y la A.
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4. ESTUDIOS DEL DNA.
Existen varias técnicas para conocer y caracterizar el material genético en
todas sus formas (DNA, RNA, cromosomas, etc)
Marcaje de ácidos nucleicos.
Los nt se pueden marcar para usarlos como sonda: molécula de ácido
nucleico que está marcada (es detectable). Se puede hibridar a una región
concreta (diana) por complementariedad. Al estar unidas, si detecto la sonda
estoy detectando también la molécula diana. Para poderse hibridar (unir) a la
diana, la sonda debe estar desnaturalizada.
Se usan dNTP marcados con radioactividad ó métodos histoquímicos. Los
fluoróforos (colores) son como la radioactividad pero menos peligrosos y se
detectan a simple vista. En caso de usar radioactividad, se marca una de las
dos posiciones: alfa ó gamma.
(imagen)
Para marcar uniformemente una molécula entera de DNA, puedo usar:
- Nick translation: la DNA Pol 1 sobre un nick. Degrada y re-sintetiza una
de las dos cadenas. Le doy dNTPs marcados como sustrato:
(imagen)
- Primer extensión: sobre un molde desnaturalizado, hibridamos un cebador
y damos DNA Polimerasa y dNTPs marcados. Estrategias:
o Random priming: sobre ssDNA usando la polimerasa Klenow ó
sobre mRNA usando la RT. Suele usar primers universales. Obtiene
una sonda de DNA marcada.
(imagen)
o PCR: obtiene muchas copias de DNA marcado uniformemente que
si se desnaturaliza, será la sonda. Es una PCR normal pero con
dNTP marcados. Se realiza sobre una región concreta, con lo que la
sonda es muy específica.
(imagen)
o RT-PCR: similar al anterior, sirve para obtener gran cantidad de
sondas de cDNA a partir de un mRNA. En el momento que se
empieza a hacer la PCR, después de usar la RT, entonces añado
los dNTP marcados para que los productos de amplificación sean
detectables.
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5. POLYMERASE CHAIN REACTION.
La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es una técnica muy
importante, su descubridor recibió el Nobel. Sirve para copiar (amplificar) un
segmento de DNA concreto, sin modificarlo.
Cebadores y otros components de la PCR.
El cebador o primer es un pequeño oligo imprescindible para realizar la PCR.
En cada PCR usamos dos cebadores distintos, uno para cada extremo de lo
que quiero amplificar. Características de un cebador estándar:
- Miden entre 15 y 20 nt (o m.e.r.) cada uno.
- Cada uno es complementario a un extremo de la región a amplificar.
- Evitar poner secuencias que se autohibriden, porque se formaría una
estructura en forma de horquilla (hairpin) que no se hibridará a mi DNA
molde.
Cada cebador ha de ser complementario al molde, es decir, ha de poder
hibridar, pero hay cebadores especiales:
- Primer degenerado: se usa si no conozco la región del DNA pero sí
conozco la proteína: a partir de la seq de AA paso a seq de DNA mediante
el código genético. Pero como un AA puede venir codificado por diferentes
codones, puede haber varias combinaciones, por eso se llama
degenerado. Se suele usar la combinación más frecuente en la especie
que se trabaja. Ejemplo:
(imagen)
- Primer universal: pequeños primers complementarios a secuencias
altamente conservadas en el genoma de todos los organismos. Es muy
poco específico porque podría unirse a muchos lugares. Se usan en la
técnica del Random Priming.
Debido a que la PCR es una síntesis masiva de DNA, otro de los
componentes esenciales es la Polimerasa. Particularmente se usa la TAQ
polimerasa (de Thermus aquaticus). A temperatura ambiente no funciona y
se activa con calor.
Comete errores (no es 100% fidedigna), por tanto si necesitamos realizar un
clonaje donde no pueden cambiar los nt, usaremos otro tipo de polimerasa
como la Pfu o Pwo. En cambio, para diagnóstico, no es necesario que haga
corrección de errores y por tanto, es suficiente con usar la TAQ estándar.
Todas necesitan Mg2+ como cofactor.
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6. VECTORES.
Un vector es una molécula circular de dsDNA en la cual inserto un fragmento
exógeno. No necesariamente ha de expresarlo. Tipos de vectores (datos
variables según la bibliografía):
VECTOR
Plásmidos
Fago λ
Cósmidos
YAC’s
TAMAÑO
2-4 kb
50 kb
5,5 kb
11,5 kb
ACEPTA
10 kb
10-20 kb
45 kb
1 Mb
Características generales de todo vector.
Autoreplicativo: la replicación empieza en el punto OriC de los plásmidos,
lugar donde se une la DNAPol1 e inicia la replicación, la cual puede ser:
- Estricta: acompasa replicación con cromosoma bacteriano.
- Relajada: se replican independientemente del bacteriano. Tendrán más
copias en la cell.
Puede permanecer en el citoplasma (se replica autónomamente) o integrarse
dentro del genoma del huesped mediante secuencias homólogas y
recombinación (es un episoma):
(imagen)
Si se introducen varios plásmidos a la vez en la célula, deben tener OriC
distintos, ya que si lo tuvieran igual no podrían coexistir porque uno se
transcribiría antes que el otro y la célula lo acabaría desechando (sólo pueden
coexistir los pertenecientes a grupos de compatibilidad).
Capacidad de entrar dentro de la cell: una vez he insertado mi gen dentro
del vector (todo in vitro), he de meter ese vector en la cell para que lo use. Es
la transformación de la cell. La transformación se consigue por inducción de la
competencia, es decir, que la bacteria sea capaz de aceptar DNA exógeno
por forzar condiciones especiales en el medio. No se conocen los detalles
bioquímicos de porqué sucede. Se puede hacer mediante:
- CaCl2: induce competencia por desequilibrio salino. Se acompaña de
Shock Térmico (pulso breve de calor que ayuda a entrar el DNA). Es poco
agresivo.
- Electroporación: da una corriente eléctrica sobre el cultivo de cells para
hacer poros en las membranas, a través de los cuales entrará mi vector.
Agresivo pero muy eficiente, válido tanto para Procariotas como
Eucariotas.
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7. CRIBAJE DE GENOTECAS.
Una genoteca o librería genómica es un conjunto de clones que poseen,
cada uno, un fragmento del genoma completo de otro organismo.
Una librería de cDNA es un conjunto de clones que contienen, cada uno,
todos los genes de otro organismo. Sólo tienen las secuencias que se
expresan: los genes. Estos clones pueden ser bacterias, levaduras, etc…
ellos son los que contienen el genoma completo de otro organismo, o bien,
sus secuencias codificantes.
Los clones necesarios para hacer la libreria dependen del tamaño del:
- Genoma: si es grande necesita muchos clones.
- Vector: si es grande necesita pocos clones.
Obtención de librerías.
(imagen)
El fragmento final se liga a un vector, mediante adición de adaptadores o
conectores; o bien puedo hacer una PCR con los oligos que contengan las
dianas que me interesan para poder ligar los fragmentos al vector de forma
más específica.
Para obtener una librería genómica (por ejemplo, de una mosca en una
bacteria), puedo hacer:
(imagen)
Selección (screening) de clones.
Directamente (muy restringido):
- Si busco genes de resistencia a antibióticos, pongo los clones a crecer en
medio con el antibiotico.
- Si busco un gen metabólico, uso cells que sean mutantes en el gen que
busco (auxotrofas), las transformo con el material genético y los clones
recombinantes se sembrarán en un medio sin el metabolito que quiero.
Entonces, sólo viven las que tienen el gen metabólico que quería.
Indirectamente: hibridación con sonda. Para detectar genes. Se basa en
hibridar ácidos nucleicos debido a la complementariedad entre dos cadenas.
Podemos buscar genes en librerías de cDNA o genotecas mediante la
hibridación con sonda.
Para poder hacerlo, primero hay que hacer una transferencia a un filtro de
todas las colonias (basta tocarlas) y quedan en la misma posición en el filtro
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8. EXPRESIÓN GÉNICA (i): RNA.
Genes Eucariotas.
Se realiza un control positivo de la transcripción, en el que se necesitan los
Transcription Factors (TF) para poder iniciar la transcripción: proteínas que
activan la transcripción. También hay secuencias enhancer y silencer en el
DNA, que la intensifican/reducen.
Una vez se ha transcrito el gen, se obtiene un RNA inmaduro: el hnRNA.
Requiere modificaciomes post-transcripcionales para producir el
mensajero maduro: mRNA:
- Añadir CAP en 5’: es una guanosina especial, atrae al ribosoma
- Añadir cola de polyadeninas en 3’; atrae al SpliceSome y separa el RNA
del molde de DNA
- Splicing: cortar los intrones (GU-A-AG) y empalmar los exones del
tránscrito.
En general, un gen codifica para una proteína, pero en Eucariotas hay
excepciones:
- Pauta de lectura abierta (Open Read Frame, ORF). Un gen transcribe
para 1 mRNA, que codifica para varias proteínas. Es toda la secuencia
que queda entre un AUG y el codón de STOP. Es similar a los
policistrones: cada ORF tiene su propio punto de entrada del ribosoma
IRES (Internal Ribosome Entry Site) con Közak, pero las ORF están una
tras otra o pueden solapar (un operón nunca solapaba).
- Splicing alternativo: de un gen se obtienen varios mRNA y por tanto,
varias proteínas porque el mensajero primerio (hnRNA) se puede cortar
de diferente manera según el tejido o el momento en que se exprese. En
cada tejido o en cada momento hay factores de splicing diferentes que
cortan en hnRNA de distinta forma
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9. EXPRESIÓN GÉNICA (ii): PROTEÍNAS.
De forma distinta al mRNA, el cual no puede salir de la célula y su presencia
indica que en ese tejido se expresa inequívocamente el gen, encontrar la
proteína no implica que el gen se esté expresando en ese tejido porque las
proteínas pueden viajar de un tejido a otro y/o ser almacenadas. Por ejemplo,
la insulina (hormona peptídica) se sintetiza en el páncreas, pero si la
buscamos en el músculo, la encontraremos porque se encuentra unida a
receptores de la superficie de la célula muscular; la insulina no se está
expresando en la célula muscular.
Obtención de proteínas.
Extracción proteica: primero se extrae el conjunto protéico y después se
separa y purifica la proteína/s de interés. La extracción, en casi todos los
métodos implica añadir inhibidores de proteasas para evitar que se degraden
las proteínas. Según el compartimento donde estén las proteínas, se hará un
protocolo u otro. De forma genérica, se puede hacer:
- Extracción mecánica: homogenizar con pistón de vidrio suave u
homogenizar con molinillo si el tejido es más duro.
- Tratamiento enzimático para inhibir las proteasas.
- Choque osmótico: se alteran estructuras por cambios en [ ] de sales.
- Sonicación: mediante ultrasonidos se degradan otras estructuras que no
interesan.
- Congelar-descongelar: se guarda la muestra en un Eppendorf y se
deposita en N2 líquido, con lo que el cambio brusco de temperatura lisa
las células.
Purificación de proteína: dependiendo de las características de la proteína
requiere un método u otro. Posibilidades:
- Solubilidad diferencial: no purifica al 100%. Se basa en que hay proteínas
liposolubles (requiere disolventes orgánicos) o hidrosolubles (disolventes
acuosos).
- Precipitación: el sulfato de amonio hace precipitar las proteínas
secuencialmente cuando su punto isoeléctrico (carga global de la
molécula) es 0. La precipitación es secuencial: en función de la [ ] de
sulfato de amonio, van precipitando progresivamente las proteínas a
medida que llegan al PI = 0. Ejemplo: una proteína precipita a [30%] de
sulfato de amonio porque ha alcanzado su PI = 0.
(imagen)
Las dos metodologías anteriores no son muy usadas, se prefiere en general
hacer una cromatografía. Tipos de cromatografías:
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10. EXPRESIÓN HETERÓLOGA.
Un organisme (hoste) expressa una proteïna que originalment no té. Usos:
– Determinar la estructura en 3D de la proteïna (amb cristal·lització i raigs
X). Es necessita tenir-la pura i en ↑ quantitat.
– Expressar els dominis per separat i determinar funció, on es localitza...
– Produint diverses proteïnes a la vegada (fins a 100) i veure què passa.
– Produir ↑ quantitat d’una proteïna desitjada que tingui interès comercial.
Cal distingir entre una proteïna nativa (tal qual la obtenim de l’organisme
original que la produeix) i una proteïna recombinant (la produeix l’organisme
hoste per tècniques d’eng. genètica). Naturalment, poden ser wild-type si
tenen la seqüència original d’aminoàcids, o mutant si tenen algun canvi
respecte la original.
L’hoste o sistema d’expressió l’escollim en base al tipus de proteïna (gran o
petita, hidròfoba o no...); si requereix modificacions post-traduccionals;
informació prèvia disponible (ens pot indicar el destí de la proteïna); cost de
producció i quantitat/qualitat de proteïna desitjada (els sistemes senzills no
sempre processen correctament).
(imagen)
Expresión in-vitro/en sistema libre de células.
Es fa en un medi sense cells. Tot ho venen comercialment. Per realitzar-ho,
es barreja dins un Eppendorf o tub d’assaig l’extracte de transcripció.
Composicio:
– RNA Polimerasa dels bacteriòfags T7 ó SP6 perque són d’un sól pèptid,
per tant més simples que la bacterniana.
– Ribonucleòtids trifosfat (rNTP): rATP, rUTP, rCTP i rGTP de la qual el 90%
ha de ser diguanosina trifosfat (G-5’ppp5’-GTP), que és el CAP Eucariota
que atreu al ribosoma Euc. (només si tinc gens Euc.).
– Tampó amb [sals] necessària (reaction buffer).
Després posem el DNA (gen en vector ó com a producte amplificat de la PCR
en forma de cDNA). Ja ha de tenir promotors específics de les polimerases
que fem servir, i mai ha de tenir introns perque no disposem de maquinària
d’splicing. Deixem incubar a 37ºC durant 60-90 min. i obtenim l’RNA. Podem
traduïr-lo directament o purificar-lo, però en purificar es perd mostra.
Extracte de traducció. Conté:
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11. MUTAGÉNESIS Y ESTUDIOS FUNCIONALES.
Se puede cambiar un nucleótido en el DNA, pero debo saber cual es el que
quiero cambiar. Se realiza con los sistemas de mutagénesis dirigida (SDM) y
son la base de la Ingeniería de Proteínas: cambiar 1 nt en el DNA consigue
que a veces, haya un codón diferente en el mRNA y se produzca un nuevo
aminoácido, el cual quizás aporte nuevas características a la proteína.
Objetivos:
– Investigar la relación estructura-función: catálisis enzimática, dominios
funcionales en proteínas estructurales, plegamiento de las proteínas,
compartimentalización de las proteínas.
– Aplicados: modificar racionalmente las características de una proteína
para Conseguir un cambio concreto: termoestabilidad, resistencia a
oxidación, cambios de pH, mejora en la catálisis, propiedades farmacodinámicas y proteínas para la alimentación, optimizar requerimientos de
cofactor.
Tipos de mutagénesis dirigida (SDM):
Réplica de heterodúplex.
_______
Tots es basen en tenir el DNA que vull mutar en un vector en forma de
ssDNA. Li posso un primer amb el nt que vull tenir mutat, flanquejat de la
regió complementària. S’hibridarà tot excepte per el nt que tenen de diferent.
Amb la DNA Polimerasa i dNTP i es sintetitza DNA a partir del 3’ lliure. Posem
lligasa per reparar el nick i queda un heterodúplex. Amb això es transformen
bacteris i perque ens repliquin el vector de DNA. Però el vector té dues
cadenes: una amb la mutació i la altre normal, per tant, al final hi haurà ½ de
plasmidis amb la mutació estable i ½ de plasmidis amb el gen salvatge. Tot
queda dins el bacteri i m’interessarà treure-ho.
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12. TERAPIA GÉNICA.
Consisteix en la introducció d’un o més gens dins d’un organisme per millorarne la salut. Apart de gens reparadors, també poden ser gens citotòxics per
cells perjudicials (com les cancerose). Es fa a les cells somàtiques, no es pot a
les cells germinals (perque passaria a la descendència: impediments legals).
Volem que el DNA s’integri al genoma de l’individu, o be que es mantingui
episòmic al citoplasma. Si es fa dirigit, el tránsgen s’integra en una posició
concreta; però si es fa integració a l’altzar, és més fàcil però te desavantatges:
-
Baixa expressió.
Disrupció d’un gen endogen.
Sobreexpressió d’un oncògen veí.
Desavantatge del manteniment episòmic (DNA extracromosòmic):
expressió gènica limitada en el temps à cura no permanent.
Nivells de TG:
- in-vivo quan s’introdueix DNA directament a l’organisme.
- ex-vivo quan s’extreu una cell, se li inserta el DNA (amb virus o
transformació) i es reimplanta: te eficiència de transfecció molt més alta,
en part perque la transfecció és dirigida a les cèl.lules d’interès (per això
van millor els virus). Convé utilitzar un gen de selecció.
Actualment es treballa poc amb teràpia génica perque els antecedents
històrics han estat poc efectius i s’ha evidenciat un cert perill. Es vol reimpulsar
perque és una eina molt prometedora.
Tipus de TG en funció de l’acció. Cada teràpia és concreta per cada tipus de
malaltia:
- Suplementació gènica: safegeix una còpia funcional del gen defectiu.
Adient per malalties causades per mutacions de pèrdua de funció:
immunodeficiències, metabòliques. Primera teràpia gènica aprovada,
1990, EUA (tractament d’immunodeficiència combinada severa, SCID,
amb retrovirus). Només es va demostrar que era una tecnologia segura.
- Substitució gènica: canviar el gen defectiu per la còpia funcional
corregida. Bo per mutacions que causen un fenotip de guany de funció.
Necessiten molt temps en cultiu, amb lo que les cells acumulen
mutacions: no s’aplica.
- Mort cel·lular dirigida: és on es fa la majoria d’investigació. Molt útil
contra els càncers (amb retrovirus, adenovirus…). Mata selectiva i
específicament a un tipus cel·lular concret. Tipus:
o Direct killing: Mort directa de les cells tumorals. S’intodueix un
gen només a les cells canceroses que les mati. Sol ser un gen
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ENGINYERIA GENÈTICA I EVOLUCIÓ
Sobre l’ambre:
DNA antic o DNA fòssil:
Clonació dels vertebrats:
Completar el genoma:
Problemes del dinosaure un cop s’obté el zigot:
Conclusions del seminari:
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