Download Enraizamiento in vitro y ex vitro y aclimatación de Rosa canina L.

Universidad Austral de Chile
Facultad de Ciencias Agrarias
Escuela de Agronomía
Enraizamiento in vitro y ex vitro y aclimatación de
Rosa canina L.
Memoria presentada como parte de los
requisitos para optar al título de
Ingeniero Agrónomo
Paula Andrea González Lucero
Valdivia – Chile
2013
PROFESOR PATROCINANTE:
_______________________________________
Peter Seemann F
Ingeniero Agrónomo, Dr. rer. hort.
Instituto de Producción y Sanidad vegetal
PROFESOR COPATROCINANTE:
_______________________________________
Nancy Andrade S
Ingeniero Agrónomo, M. Sc
Instituto de Producción y Sanidad vegetal
PROFESOR INFORMANTE:
_______________________________________
Fernando Medel S.
Ingeniero Agrónomo, Dr. Ing. Agr.
Instituto de Producción y Sanidad Vegetal
i
INDICE DE MATERIAS
Capítulo
Página
RESUMEN
1
SUMMARY
2
1
INTRODUCCIÓN
3
2
MATERIAL Y MÉTODO
12
2.1
Material
12
2.1.1
Ubicación de los ensayos
12
2.1.2
Material vegetal
12
2.1.3
Material de laboratorio
13
2.1.4
Material de cultivo
13
2.1.5
Sustrato
13
2.1.6
Condiciones ambientales
13
2.2
Método
14
2.2.1
Descripción de los ensayos
15
2.2.2
Enraizamiento in vitro de R. canina
15
2.2.3
Enraizamiento ex vitro de R. canina
15
2.2.4
Aclimatación de R. canina
16
2.2.5
Variables evaluadas
16
2.2.5.1
Ensayo enraizamiento in vitro
16
ii
2.2.5.1.1
Porcentaje de enraizamiento (%)
16
2.2.5.1.2
Número de raíces (N°)
16
2.2.5.1.3
Longitud de raíces (cm)
16
2.2.5.1.4
Altura de plantas (cm)
16
2.2.5.1.5
Vigor de la planta
16
2.2.5.1.6
Formación de callo en enraizamiento in vitro
17
2.2.5.2
Ensayo enraizamiento ex vitro
17
2.2.5.2.1
Sobrevivencia enraizamiento ex vitro
17
2.2.5.2.2
Número de raíces
17
2.2.5.2.3
Longitud de raíces
18
2.2.5.2.4
Vigor de raíces
18
2.2.5.3
Ensayo de aclimatación
18
2.2.5.3.1
Sobrevivencia de aclimatación
18
2.2.6
Análisis de resultados
18
3
PRESENTACIÓN Y DISCUSIÓN DE RESULTADOS
19
3.1
Ensayo de enraizamiento in vitro de R.canina
19
3.1.1
Porcentaje de enraizamiento
19
3.1.2
Número de raíces
20
3.1.3
Longitud de raíces
23
3.1.4
Altura de la planta
25
3.1.5
Vigor de la planta
26
iii
3.1.6
Formación de callo
27
3.2
Ensayo de enraizamiento ex vitro de R.canina
29
3.3
Aclimatación
30
4
CONCLUSIONES
33
5
BIBLIOGRAFÍA
34
6
ANEXOS
40
iv
INDICE DE CUADROS
Cuadro
Página
1
Tratamientos para el ensayo de enraizamiento in vitro de R.canina
15
2
Escala numérica de vigor de plantas en ensayo de enraizamiento in
17
vitro de R.canina
3
Escala numérica de formación de callo
17
4
Vigor de la raíz en ensayo de enraizamiento ex vitro
18
5
Porcentaje de enraizamiento evaluado en el ensayo in vitro de R.
20
canina en función de la fuente auxínica y la concentración.
6
7
8
9
Vigor de plantas en ensayo de enraizamiento in vitro, de acuerdo a
las fuentes auxínicas y sus concentraciones
Formación de callo en plantas enraizadas in vitro
Resumen de datos ensayo de enraizamiento ex vitro
Sobrevivencia a la aclimatación de plantas enraizadas in vitro
27
28
30
31
v
INDICE DE FIGURAS
Figura
1
Página
a)Planta madre propagada de R. canina. b)Brotes de plantas
13
propagadas de R. canina
2
Efecto de tres auxinas sobre el número de raíces en el ensayo de
21
enraizamiento in vitro.
3
Efecto de cuatro concentraciones de auxinas en el número de raíces
22
en el ensayo de enraizamiento in vitro
4
Efecto de hormonas auxínicas sobre la longitud de raíces en el
24
ensayo de enraizamiento in vitro.
5
Efecto de cuatro concentraciones de auxinas en la longitud de raíces
24
en el ensayo de enraizamiento in vitro.
6
Efecto de tres fuentes auxínicas sobre la altura de las plantas
25
propagadas in vitro.
7
Efecto de cuatro concentraciones de auxinas sobre la altura de las
plantas propagadas in vitro.
26
vi
INDICE DE ANEXOS
Anexo
1
Página
Plántulas el día 90 después de establecido el ensayo de
40
enraizamiento in vitro (Tratamiento con la hormona AIA).
2
Plántulas el día 90 después de establecido el ensayo de
41
enraizamiento in vitro (Tratamiento con la hormona AIB).
3
Plántulas el día 90 después de establecido el ensayo de
42
enraizamiento in vitro (Tratamiento con la hormona ANA).
4
Agrupación de plántulas según escala numérica de vigor de planta.
43
5
Plantas después de la etapa de preaclimatación y plantas después
44
de 3 meses en invernadero.
6
Planta enraizamiento in vitro en el día 90.
45
7
Planta enraizamiento ex vitro en el día 30.
46
1
RESUMEN
La especie Rosa canina L. se multiplica con fines comerciales usando propagación
vegetativa por medio de esquejes, con bajos porcentajes de enraizamiento y altos
costos por planta enraizada lista para transplante. Debido a esta razón, es que la
presente investigación está orientada a desarrollar un protocolo que permita el
enraizamiento in vitro y ex vitro y aclimatación de esta especie de forma masiva.
Este trabajo se realizó en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales, perteneciente
al Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, Facultad de Ciencias Agrarias, de la
Universidad Austral de Chile, en Valdivia, XIV Región de Los Ríos.
Con el propósito de la investigación se utilizó como material vegetal, clones de una
planta colectada procedente del ecotipo P-518 de R.canina seleccionado de Puelche
S.A. de Los Angeles, VIII Región del Biobío. Para esto se diseñaron diferentes
ensayos, y mensualmente se hizo una evaluación de la respuesta de R.canina. Para el
enraizamiento in vitro, se utilizó medio de cultivo MS al 50% suplementado con las
hormonas ácido indol acético (AIA), ácido indol butírico (AIB) y ácido naftalén acético
(ANA), en concentraciones de 0, 1, 2, 4 µM. En el ensayo de enraizamiento ex vitro se
utilizaron plantas micropropagadas de la misma procedencia de la etapa de
enraizamiento in vitro, tratadas con la hormona AIB en concentraciones de 0, 25 y 50
ppm en soluciones por 25 minutos. Después del enraizamiento ex vitro, las plántulas
fueron llevadas a la etapa de aclimatación en el invernadero. Para la aclimatación de
las plántulas obtenidas del ensayo de enraizamiento in vitro, se utilizaron dos
tratamientos con los siguientes sustratos, arena: turba y perlita: vermiculita.
Las variables evaluadas para cada tratamiento fueron porcentaje de enraizamiento,
número de raíces, longitud de las raíces, vigor de la planta (ensayo enraizamiento in
vitro), formación de callo y el vigor de las raíces (ensayo de enraizamiento ex vitro).
Para la aclimatación se evaluó el porcentaje de sobrevivencia.
A través de esta investigación, se acepta la hipótesis de que es posible enraizar in vitro
y que es factible la aclimatación en invernadero de brotes y plántulas micropropagadas
de esta especie, y se rechaza la hipótesis de que es posible enraizar ex vitro brotes de
rosa mosqueta, ya que esta etapa de enraizamiento ex vitro no tuvo el resultado
2
esperado, por lo que a través del método in vitro, con la metodología apuntada fue
posible el enraizamiento de R.canina. A través del enraizamiento in vitro hubo un
resultado positivo, ya que el porcentaje de enraizamiento fue de 100% en los
tratamientos con las distintas hormonas y las concentraciones de 1, 2 y 4 µM. El mayor
número de raíces lo obtuvo el tratamiento AIA, sin diferencia en las concentraciones 1, 2
y 4 µM, la mayor longitud fue el tratamiento con la hormona ANA, sin diferencia entre las
distintas concentraciones. Para la altura de las plántulas, las hormonas se comportaron
de la misma manera, siendo las concentraciones 1, 2 y 4 µM las de una mayor altura,
en la variable de vigor, las plántulas consideradas de mayor vigor en una escala
numérica fueron encontradas en el tratamiento de ANA y la concentración de 2 µM, las
plántulas con mayor formación de callo, fueron las plántulas del tratamiento con la
hormona ANA; y también es posible la aclimatación de las plántulas obtenidas de la
etapa in vitro, ya que, en la etapa de aclimatación el porcentaje de sobrevivencia fue del
95%, no así las plántulas obtenidas del enraizamiento ex vitro, en que no hubo plántulas
sobrevivientes.
3
SUMMARY
Rosa canina L. is progagated with comercial purposes using vegetative propagation
through cuttings, with a low percentage of rooting and high costs per rooted plant ready
to be transplanted. Due to this reason, this research is aimed at developing a protocol
to allow in vitro rooting and ex vitro acclimatization of this species to a very great extent.
This work was carried out at the Plant Tissue Culture Laboratory that belongs to the
Institute of Production and Plant Protection, Faculty of Agricultural Sciences of the
Universidad Austral de Chile, Valdivia, Los Ríos Region.
In this investigation, we used plant clones as plant material collected from the R. canina
P-518 ecotype, selected by Puelche S.A, in Los Angeles, Bío-Bio Region, Chile. For
this, many experiments were designed and monthly assessment was carried out in
order to closely study the R.canina response. For the in vitro rooting, we used MS
medium at 50% supplemented with indol acetic acid (IAA), indole butyric acid (IBA) and
naphthalene acetic acid (NAA) in concentrations of 0, 1, 2, 4 uM. For ex vitro rooting,
we used micropropagated plants of the same origin of the in vitro rooting stage, treated
for 25 minutes with the AIB hormone with concentrations of 0, 25 and 50 ppm in
solutions. After the ex vitro rooting, the plantlets would be carried into the greenhouse
acclimatization. For the acclimatization of the plantlets obtained from the in vitro assay,
we used these two treatments with the following substrates, sand: peat (1:1) and perlite
vermiculite (1:1). Variables evaluated for each treatment were rooting percentage,
number of roots, root length, plant vigor (in vitro rooting experiment), callus formation,
and the vigor of the roots (ex vitro rooting experiment). For acclimatization, the survival
percentage was evaluated. Through this research, we accept the hypothesis that in
vitro rooting is possible and that acclimatization is feasible in the greenhouse using
micropropagated shoots of this species. However, we reject the hypothesis that it is
possible to root ex vitro rosehip buds as this ex vitro rooting stage did not have the
expected results. Never the less, in vitro method, with the methodology used, it was
possible to carry out R.canina rooting, which had a positive outcome. The rooting
percentage was 100% in treatments with hormones and various concentrations of 1, 2
and 4 µM. The highest number of roots was obtained by the IAA treatment, with no
4
difference in levels 1, 2 and 4 µM. The NAA hormone treatment was the longest
treatment, with no difference between the different concentrations. For plantlets height,
hormones behaved in the same way, the concentrations being 1, 2 and 4 µM. We
consider that the plantlets that had a better effect on a numerical scale were found in
the NAA treatment and the concentration of 2 µM. The plantlets with higher callus
formation were the plantlets with the NAA hormone treatment, and it is also possible to
acclimatize plantlets obtained from the in vitro propagation, since the survival rate in the
stage of acclimatization was 95%. However, there were no plantlets surviving in the ex
vitro rooting experiment.
5
1 INTRODUCCION
Rosa canina L. pertenece a la familia Rosaceae, esta familia conforma alrededor de
120 géneros y 3400 especies; abarca la mayoría de los árboles y arbustos frutales de
las regiones templadas y subtropicales del hemisferio norte (RIBOT, 2007).
En cuanto a su morfología es un arbusto que tiene raíz pivotante, con una masa radical
superficial que puede emitir tallos largos y erectos, los cuales producen flores al
segundo año y viven entre tres y cuatro años (SUDZUKI, 1992).
Las yemas son mixtas, y las hojas poseen estípulas prominentes. La inflorescencia es
compleja, se origina en el extremo de las ramas de dos años y en las ramillas laterales
(SUDZUKI, 1992).
Es originaria de Europa y Asia aunque también se puede encontrar en América del
Norte. Fue introducida en Sudamérica en el siglo XVIII con objetivos ornamentales por
inmigrantes europeos. Allí se propagó con mucha rapidez y actualmente crece
abundantemente en Argentina, en las zonas de los Andes y Patagonia, en el centro sur
de Chile y en algunas áreas de Perú. (WERLEMARK, 2007 y RIBOT, 2007). Su
distribución geográfica es muy amplia en el valle central, desde la Región del Biobío a
la Región de Los Lagos.
Según JOUBLAN y RIOS (2005) esta especie está ampliamente distribuida desde
Santiago hasta la región de Aysén y hasta 2000 metros sobre el nivel del mar. En el
país existen tres especies diferentes a las que se les designa como “Rosa mosqueta”
estas son:, Rosa moschata Herrm. , Rosa rubiginosa L. y Rosa canina L. (Farga y
Hoffmann, 1988; Fundación Chile, 1999; Joublan et al., 2000 citados por FLORES,
2005).
Rosa moschata H. Está ubicada especialmente en la cuenca de Santiago (Cajón del
Maipo) y quebrada Alvarado, en Limache (Sudzuki, 1995 citado por VALDEBENITO et
al., 2003). mide desde 1 a 2 metros llegando hasta 2,5 metros, presenta 5-9 hojas
finamente aserradas, la longitud de las hojas es de 2-6 cm., poseen flores blancas en
corimbos de 10-15 flores, su fruto es rojo, ovado de hasta 2,5 g., la floración se
6
presenta desde octubre a diciembre, estilos unidos en columnas, foliolos glandulosos,
pedúnculos espinescente-glanduloso (JOUBLAN et al, 2000).
Rosa rubiginosa L. Su distribución va desde Cauquenes al sur, mide desde 0,5 a 1,2
metros, presenta 5-7 hojas doblemente aserradas, la longitud de las hojas es de 1,5-2
cm., poseen flores rosadas, solitarias o agrupadas de 2-3, su fruto es rojo-anaranjado,
subgloboso u ovoide, pesa 1-1,5 g, la floración se presenta desde octubre a diciembre,
estilos libres, foliolos pubescentes-glandulosos, pedúnculos espinescentes-glandulosos
(JOUBLAN et al, 2000).
Rosa canina L. Su distribución va desde la región de Malleco, comuna de Los Sauces
al sur, mide desde 1,9-3,5 metros, presenta 3-7 hojas doblemente aserradas, la
longitud de las hojas es de 2-4 cm., poseen flores blancas, solitarias o agrupadas de 15, poseen fruto ovalado glabro, de color rojo de hasta 3 g, la floración se presenta de
octubre a diciembre, estilos libres, foliolos glabros o subglabros, pedúnculos glabros
(JOUBLAN et al, 2000).
El fruto de esta especie es de gran valor comercial debido a su alto contenido de
vitamina C, además de ácidos grasos esenciales, otorga al aceite propiedades
regenerativas para el tratamiento de la piel envejecida y enferma (FUNDACION DE
INNOVACION AGRARIA (FIA), 2008).
El fruto contiene pigmentos carotenoides, como licopeno y -criptoxantina, este último
de mayor importancia por tener forma de provitamina A, la cual eleva la calidad del
fruto y favorece algunas funciones fisiológicas (VALDEBENITO et al., 2003).
Del fruto se señala como producto principal la cascarilla que corresponde al
receptáculo maduro deshidratado, desmenuzado y sin semilla. Este producto se
exporta de forma deshidratada (VALDEBENITO et al., 2003).
La cascarilla de Rosa mosqueta tiene un gran potencial nutracéutico debido a su alto
contenido de vitamina C, licopeno y betacaroteno. Estos componentes son
considerados antioxidantes, diuréticos y anticancerígenos, respectivamente (COESAM
2010).
El aceite proveniente de los aquenios es un buen regenerador de tejidos, y tiene
excelentes efectos en la prevención del envejecimiento de la piel (VALDEBENITO et
7
al., 2003). La propagación de rosa mosqueta se justifica por el interés para establecerla
de forma comercial, para así disminuir la recolección de plantas silvestres (FIA, 2003
citado por FLORES, 2005).
La producción nacional está representada considerablemente por las regiones de
O’Higgins hasta el Biobío, ésta última región, con una participación cercana al 90%. La
recolección de los frutos se hace de plantas silvestres que están en terrenos no
agrícolas y las pérdidas de calidad de estos frutos son altas, debido a la gran cantidad
de plomo y cadmio provenientes del polvo generado en el lugar de recolección, que es
principalmente a orilla de carreteras (FIA, 2008).
La recolección de este fruto se hace principalmente por pequeños agricultores y sus
familias, para luego ser procesadas y exportadas a países europeos para la industria
farmacéutica (JOUBLAN y RIOS, 2005). La recolección se hace de las especies R.
moschata, R. rubiginosa, y en menor nivel de R. canina (FIA, 2008).
La producción nacional aporta un 85% de la oferta mundial con cerca de diez mil
toneladas producidas, tanto cascarilla deshidratada como el total de las partes del
fruto (FIA, 2010).
El establecimiento de esta especie como cultivo comercial ha sido difícil, ya que no se
ha llegado a un método de fácil multiplicación y obtención de plantas homogéneas, que
permita una buena producción y rentabilidad (ACEVEDO, 1997).
Las formas de propagación de rosa mosqueta que se usan frecuentemente son, a
través de esquejes, mugrones, y también por semillas, brotes etiolados o cultivo in vitro
(JOUBLAN et al., 2003; Bonga, 1987 citado por TI OO et al., 2008; Ozel et al. 2006
citado por DUBE et al., 2011a).
La propagación por esquejes consiste en cortar de la planta madre una porción de tallo
o rama, posteriormente esa porción se coloca en condiciones favorables y se provoca
la formación de raíces y tallos, obteniéndose una planta nueva (HARTMANN et al.,
2002).
Según FIA (2008) a través de la propagación por estacas en un sustrato poroso como
arena fina con una profundidad de 1-2 cm. se logra alrededor del 25% de
8
enraizamiento en R. moschata, al ser tratada con Acido Indol Butírico (AIB) con una
concentración de 1000 ppm.
La propagación por mugrón es un método en que se induce la formación de raíces
adventicias en un tallo que está todavía adherido a la planta madre, luego se separa,
convirtiéndose en una nueva planta (HARTMANN et al., 2002).
Este método tiene mejores resultados para R. rubiginosa y R. moschata cuando se
corta la planta a ras de suelo y eliminando el material viejo, para así amugronar y tener
plantas nuevas después de siete meses (FIA, 2008).
Para SUDZUKY (1992) la mejor forma de propagar rosa mosqueta, es mediante
esquejes enraizados, de la misma manera que se propagan las rosas ornamentales,
mientras que para JOUBLAN et al., (2000) la forma más económica es por mugrones.
La propagación por semillas se encuentra limitada a la mejora genética, y a la
multiplicación comercial de algunos portainjertos, como lo es R. canina y Rosa laxa, las
cuales tienen dificultad para enraizar a través de estaquillado. Las semillas germinarán
sólo después de un año desde la recolección y que se hayan conservadas
estratificadas (BAÑON et al., 1993).
Otra forma de propagación es el injerto por yemas, este método se utiliza mayormente
en viveros de rosas ornamentales. Los sistemas mayormente utilizados son escudete y
el injerto de raíz, y unos de los patrones que se utiliza habitualmente es de R. canina
(Fuchs, 1950 citado por WELDT, 2008).
Para el enraizamiento de brotes etiolados, los resultados obtenidos fueron favorables,
sin embargo, al hacerlo de forma masiva, tienen un alto costo de producción, por el
manejo desde que se obtienen los brotes, enraízan y se trasladan a bolsas para su
posterior plantación en terreno. (FIA, 2008).
Otra alternativa de propagación es la micropropagación que en la actualidad se está
aplicando con gran éxito en una gran gama de cultivos hortícolas, ornamentales,
frutales y forestales, sin dejar de lado la aplicación de estas técnicas en cultivos
extensivos de los que se ha seleccionado genotipos superiores de los cuales es
necesario contar con gran número de plantas idénticas (ROCA y MROGINSKI 1991;
SEEMANN, 1993).
9
El proceso de micropropagación se ha separado convencionalmente en cuatro etapas:
I, establecimiento del material en un medio aséptico; II, multiplicación del material
vegetal; III, enraizamiento y IV, ambientación de las plantas a la condición ex vitro
(ROCA y MROGINSKI, 1991; SEEMANN, 1993).
La propagación in vitro de R. canina según CASTILLA (2005) está entre las técnicas
del cultivo de tejido más empleada para la propagación de rosas. Se hace a través de
yemas y brotes axilares. KHOSH-KHUI y SINK (1982) señalan que los explantes
usados para R. canina son yemas apicales y meristemos axilares.
La inducción de callos en R. canina resultó con el medio Murashige y Skoog
(MS)(1962) y con altas concentraciones de BAP y ANA. (CASTILLA, 2005).
Mederos y Enríquez (1987) citado por WELDT (2008), indican que el material
provenientes de maderas blandas (parte media y superior de la rama del año) presenta
mayor porcentaje de establecimiento que el de maderas duras provenientes de la base.
WELDT (2008) confirma que el material que proviene del medio y ápice de la rama del
año, es el que muestra una mayor tasa de sobrevivencia (42% y 58%,
respectivamente), en comparación con la yemas procedentes de la base (10%).
Con el cultivo de yemas y brotes, las mutaciones espontáneas que se podrían
presentar son mínimas, debido a que provienen de meristemos organizados
(CASTILLA, 2005).
Para el método de establecimiento se debe desinfectar el explante antes de
establecerlo, THI OO. et al. (2008) utilizan cloro al 15% por 20 minutos, lavan 45
minutos en agua y posteriormente un minuto en etanol al 70%. Esterilizado el explante,
se introduce en el medio MS para iniciar la brotación y multiplicación.
DAVIES (1980) señala que el medio MS es el que más se utiliza para la propagación
de rosa, ya que presenta mejores porcentajes de establecimiento que el medio WPM.
WELDT (2008) compara la sobrevivencia al medio de cultivo MS y WPM, se observó
que no hay diferencias, pues ambos obtuvieron un 47% de sobrevivencia.
Para el método de multiplicación, Khosh-Khui y Sink, (1982) citado por PATI et al.,
(2005) señalan que los explantes que se usan en R. canina para su multiplicación y
posterior enraizamiento son aquellos de meristemas axilares y puntas apicales. La
10
incorporación de BAP al medio de cultivo es esencial para la multiplicación de distintos
cultivares de rosa, esto en una concentración entre 4,5 y 44 µM. con lo que se obtienen
entre 2,5 y 8 brotes por yema (HASEGAWA, 1980; Wulster y Sacalis, 1980 citado por
WELDT, 2008).
WELDT (2008) señala que la concentración de 11,1 µM de BAP es el tratamiento que
presenta el mayor número de brotes con 3,8 brotes/explante, en comparación con
dosis de 4,5 µM y 22 µM, que produjeron 2,3 y 2,5 brotes/explante, respectivamente.
THI OO et al. (2008) señalan que para la proliferación, la concentración más adecuada
para la iniciación de brotes y la multiplicación se encontró en medio MS suplementado
con 13,3 µM de BAP, encontrándose un número promedio de 7 brotes/explante y una
tasa de formación de brotes del 85%.
El medio MS que contenía 13,3 µM de BAP y 9,3 µM de Kinetina fue considerado como
óptimo para la proliferación de brotes (KANCHANAPOOM et al., 2010)
El medio MS que contiene 0,5 µM de IBA; 22,1 µM de BAP y 40 g/L de sacarosa es el
mejor medio para la proliferación de brotes (Razavizadeh et al., 2008 citado por DUBE
et al , 2011a) y la mejor tasa de multiplicación en R. chinensis Jacq. se obtiene con el
medio MS, enriquecido con 17,7 µM de BAP, 9,3 µM de Kinetina y 0,5 µM de ANA
(Bharadwaj et al., 2006 citado por DUBE et al, 2011a)
DUBE et al (2011a) confirma que la mayor tasa de proliferación de brotes se obtuvo en
el medio con 17,7 µM de BAP combinado con 2,6 µM de ANA, evaluado en el día 28,
encontrándose 6,8 brotes por explante y una altura de 4 cm.
El enraizamiento in vitro es la fase más importante en la propagación in vitro, para su
posterior adaptación a tierra (CASTILLA, 2005). Según PATI et al., (2005) el
enraizamiento es un requisito para facilitar el establecimiento de la planta al suelo.
Como menciona Kirichenko et al. (1991) citado por PATI et al., (2005), el enraizamiento
de especies de rosas con aceites esenciales es más difícil que las especies
ornamentales, esta comparación fue hecha entre las especies R. canina y Rosa
hibrida.
El enraizamiento in vitro tiene mejores resultados en un medio de cultivo MS al 50%,
llegando a un porcentaje de enraizamiento de 92%, al adicionar una concentración de
11
0,5 µM de Ácido Naftalen Acético (ANA), en comparación con un medio de cultivo MS
al 100%, con el cual se obtuvo un 48% de enraizamiento, con la misma concentración
de ANA (WELDT, 2008)
También se demuestra que un mayor número de raíces se da con una concentración
entre 0,5 y 1 µM de ANA (WELDT, 2008). El enraizamiento ex vitro se hace durante
más tiempo y existe mayor numero de raíces, las raíces formadas ex vitro son flexibles,
ramificadas y con pelos radicales a diferencia de la raíces in vitro, las cuales son
quebradizas, sin ramas y sin pelos (PATI et al. 2005).
El enraizamiento ex vitro es un método de una sola fase, la cual comprende el
enraizamiento y el endurecimiento, lo que lleva a un buen establecimiento en el suelo
(PATI. et al. 2005). Bini et al., (1983) citado por PATI et al., (2005) señalan que el
tratamiento con Acido Indol Butírico (AIB) con una concentración de 50-100 ppm, tiene
un buen resultado de enraizamiento.
El éxito de la aclimatación de plantas micropropagadas y su posterior traslado al campo
es un paso crucial para la explotación comercial. La aclimatación de plantas de rosas es
un procedimiento difícil, ya que las plántulas son de rápida desecación, debido a la alta
humedad relativa que tiene que tener el lugar donde se aclimatará las plantas
(Messeguer y Mele, 1986 citado por PATI et al., 2005).
La humedad relativa tiene un papel fundamental en la aclimatación y sobrevivencia de
las plantas. En algunos cultivares de rosas ornamentales como Landora, Sea o
Happiness entre otros, se obtuvo entre 92-98% de sobrevivencia con una humedad
entre 80-85% (Rout et al., 1989 citado por PATI et al., 2005)
En Chile la técnica de micropropagacion en R.canina se ha comenzado a estudiar hace
pocos años, llegando esta investigación sólo a las dos primeras etapas de la técnica,
tales como establecimiento, multiplicación y enraizamiento (WELDT, E. 2008).
Debido a la investigación realizada por WELDT (2008) se tiene antecedentes de que es
factible la propagación in vitro de R. canina, esta investigación pudo comenzar un
protocolo para su propagación, llegando a un buen resultado en las etapas de
establecimiento y multiplicación.
Siguiendo con la búsqueda de completar las etapas finales para obtener un protocolo de
propagación, se plantea como primera hipótesis que es posible enraizar in vitro brotes
de rosa mosqueta. Como segunda hipótesis se propone que es posible enraizar ex vitro
12
brotes de esta especie. Finalmente se plantea que es factible la aclimatación en
invernadero de brotes y plántulas micropropagadas de esta especie.
Para llevar a cabo esta investigación, el objetivo general es desarrollar protocolos que
permitan el enraizamiento in vitro y ex vitro a partir de brotes de R. canina y su posterior
aclimatación. Para cumplir el objetivo general, se proponen los siguientes objetivos
específicos:

Diseñar un medio de cultivo adecuado para el enraizamiento in vitro del
explante, y con ello evaluar parámetros con los que se pueda llegar a elegir el
mejor medio de cultivo.

Diseñar un sistema para el enraizamiento ex vitro de brotes, con lo que se
intenta hacer en un paso la etapa de enraizamiento y preaclimatación de los
brotes.

Evaluar la respuesta a la aclimatación en invernadero de brotes y plántulas
micropropagadas bajo condiciones controladas.
13
2 MATERIAL Y METODO
2.1
Material
Para el desarrollo de la presente investigación se requirieron diversos
materiales e instalaciones que se mencionan a continuación.
2.1.1
Ubicación de los ensayos. El trabajo práctico se realizó en el Laboratorio de
Cultivo de Tejidos Vegetales del Instituto de Producción y Sanidad Vegetal, y en el
invernadero ubicado en el Campus Isla Teja de la Universidad Austral de Chile en
Valdivia.
2.1.2 Material vegetal. Se utilizó como material vegetal brotes micropropagados de
plantas de R. canina obtenidos de una planta madre micropropagada a través de sus
brotes axilares y yemas apicales, en el medio MS. Estos brotes fueron obtenidos el año
2007, desde el sector de Los Sauces, Región de la Araucanía, a partir de un clon
procedente del ecotipo P-518 (FIGURA 1a) de R. canina seleccionado en Puelche S.A.
en Los Angeles, VIII Región del Biobío (WELDT, 2008) y se encuentran en el banco de
plantas del Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales del establecimiento.
a
FIGURA
b
1 a) Planta madre propagada de R. canina. b) Brotes de plantas
propagadas de R. canina.
FUENTE: WELDT (2008).
14
2.1.3 Material de laboratorio. El material de laboratorio que se utilizó fue el siguiente:
cámara
de
flujo
laminar,
agitador
magnético,
pHímetro,
horno
microondas,
dispensador, balanzas, pipetas, vasos de precipitado, probetas, matraces, frascos de
vidrio, pinzas, bisturís y soluciones requeridas para la elaboración de los medios de
cultivos.
2.1.4 Medio de cultivo. Se utilizó el medio de cultivo MS al 50% (MURASHIGE y
SKOOG, 1962) al cual se le agregó hormonas de tipo auxinas como Ácido Naftalén
Acético (ANA), Ácido Indol Acético (AIA) y Ácido Indol Butírico (AIB), en distintas
concentraciones (0, 1, 2 y 4 µM) para la obtención de una mejor respuesta de los
explantes al enraizamiento in vitro. Una vez realizado esto, y previo a la disolución del
medio en un horno microondas, se ajustó el pH entre 5,7-5,8, con hidróxido de potasio
(KOH 0,1N). Luego, con la ayuda de un dispensador, se dispensaron 10 mL de medio
en cada frasco, los cuales después de ser sellados con papel aluminio, se llevaron a
autoclave para ser esterilizados a 121ºc durante 15 minutos.
2.1.5
Sustrato. Para el enraizamiento ex vitro y la aclimatación de las plantas
obtenidas se utilizó mezclas de sustratos (arena:turba y perlita:vermiculita) los cuales
fueron esterilizados con el método de tindalización, donde se llevaron a autoclave a
100°C durante 20 minutos, esto se repitió 3 veces.
2.1.6 Condiciones ambientales. La etapa de enraizamiento in vitro se realizó en la
sala de incubación del laboratorio de cultivo de tejidos vegetales, a una temperatura de
22°C ± 2°C con una intensidad lumínica de 2.000 a 4.000 lux y un fotoperíodo de 16
horas luz. Luego pasaron a la sala de preaclimatación la cual estuvo a temperatura
ambiente de 16°C±2°C.
2.2
Método
El método utilizado para la elaboración de esta investigación fue el siguiente.
15
2.2.1
Descripción de los ensayos. En esta investigación se diseñaron distintos
ensayos, para evaluar la respuesta de R. canina frente al medio de cultivo (MS);
distintas concentraciones y diferentes auxinas para el enraizamiento in vitro y distintas
concentraciones de ácido indol butírico (AIB) para el enraizamiento ex vitro. Luego los
ensayos pasaron a la etapa de aclimatación.
2.2.2 Enraizamiento in vitro de R. canina. Este ensayo se estableció el 17 de agosto
de 2010, se realizó con brotes micropropagados y estos se establecieron en los
distintos medios de cultivos en un diseño al azar, con 12 tratamientos ordenados en un
experimento factorial con los siguientes factores:

3 auxinas: ANA (Acido Naftalén Acético), AIB (Acido Indol Butírico), AIA (Acido
Indol Acético)

4 dosis de cada auxina: 0, 1, 2 y 4 µM, equivalentes a las masas (mg/L)
indicados en el Cuadro 1.
CUADRO 1 Tratamientos para el enraizamiento in vitro de R. canina.
Auxina/µMol
ANA
AIB
AIA
0
0
0
0
1
0,18 mg/L
0,20 mg/L
0,19 mg/L
2
0,35 mg/L
0,41 mg/L
0,37 mg/L
4
0,70 mg/L
0,81 mg/L
0,74 mg/L
Cada tratamiento constó de 15 repeticiones.
2.2.3
Enraizamiento ex vitro de R. canina. El ensayo se estableció el 23 de
diciembre de 2011, se realizó con brotes micropropagados, los cuales pasaron
directamente al sustrato de enraizamiento. Estos se establecieron en un diseño al azar
con 3 tratamientos, los brotes fueron sumergidos por 25 minutos en solución acuosa de
AIB en tres concentraciones: 0, 25 y 50 ppm.
Se trabajó con 3 repeticiones de 12 plántulas cada una. Estuvieron 30 días en la etapa
de preaclimatación en el Laboratorio de Cultivo de Tejidos Vegetales de la Universidad,
16
donde el fotoperiodo era de 16 horas, una intensidad lumínica de 2.000 lux, y una
temperatura entre 10 a 18°C.
Luego al invernadero con las condiciones existentes en el mes de febrero, se utilizó un
sistema de nebulización el cual aportaría las necesidades hídricas de las plántulas.
2.2.4 Aclimatación de R. canina. Este ensayo se estableció el 18 de noviembre de
2010, se realizó con las plántulas obtenidas del ensayo de enraizamiento in vitro y se
estableció con dos tratamientos correspondientes a dos mezclas de sustrato:

Arena/turba y perlita/vermiculita (1:1)
En cada mezcla de sustrato se establecieron plántulas homogéneas obtenidas de los
tratamientos realizados en el enraizamiento in vitro, con tres repeticiones de 15
plántulas cada una.
2.2.5
Variables evaluadas. En los ensayos se evaluaron las siguientes variables:
2.2.5.1 Ensayo de enraizamiento in vitro.
2.2.5.1.1
Porcentaje de enraizamiento (%). Se determinó cuantas plantas
enraizaron en cada tratamiento, en relación al total de plántulas establecidas.
2.2.5.1.2
Numero de raíces (N°). Se contó la cantidad de raíces en cada planta.
2.2.5.1.3
Longitud de raíces (cm). Se midió la longitud de cada raíz desde la
base del callo, y se obtuvo un promedio por planta.
2.2.5.1.4
Altura de la planta (cm). Se midió la altura de cada planta desde la
base del tallo hasta la última hoja.
2.2.5.1.5
Vigor de la planta. Se aplicó una escala numérica con la
que se
clasificaron las plantas según la vigorosidad de las raíces presentes y de la parte
aérea. Esta variable se midió al finalizar el ensayo de enraizamiento in vitro.
17
Cuadro 2: Escala numérica de vigor de plantas en ensayo de enraizamiento in
vitro.
Vigor de planta
Descripción
1
Plantas con hojas de color café, una altura entre 0,9‐3 cm, entre 1‐12 raíces y una longitud de raíces entre 1,5‐5,3 cm.
2
Planta con hojas de color café y verde, una altura entre 1,9‐6,2 cm, entre 1‐13 raíces una longitud de raíces entre 0,6‐10,6 cm.
3
Planta con hojas de color verde, una altura entre 2,7‐9,8 cm, entre 2‐14 raíces y una
longitud de raíces entre 1,1‐4,9 cm.
4
Planta con hojas de color verde, una altura entre 2,8‐10,1 cm, entre 1‐25 raíces y
una longitud de raíces entre 0,6‐12,9 cm.
5
Planta con hojas de color verde, una altura entre 3,8‐10,8 cm, entre 3‐20 raíces y
una longitud de raíces entre 1,4‐24 cm.
2.2.5.1.6
Formación de callo enraizamiento in vitro. Se hizo una escala numérica
con la que se clasificaron las plantas según el grado de desarrollo de callo.
Esta se medió al momento de pasar las plantas desde la etapa de
enraizamiento a la etapa de aclimatación.
CUADRO 3: Escala numérica de formación de callo.
Grado formación de callo
1
2
3
Descripción
Plantas que no presenten formación de callo
Plantas que presenten una formación de callo < 1 cm
Plantas que presenten una formación de callo > 1 cm
2.2.5.2 Ensayo de enraizamiento ex vitro.
2.2.5.2.1
Sobrevivencia al enraizamiento ex vitro (%).Se calculó las plántulas
sobrevivientes, registrando aquellos brotes vivos presentes en cada tratamiento, en
relación al total de plántulas trasplantadas. Descripción
2.2.5.2.2
Numero de raíces (N°). Se contó la cantidad de raíces en cada planta.
18
2.2.5.2.3
Longitud de raíces (cm). Se midió la longitud de cada raíz desde la
base del callo, y se obtuvo un promedio por planta.
2.2.5.2.4
Vigor de las raíces. Se aplicó una escala numérica con la que se
clasificaron las plantas según la vigorosidad de las raíces presentes. Esta variable se
determinó al finalizar el ensayo de enraizamiento ex vitro.
CUADRO 4
Vigor de las raíces en ensayo de enraizamiento ex vitro.
Vigor de raíces
1
2
3
4
5
Descripción Raíz débil y pequeña
Raíces pequeñas, 1‐2 raíces débiles
Entre 3‐4 raíces pequeñas y menos débiles
Gran número de raíces y de pequeña longitud
Gran número de raíces y mayor longitud, además de presentar pelos radicales
2.2.5.3 Ensayo de aclimatación.
2.2.5.3.1
Sobrevivencia de aclimatación (%). Se calculó registrando aquellas
plantas vivas en cada tratamiento, en relación con el total de plantas trasplantadas.
Las evaluaciones fueron realizadas a los 30, 60 y 90 Días Después de Inicio (D.D.I.) a
partir del establecimiento de los ensayos.
2.2.6
Análisis de resultados. Cada variable fue analizada estadísticamente con un
análisis de varianza (ANDEVA) y si el valor-P fue <0,05 se realizó un test de
comparación múltiple de Tukey (DHS) al 5% de significancia.
Por otra parte las variables de vigor de planta y formación de callo, fueron evaluadas
mediante la prueba de Kruskal-Wallis, y con una separación de medianas a posteriori
mediante la prueba de Nemenyi (p<0,05). Para los análisis estadísticos se utilizaron los
programas Statgraphics Centurion XV.II y StatSoft Statistica 7.0.
Los datos de la variable en porcentaje fueron previamente transformadas con la
siguiente formula (Steel y Torrie, 1980): √X+0,5
19 3
3 PRESENTACION Y DISCUSION DE RESULTADOS
3.1 Ensayo de enraizamiento in vitro de R. canina.
Con el propósito de evaluar el enraizamiento in vitro de R. canina, se determinaron las
siguientes variables. Estas fueron analizadas en relación a variable/hormona y
variable/concentración, ya que estadísticamente no hay interacción entre las hormonas
y concentraciones utilizadas.
3.1.1 Porcentaje de enraizamiento. La evaluación se realizó separando las repuestas
de los tratamientos según la auxina y la concentración hormonal utilizada. El Cuadro 5
muestra el porcentaje de enraizamiento para el ensayo in vitro, en el cual se observa
los distintos tratamientos. Tanto las distintas hormonas y las distintas concentraciones,
presentaron diferencias significativas (p<0,05) siendo el tratamiento testigo (el medio
de cultivo que no contiene ninguna hormona y por ende, ninguna concentración) es el
que se separa de los otros tratamientos y tiene un menor porcentaje de enraizamiento,
siendo en este parámetro él que peor se comporta, presentando un 73% de plantas
enraizadas en comparación con los otros tratamientos que presentan 100% de
enraizamiento.
BHOOMSIRI y MADOMBOON (s/f) señalan que para la especie R. damascena con
medio MS suplementado con 2,6 µM de ANA se obtiene un enraizamiento de 87,5%.
CABRERA (1999) señala que para la iniciación de raíces en cortes de tallo, las auxinas
como ANA, AIA y AIB se utilizan para causar la iniciación de éstas, dando como
resultados que ANA es más eficaz que AIA.
Khosh- khui y Sink (1982) citado por PATI et al. (2005)), señalan que el medio de
cultivo con la mitad de los minerales y suplementado con ANA con una concentración
entre 0 y 0,5 µM, es adecuado para inducir el enraizamiento, llegando a obtener un
85% en diversos cultivares de rosa.
20
Para XING et al. (2010) con una concentración entre 2,5 y 5 µM de AIB se obtiene un
80% de enraizamiento en la especie R. rugosa. Para el cultivar “Tang White” no hubo
diferencias entre las distintas concentraciones de AIB.
CUADRO 5:
Porcentaje
de
enraizamiento
evaluado
en
el
ensayo
de
enraizamiento in vitro de R. canina, en relación de la fuente
auxínica y la concentración.
Hormona
% Enraizamiento Concentración % Enraizamiento
73 b
73 b
Testigo
0 µM
100 a
100 a
AIA
1 µM
100 a
100 a
AIB
2 µM
100 a
100 a
ANA
4 µM
Letrras distintas indican diferencias significativas p<0,05.
3.1.2 Número de raíces. La Figura 2, muestra el número de raíces para los
tratamientos hormonales (AIA, ANA, AIB) y el testigo, en las tres fechas evaluadas.
Para este caso hay diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos
(p<0,05).
Para la fecha 1 se presentan diferencias estadísticamente significativas, por lo que al
aplicar la prueba de Tukey (5% significancia), el tratamiento testigo es el que se
diferencia de los otros tratamientos con un promedio de 1-2 raíces por planta. En
cambio, para la fecha 2, hay diferencias estadísticas entre los tratamientos,
formándose así cuatro grupos, siendo el tratamiento testigo el más bajo (2-3 raíces) y
el tratamiento con la hormona AIA es el que presenta mayor número de raíces,
encontrándose entre 10-12 raíces por plantas; y finalmente para la fecha 3 hay
diferencias estadísticamente significativas entre los tratamientos hormonales y el
testigo, siendo el testigo que se separa, presentando un menor número de raíces por
planta (2-3 raíces).
21
Así también, ARNOLD et al. (1995) dice que para algunos cultivares de rosas, el medio
suplementado con bajas concentraciones, independiente de cuál sea, presentaría un
buen porcentaje de enraizamiento, siendo en el mejor de los casos un 95%.
La Figura 3 muestra el efecto de las distintas concentraciones hormonales sobre el
número de raíces. En las tres fechas evaluadas hay diferencias estadísticamente
significativas entre las concentraciones, y al aplicar el test de Tukey, se forman dos
grupos, en que solo la concentración cero (testigo) es la que se diferencia del resto de
las concentraciones (1, 2 y 4 µM)
Similares criterios expone Torres (1991) citado por YONG (2004) trabajando en el
enraizamiento in vitro de Rosa hybrida L. cultivar Royalty. En este caso, el uso de AIB
dió mayores resultados que el AIA, siendo las mejores concentraciones de auxina 14,7;
4,9 y 1,5 µM.
HASEGAWA (1980), señala que para un tipo de Rosa cv. Improved Blaze se debe
reforzar el medio de cultivo con 0,16 ó 5,3 µM ANA ó 5,7 µM AIA.
BHOOMSIRI y MADOMBOON (2003) demuestran que un mayor número de raíces se
obtiene en un medio MS suplementado con 2,6 µM de ANA, obteniendo 2,7 raíces por
explante.
Para XING et al., (2010) con una concentración entre 2,5 y 5 µM de AIB se obtiene
alrededor de 4 raíces por explante.
Ahmad (1996) citado por JAVED et al. (2003) considera que 2,4 µM de AIB es lo mejor
para el inicio de raíces, concentraciones más altas pueden reducir el porcentaje de
enraizamiento.
EBRAHIMI and MOHAMMADI-NEJAD (2011) indica que el mejor medio para aumentar
el número de raíces fue el medio MS al 50% adicionando 8,5 µM de AIA, y también el
mismo medio con la adición de 4,9 µM de AIB.
Un mayor número de raíces fue producido por AIA, sin embargo al aumentar la
concentración de esta auxina se produce una reducción en el número de raíces
(ASADI et al., 2009).
22
FIGURA 2 Efecto de tres auxinas sobre el número de raíces en el ensayo de
enraizamiento in vitro.
FIGURA 3 Efecto de cuatro concentraciones de auxinas en el número de raíces
en el ensayo de enraizamiento in vitro.
23
3.1.3 Longitud de raíces. La Figura 4 presenta la longitud de las raíces, según la
hormona utilizada, además del tratamiento testigo, éstas al ser analizadas presentan
diferencias estadísticamente significativas para las tres fechas evaluadas (p<0.05).
Para la fecha 1 hay diferencias entre los tratamientos de las hormonas con el testigo.
Este es el que presenta raíces con menor longitud (0,5 cm). Para la fecha 2 el
tratamiento con mayor longitud de raíces es el tratamiento con ANA (3 cm), mientras el
tratamiento testigo es el que presenta menor longitud de raíces junto con el tratamiento
de AIA (2 y 1,5 cm, respectivamente). Para la fecha 3, el tratamiento con AIA presenta
los valores de menor longitud de raíces (2 cm), en cambio el tratamiento con ANA es
el que tiene mayor longitud de raíces (4 cm).
En la Figura 5 se observa que al comparar la longitud de las raíces con las
concentraciones utilizadas, solo en la fecha 1 hay diferencias estadísticamente
significativas, en que la concentración 0 es la que posee raíces con las menores
longitudes (0,5 cm), en cambio la concentración 1 con mayor longitud (1,6), en las
fechas 2 y 3 no hay diferencias entre las concentraciones para la longitud de raíces por
planta.
MOALEEM et al. (2012) señalan que un medio adicionado con 5,3 µM de ANA y 1,1
µM de BAP presentan una longitud de raíz de 4,2 ±0,15 cm, la tasa de crecimiento es
mejor en todos los tratamientos que combinan ANA y BAP, en comparación con ANA y
BAP por separado.
Taiz and Ziger (2000) citado por MOALEEM et al. (2012) hacen referencia a que las
bajas concentraciones de auxinas causan un aumento en el crecimiento de las raíces,
pero altas concentraciones evitan el crecimiento de la raíz, esto se debería a que con
las altas concentraciones de auxinas aumenta la producción de etileno.
24
FIGURA 4
Efecto de hormonas auxínicas sobre la longitud de raíces en el
ensayo de enraizamiento in vitro.
FIGURA 5 Efecto de cuatro concentraciones de auxinas en la longitud de raíces
en el ensayo de enraizamiento in vitro.
25
3.1.3 Altura de la planta. La Figura 6 muestra la altura de la planta al momento de
término del período en que ésta se encuentra en la fase in vitro, y se puede apreciar
que el tratamiento de AIB de 1µM es el que en promedio tiene 6 cm de altura, y el
tratamiento testigo es el que tiene un menor desarrollo en cuanto a la altura siendo
menor a 4 cm.
La altura de la planta fue evaluada al final del ensayo, al día 90 D.D.I. Al ser analizados
los datos, presentaron diferencias estadísticamente significativas, siendo el testigo (3
cm apróx.) el que se diferencia del resto de los tratamientos con hormonas, siendo los
otros tratamientos estadísticamente iguales entre sí.
Al analizar la altura de la planta y las distintas concentraciones (Figura 7), hay
diferencias estadísticamente significativas. El tratamiento testigo (concentración 0) es
el que presenta menor altura de planta y los tratamientos de las concentraciones 1 y 2
µM son los que tienen plantas con mayor altura.
Jaskani et al., (2005) citado por DUBE et al. (2011a) señala que en R. hybrida la mayor
longitud de brotes se obtuvo en medio MS suplementado con 17,1 µM de AIA y 13,3
µM de BAP.
FIGURA 6
Efecto de tres fuentes auxínicas sobre la altura de las plantas
propagadas in vitro.
26
FIGURA 7 Efecto de cuatro concentraciones auxínicas sobre la altura de las
plantas propagadas in vitro.
3.1.5 Vigor de la planta. El Cuadro 6 muestra el vigor de las plantas en el ensayo de
enraizamiento in vitro, el cual presenta los resultados con un rango promedio para los
tratamientos de hormonas y concentración por separado.
Se observa que para los tratamientos hormonales, hay diferencias estadísticamente
significativas (Kruskal – Wallis H(3)=14,09953; p=0,0028).
En este caso el tratamiento con ANA presenta el mayor rango promedio, lo que
significa que presenta un mayor número de plantas con características que las hacen
más vigorosas que el resto de los tratamientos. Aunque no se diferencia
significativamente del resto de las auxinas. El peor tratamiento es el testigo que
presenta un rango entre 2-3, y como se muestra en el Cuadro 2 es el rango en que
encuentran las plantas con menor vigor.
Para el caso del análisis para las distintas concentraciones, existen diferencias
significativas (Kruskal – Wallis H(3)=21,44083; p=0,0001) entre los niveles auxínicos.
27
En este caso los tratamientos con las concentraciones de 1µM y 2µM son los que
presentan un rango promedio de mayor vigor, por lo que las plantas de estos
tratamientos son de mayor calidad que las de otros tratamientos. Los tratamientos
(Testigo y 4µM)
con plantas menos vigorosas son los tratamientos con las
concentraciones de 0 y 4µM.
CUADRO 6 Vigor de plantas en el ensayo de enraizamiento in vitro de acuerdo a
las fuentes auxínicas y sus concentraciones.
HORMONA Rango promedio CONCENTRACION (µM) Rango promedio
TESTIGO
2,7 b
0 µM
2,7 b
AIA
3,3 ab
1 µM
3,7 a
AIB
3,3 ab
2 µM
3,7 a
ANA
3,6 a
4 µM
2,8 ab
Diferentes letras indican diferencias significativas (p<0.05, Nemenyi)
3.1.6 Formación de callo. El Cuadro 7 representa la formación de callo en las plantas
de R.canina enraizadas in vitro, en relación a la hormona y la concentración usada.
Los tratamientos, presentan diferencias estadísticamente significativas (Kruskal –
Wallis H(3)=117,4817; p=0,0001) en formación de callo.
En este caso el tratamiento con la hormona ANA es la que presenta un rango promedio
cercano a 3, lo que significa que tiene una alta formación de callo (Cuadro 6), mientras
el testigo presenta las plantas con menor formación de callo.
Esto concuerda con lo que señala ESITKEN y ERCISLE (2001) que en R.canina la
inducción de callo es alta en presencia de elevadas concentraciones de ANA. Y con lo
que indica Dohm et al., (2001) citado por NARVAEZ, (2009) realizaron una
investigación en embriogénesis somática de rosas, utilizando explantes de hojas en un
medio basal MS suplementado con 2,4D o con ANA.
Al igual que el análisis de hormona, el análisis para las distintas concentraciones arroja
diferencias significativas (Kruskal – Wallis H(3)= 85,1338; p= 0,0001) entre los
tratamientos.
28
Al aplicar la prueba de Nemenji, el tratamiento Testigo (concentración 0), es el que se
diferencia del resto de los tratamientos, siendo el que señala un rango promedio 1, lo
que significa que tiene una formación baja, casi nula de callo.
Con una concentración de 33,4 µM de AIB y 0,53 µM de ANA se observó una alta
formación de callo según lo señalado por Soomro et al., (2003) citado por DUBE et al.
(2011b)
En plantas de rosas “Hibrido de té” se observó que los valores más altos de formación
de callo se encuentran en las dosis más altas de las distintas auxinas (AIA, ANA y AIB)
(JAVED et al., 2003).
Con una relación intermedia entre auxina/citocinina se induce el crecimiento
desorganizado como es el tejido de callo (Minorsky, 2001 citado por VIDALES, 2002).
La fase de formación de callos se evita cuando el fin del procedimiento es la
micropropagación, debido a que las plantas con formación de callos presentan grados
de variación genética (Larkin et al, (1981) citado por ROCA Y MROGINSKI (1991) y
García, (1999) citado por CASTILLA, (2005)).
Desde el punto de vista de la propagación, la embriogénesis somática es muy eficiente
al considerar el número de plantas regeneradas por unidad de tiempo. Pero se debe
considerar que los embriones somáticos tienen su origen a partir de callos, los cuales
como se señaló anteriormente, implican un grado de variación genética (ROCA Y
MROGINSKI (1991).
Depende del cultivar si la respuesta es favorable a la formación de callos
embriogénicos, así también del estado de desarrollo de la planta madre. Explantes
maduros forman callos embriogénicos, sin embargo los explantes jóvenes no
(NARVAEZ, 2009).
29
CUADRO 7 Formación de callo en el ensayo de plantas enraizadas in vitro.
HORMONA
TESTIGO
AIA
AIB
ANA
Rango promedio CONCENTRACION (µM) Rango promedio
1,0 b
0 µM
1,0 b
1,8 b
1 µM
2,2 a
2,3 ab
2 µM
2,3 a
2,7 a
4 µM
2,3 a
Diferentes letras indican diferencias significativas (p<0.05, Nemenyi)
3.2 Ensayo de enraizamiento ex vitro de R. canina.
Con el propósito de evaluar el enraizamiento ex vitro de R. canina, se evaluaron las
variables de sobrevivencia, número de raíces, longitud de raíces, altura de planta y
vigor de la raíz.
Los datos obtenidos se presentan en el Cuadro 8, la sobrevivencia de las plantas fue
muy baja, siendo en promedio de 9,2% del total de plantas en los 3 tratamientos, dado
que la cantidad de datos fue extremadamente baja, no se pudo realizar un análisis
estadístico.
El tratamiento en que hubo un porcentaje de sobrevivencia mayor fue el testigo de 0
ppm de AIB, y el menor porcentaje lo obtuvo el tratamiento con una concentración de
50 ppm de la hormona AIB.
Una de las razones de la muerte de las plantas en este ensayo se debió a que el
proceso de tindalización del sustrato no fue realizado de la manera adecuada, por lo
que al observar las plantas muertas se identificaron hongos causantes de la muerte.
Estos patógenos fueron Alternaria sp. y Fusarium sp.
El menor número de raíces promedio se dio en el tratamiento sin concentración de la
auxina AIB, y para la variable de longitud de raíz, este tratamiento se comportó de
forma similar al tratamiento de 50 ppm de AIB con una longitud de 2,1 y 2 cm,
respectivamente. El tratamiento con 25 ppm de AIB obtuvo en promedio una longitud
de 6,9 cm, siendo el tratamiento que mejor se comportó en relación a esta variable.
30
En cuanto a la altura de plántulas, el tratamiento de 50 ppm de AIB presentó una altura
mayor que los otros tratamientos, pero dada la baja sobrevivencia este valor no es
representativo.
La última variable evaluada fue el vigor de la planta, siendo el tratamiento de 25 ppm
que presenta un mayor rango promedio, esto significa que las plantas presentes en
este tratamiento fueron las más vigorosas tanto en la parte aérea como la radical.
CABRERA (1999) y SHEFFER (2002) demuestran que el AIA estimula la iniciación de
raíces en cortes de tallos (estacas); la auxina sintética (ANA) por lo común es más
eficaz que el AIA; el AIB se utiliza para causar la formación de raíces aun más a
menudo que ANA y que cualquier otra auxina.
SHEFFER (2002) indica que la solución debe ser en agua y no en alcohol, ya que el
alcohol puede causar toxicidad o quemaduras a la planta.
CUADRO 8
Resumen datos del ensayo de enraizamiento ex vitro.
TRATAMIENTO % Sobrevivencia N° Raíces Long. Raíces (cm) Altura (cm) Rango promedio Vigor/planta
16,7
3
2,1
4,5
2,8
0 ppm
8,3
4
6,9
5,8
4,5
25 ppm
2,8
5
2,0
9,7
3,0
50 ppm
Promedio
9,3
4
3,7
6,7
3,4
La capacidad de enraizamiento depende de la interacción de complejos factores
externos e internos, en algunas ocasiones la concentración endógena de auxinas en
algunas especies de plantas es suficientemente alta como para promover el
enraizamiento ex vitro. (Acuer-Matus, 2007; Perez et al 1999 citados por ROBLES,
2009).
3.3
Aclimatación. Las plantas obtenidas del proceso de enraizamiento in vitro
fueron evaluadas después del período de preaclimatación y aclimatación, presentando
en la primera etapa (preaclimatación) un bajo porcentaje de sobrevivencia en los dos
tratamientos. El tratamiento con sustrato de Perlita:Vermiculita presentó mayor
porcentaje de sobrevivencia en comparación con el tratamiento de Arena:Turba (51% y
42%, respectivamente). En cambio, en la segunda etapa (aclimatación) fue el
31
tratamiento de Arena:Turba el que presentó un porcentaje alto de sobrevivencia (95%).
El tratamiento de Perlita:Vermiculita presentó un porcentaje de sobrevivencia del 65%.
Las plantas obtenidas de la etapa de enraizamiento ex vitro, al ser llevadas al
invernadero para la etapa de aclimatación, dieron resultado negativo, ya que ninguna
de las plantas sobrevivió a la aclimatación.
CUADRO 9
Sobrevivencia a la preaclimatación y aclimatación de plantas
propagadas in vitro.
Arena:Turba
Preaclimatación Aclimatación
19 / 42
18 / 19
Plantas vivas
42
95
Sobrevivencia (%)
Perlita:Vermiculita
Preaclimatación Aclimatación
23 / 42
15 / 23
51
65
El bajo porcentaje sobrevivencia se debe a que las plantas deben adaptarse, de una
nutrición heterótrofa a una autótrofa. Aunque estas plantas habían desarrollado raíces,
deben desarrollar también brotes funcionales y aumentar la resistencia a la perdida de
agua y también al ataque de organismos patógenos (HARTMANN Y KESTER, 2002).
El drástico cambio de estado heterotrófico a autotrófico, como modo de nutrición, es
una de las etapas más críticas de la micropropagación, ya que podría causar en las
plantas serios daños fisiológicos. Es por esto, que en muchos casos la tasa de
crecimiento y sobrevivencia de las plantas es muy baja (DESJARDINS et al., 1987).
Otra causa es que las plantas in vitro poseen una alta tasa de transpiración, que
provoca una gran pérdida de agua, debido a que posee una delgada capa de cera
epicuticular y un anormal funcionamiento de los estomas. Este estrés hídrico es la
principal causa del problema del transplante (Sutter Y Langhans, 1979; Brainerd et al.,
1981; Sutter, 1988; Kosai, 1990ª citados por VEGA, 2009).
Las raíces formadas in vitro son poco funcionales, presentando epidermis no
suberizada y pocos pelos radicales, los que generalmente mueren postransplante y
deben ser regenerados. Esto trae como consecuencia que el ya mencionado pasaje de
32
una nutrición heterótrofa a una autótrofa, se vea dificultado o lento, con el consecuente
riesgo de pérdida de plantas (Gravina et al., 1995 citado por VEGA, 2009).
Además, se ha reportado que las raíces desarrolladas in vitro son extremadamente
frágiles y que, al ser colocadas en el sustrato, mueren (Bouthern Y Bron, 1994. citado
por VEGA, 2009).
POSPISILOVA et al. (1999), señalan que muchas plántulas mueren durante el período
de aclimatación y que necesitan una disminución gradual de la humedad del aire.
33
4 CONCLUSIONES
De acuerdo a los datos obtenidos en la presente investigación se concluye que se
acepta la primera hipótesis de que es posible enraizar in vitro brotes de R.canina, la
segunda hipótesis se rechaza, ya que no fue posible bajo las condiciones dadas lograr
el enraizamiento ex vitro de brotes de rosa mosqueta. Finalmente la tercera hipótesis de
que es factible la aclimatación en invernadero de brotes y plántulas micropropagadas de
esta especie se acepta parcialmente ya que no fue factible la aclimatación de los brotes
enraizados ex vitro.
El porcentaje de enraizamiento in vitro fue de un 100% en los tratamientos con auxinas,
independiente del tipo de auxina, y de las concentraciones usadas.
Con respecto a la variable altura de las plantas en la última fecha de evaluación, las 3
hormonas se comportaron de la misma manera, en cambio las concentraciones de 1 y 2
µM presentaron una mayor altura
Las plantas que fueron consideradas de mejor vigor en una escala numérica, fueron
encontradas en el tratamiento de ANA y la concentración de 2 µM.
Las plantas con mayor formación de callo fueron encontradas en el tratamiento con
ANA y con las concentraciones 1, 2, y 4 µM, mientras los tratamientos que presentaron
menor formación de callo fueron el tratamiento testigo y la hormona AIA.
Para el ensayo ex vitro no se pudo concluir cual fue el tratamiento mejor, ya que los
datos no pudieron ser analizados estadísticamente, debido a la baja sobrevivencia de
plantas en la etapa de enraizamiento.
34
En el proceso de preaclimatación para las plantas del ensayo in vitro, el tratamiento que
se comportó mejor, con un 51% de sobrevivencia fue el tratamiento con la mezcla de
arena: turba.
Finalmente, en la etapa de aclimatación en el invernadero, para el ensayo in vitro, el
tratamiento de arena:turba tuvo un mayor porcentaje de sobrevivencia llegando al 95%
de las plántulas llevadas a invernadero.
35
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40
6 ANEXOS
A continuación se presentarán algunas imágenes de las plántulas obtenidas en los
ensayos realizados.
41
ANEXO 1 Plántulas el día 90 D.D.I. del ensayo de enraizamiento
(Tratamiento con la hormona AIA).
Tratamiento Testigo
Tratamiento 2 µM AIA
Tratamiento 1 µM AIA
Tratamiento 4 µM AIA
in vitro
42
ANEXO 2
Plántulas el día 90 D.D.I. del ensayo de enraizamiento in vitro
(Tratamiento con la hormona AIB).
Tratamiento Testigo
Tratamiento 2 µM AIB
Tratamiento 1 µM AIB
Tratamiento 4 µM AIB
43
ANEXO 3
Plántulas el día 90 D.D.I. del ensayo de enraizamiento in vitro
(Tratamiento con la hormona ANA).
Tratamiento Testigo
Tratamiento 2 µM ANA
Tratamiento 1 µM ANA
Tratamiento 4 µM ANA
44
ANEXO 4
Agrupación de plántulas según escala numérica de vigor de planta.
45
ANEXO 5
Plantas después de la etapa de preaclimatación y plantas después
de 3 meses en invernadero.
46
ANEXO 6
Planta enraizamiento in vitro en el día 90.
47
ANEXO 7
Planta enraizamiento ex vitro en el día 30.