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Microbial. Kits para la detección
molecular de bacterias patógenas
14/02/2007
Kits de detección rápida de bacterias
patógenas para el laboratorio de
Microbiología
Salmofast | Legiofast | Listerfast
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1
2
Publicaciones científicas PCR
Agua
Artículos científicos
Alimentos
Año
Los Kits de Microbial
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Ventas equipos PCR
800
756
700
Millones €
600
500
400
300
252
200
100
0
2001
2005
Año
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¿Qué ventajas inmediatas ofrece la PCR?
† La identificación por PCR de bacterias en
muestras ambientales, alimentarias o clínicas
ofrece una mejora sustancial en tres aspectos
clave para muchos laboratorios.
„ Mayor rapidez: se puede realizar una determinación
en un tiempo inferior a 4-5 horas.
„ Mayor especificidad: especialmente si los genes
diana se eligen con los criterios científicos
adecuados.
„ Una sustancial disminución del coste del análisis.
† Todo ello con niveles de sensibilidad y
reproducibilidad excelentes.
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¿Por qué implantar la técnica de PCR?
† Supone una mejora sustancial en:
„ Especificidad
„ Tiempo por reacción
„ Productividad (coste-efectivia),
„ multiplicándose la capacidad de análisis de cualquier
laboratorio
„ optimizando los recursos humanos, materiales y
temporales.
† Usar la PCR, tanto convencional como a tiempo
real, para la detección de microorganismos es
entrar en una nueva era en el campo de los
análisis microbiológicos.
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Los componentes
† Paso previo: extracción de DNA
† Cebadores
„ Gen diana
„ Fragmento quimérico IAC
† Sondas Taqman® (diana y IAC)
„ “Quencher”: TAMRA
„ “Reporter”: FAM (Detección), VIC (IAC)
† Tampón específico per a PCR a temps real
† IAC
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Concenteración de ADN (ng/ml)
Extracción de DNA
Método de extracción
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Características del gen diana
†
†
†
†
†
Gen funcional
Expresión basal (sempre actiu)
Una sola copia por genoma
Altamente específico
Conservado (no dianas “móviles”)
Los competidores: genes de virulencia
„ invA, hyl, mip, dotA, etc…
„ Genes con altas tasas de variación (mutaciones)
„ Variación: importante en la historia natural del
organismo
•Salmofast, Legiofast, Listerfast : Gen regulatorio
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Gen diana para Legionella.
Patente Europea: EP 05110953.6
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Detección de Salmonella
Salmofast
IAC
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Ensayo de especificidad (>105 copias)
Salmofast
Otros
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Estudio de validación
Type of
sample
Total nº
of
samples
Traditional culture
(ISO 6579)
Nº of Θ
Nº of ⊕
samples
samples
6
9
5
5
15
11
bipA-based PCR
Specificity
(%)
Accuracy
(%)
100
100
100
100
100
100
100
100
100
0
100
100
100
0
100
100
100
0
100
100
100
0
100
100
100
Nº of false
⊕ samples
0
0
0
Fish
Egg
Meat
Dairy
products
Prepared
food
Water
15
10
26
9
11
0
26
8
18
0
23
14
9
0
TOTAL
120
57
63
0
20
Sensitivity
(%)
Nº of false
Θ samples
0
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IAC (Internal Amplification Control)
† Secuencia quimérica de nuevo diseño
„
„
„
„
Única (no repetida en la Naturaleza)
No “cross-contamination”
Cebadores específicos con Tm idéntica a Salmofast
Sonda Taqman TAMRA-VIC
† Añadida a la reacción a bajo número de copias
„ No interferencia
„ No competencia
† Indicador de negativo
† Con positivos clars: IAC no necesario
„
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Ct-salmofast < 24 → Ct-IAC augmenta
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Interpretación de los resultados
† Procedimiento analítico
„ Pre-enriquecimiento de la muestra “overnight” 37ºC
„ Tg = 30 min; 30 duplicacions
1 ufc/ml > 109 ufc/ml (230)
(normalmente inferior)
† Extracción ADN
† Dilución
† PCR tiempo real:
Salmofast
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Super-positivo
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Super-positiu
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Positivo claro
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Positivo claro
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Negativo
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Negatiu
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Duplicats mostres reals
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Lectura de resultados
Curva IAC
Sigmoidal?
Si
No
Ct(IAC) ~ 28-29
Ct (Salmofast) <34
Positivo
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Ct(IAC) > 28-29
Ct (Salmofast) > 34
Ct (Salmofast) < 25
Salmofast
sigmoidal
Salmofast
lineal
Positivo
Negativo
Positivo
Ct (Salmofast) < 25
Ct (Salmofast) > 32
Positivo
Inhibició
Ct (Salmofast) > 25
Fluorescència
> 1/3 del C+
Fluorescència
< 1/3 del C+
Positivo
Negativo
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Cuantificación. Recta patrón
Copias por reacción
106
105
104
103
102
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Cuantificación. Recta patrón
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Cuantificación. Recta patrón
25
20
15
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Diluciones del extracto de ADN genómico
† Extracto directo: puede presentar problemas
„ Demasiado ADN genòmic (otras bacterias)
„ Inhibidores
† Diluciones hasta a 1/1000
„ Asumimos:
† 100 cèls/reacció (dilució 1/1000) = 105 cels/ml
enriquecimiento
† Si está presente, Salmonella en enriquecimiento > 105
cels/ml
† Dilución recomendada: 1/10 ó 1/100,
dependiendo de la matriz analizada (tipo de
alimento)
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Caso real
† Muestra: Carne de pollo
† Ejercicio intercomparación
„ Cultivo: negativo
„ Salmofast: positivo
† Explicación
„ Muestra “preparada” con enterobacterias
interferentes
„ Pre-enriquecimiento: Interferente supera a
Salmonella
„ Placa: No detección de Salmonella
„ Capacidad de seleccíón de PCR muy superior al
cultivo en placa
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Ct vs. Posición
29-30
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Estudio de validación
Protocolo de validación de un método alternativo
basado en la PCR-tr para la detección de Legionella
pneumophila en aguas
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OBJETIVOS
† PRINCIPALES:
„ Establecer el protocolo para validar un método
alternativo a la ISO 11731:1998 para la detección de
Legionella pneumophila
„ Cálculo parámetros de validación (Técnica de
Duplicados frente a la ISO 11731:1998)
„ Sensibilidad
„ Especificidad
„ Eficiencia
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OBJETIVOS
† SECUNDARIOS:
„ Definición del método:
† Preparación de las muestras para el ensayo:
concentración de 1l en 1 ml por doble
centrifugación
† Extracción ADN: Nucleospin®Tissue
† Condiciones de PCR:
„ Diseño “primers” de genes funcionales (no
ribosomales ni inducibles)
„ Especificidad de los “primers” (inclusividad;
exclusividad)
„ Linealidad, sensibilidad de la PCR a tiempo real
„ Control interno
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Condiciones de PCR: diseño de “primers”
† Características del gen diana:
„ Expresión no ligada a un estado virulento transitorio
(ex. gen mip)
„ Secuencia específica de Legionella pneumophila:
Especificidad reforzada con sonda interna
† Inclusividad: TODOS los serogrupos de L. pneumophila
† Exclusividad: Especies de Legionella no pneumophila
otros microorganismos conocidos (GenBank)
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Organismos utilizados
Organismo
Legionella pneumophila SG01
Legionella pneumophila SG02
Legionella pneumophila SG03
Legionella pneumophila SG04
Legionella pneumophila SG05
Legionella pneumophila SG06
Legionella pneumophila SG07
Legionella pneumophila SG08
Legionella pneumophila SG09
Legionella pneumophila SG10
Legionella pneumophila SG11
Legionella pneumophila SG12
Legionella pneumophila SG13
Legionella pneumophila SG14
Legionella pneumophila SG15
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Resultado
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Organismo
Legionella oakridgensis
Legionella fairfieldensis
Legionella jordanis
Legionella wadsworthii
Legionella feelei
Legionella gormanii
Legionella anisa
Legionella bozemanae
Legionella longbeacheae
Legionella micdadei
Arthrobacter VP1
Bacillus cereus
Bacillus subtilis
Citrobacter sp.
Enterobacter aerogenes
Enterococcus faecalis
Methylophilus methylotrophus
Micrococcus luteus
Proteus mirabilis
Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas fluorescens
Salmonella LT2
Shigella sonnei
Shigella spp.
Staphylococcus epidermidis
Resultado
-
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Prova d’especificitat: inclusivitat; exclusivitat
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Recta patrón
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Condiciones de PCR: linealidad y sensibilidad
Sensibilidad de la reacción de PCR tr: 5 copias/reacción
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VALIDACIÓN L. pneumophila PARA PCR tr
† PROTOCOLO DE VALIDACIÓN (I)
„
Requisitos de validación:
†
†
†
†
„
sensibilidad (porcentage de positivos correctamente
asignados por el método alternativo) >90%
especificidad (porcentage de muestras negativas
correctamente asignades per el método alternativo) >90%
eficiencia (porcentage de muestras correctamente asignadas
por el método alternativo)>90%
Límite de detección <100 ufc/l
Técnica de Duplicados: Aplicación del método alternativo
(PCRtr) y el método de referencia (ISO 11731:1998) a las
mismas muestras y comparar los resultados
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ISO 11731:1998
0,1 ml
Siembra
GVPC agar
Muestra real en placa
20 ml
GVPC
2 ml
1l
5 ml
Tratamientos
Calor / Ácido
Sembra
GVPC agar
0,1 ml
PRESENCIA
AUSENCIA
3 ml
Real Time PCR
50 µl
EXTRACCIÓN
ADN:
NUCLEOSPIN®TISSUE
1l
7 ml
Hasta 20 µl/reacción
≡ 400 ml muestra
1 ml
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ISO 11731:1998
† Recuento en placa:
„ Viables cultivables
„ Confirmación submuestra (colonias sospechosas en
placa)
„ Subjectividad operador
Real Time PCR
† PCRtr
„ Viables y no viables
„ Identificación hasta un 40%
de la muestra en su totalitat
„ Detector instrumental
Mx3005P™ QPCR Systems de Stratagene
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Preparación de las muestras para ensayo
† PROTOCOLO DE VALIDACIÓN II
„ Muestras:
† Número de muestras
„
„
Mínimo 20 positivas
Mínimo 20 negativas
† Tipo de muestras
„
„
„
Agua de red (grifos, duchas, etc.)
Torres de refrigeración
Acumuladores
„ Técnica de validación
† Aplicación del método alternativ (PCRtr) y el método
de referencia (ISO 11731:1998) a las mismas muestras
y comparar resultados
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Resultados: muestras ambientales
†Condiciones PCR:
„50 ciclos
„VADNmuestra=1 µl/Vreacción PCR 20 µl
„Temp apareamiento primers: 61ºC
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Conclusiones
† Gen diana elegido: específico y muy
conservado en L. pneumophila
† Condiciones de PCR (volumen ADN en reacció
mejorable hasta 25x)
† Pendient evaluación rendimiento proceso
concentración muestra y extracción ADN
† Perspectivas detección viables:
„ Acoplamiento PCRtr con paso previo de RT-PCR
(RNA->DNA)
† Mejorar exclusividad L. no pneumophila:
„ Pureza extracto
„ Temperatura apareamiento cebadores
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Kits de PCR (I)
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Kits de PCR (II)
† Mayoría: genes funcionals
† Variabilidad genética: mutaciones silenciosas.
Codigo genético degenerado
† “Missmatches” posibles cada 3 bases: 7 en un
21mer
† Selección de la diana: Paso crítico
„ Una sola copia
„ Conservación genética
„ Expresión mantenida
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Información al microbiólogo
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¿Por qué confiar en Microbial SL?
† Microbial SL es una empresa biotecnológica dedicada
exclusivamente a la investigación, desarrollo y
producción de kits para la detección de bacterias
patógenas mediante PCR. Poseemos una amplia
experiencia en la identificación de dianas genéticas y el
diseño de herramientas moleculares para su detección.
† En Microbial SL hemos apostado por la calidad desde el
principio. Nuestros sistemas de análisis se basan en años
de investigación rigurosa y en la aplicación de un
fundamento racional a las características y condiciones
que debe cumplir el gen diana, que ha sido patentado.
Esto nos ha permitido poner a la disposición de nuestros
clientes un producto que va unos cuantos pasos por
delante del resto del mercado. En este sentido, nuestros
kits son más fiables y robustos, presentando niveles
inmejorables de especificidad y sensibilidad.
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¿Qué garantías me ofrecen?
† Todos nuestros productos se han sometido a
validación por un laboratorio acreditado en
análisis microbiológico por PCR.
† Microbial SL ha desarrollado sus sistemas de
análisis por PCR teniendo en mente las
necesidades de los laboratorios ofreciendo
soluciones para poder realizar varios análisis en
un mismo programa de termociclador.
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¿A quien van dirigidos los kits de Microbial SL?
† Los Kits de PCR de Microbial SL van dirigidos
fundamentalmente a los laboratorios de
análisis microbiológicos que necesiten realizar
un elevado número de análisis al año con un
alto grado de satisfacción y de productividad.
† Importante!!: Nuestros productos son ideales
para afrontar procesos de acreditación del
método por PCR frente a los métodos estándar
ya normalizados.
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Somos “diferentes”
3
†
3
†
3
†
3
†
Fiabilidad
Sensibilidad
Robustez
Calidad
3
†
3
†
3
†
3
†
3
†
3
†
Diana genética conservada
Trato directo
Asesoramiento
Confianza
Proximidad
Disponibilidad
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Y además…
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Dificultades de uso
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El reto
¿Alguien se apunta?
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