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Temario
Biotecnologías de la
reproducción de tercera
generación: división y sexaje
de embriones.
Nuevas oportunidades
A lo largo de los últimos años asistimos
a un rápido desarrollo de las técnicas de
reprodución, las cuales alcanzan mayor
repercusión en el campo a medida que
se logran avances que hacen su uso más
fácil, mejoran los resultados y se abaratan
los costes de su aplicación. Este puede ser
el caso del diagnóstico del sexo del embrión, donde una nueva técnica de reciente aparición ofrece ventajas de
portabilidad, rapidez y mayor posibilidad
de aplicación directamente en las ganaderías.
los equipamientos necesarios así como
por la complejidad y el tiempo necesario
para realizar cada determinación, además de suponer una merma de la fertilidad.
La situación hoy puede ser un poco diferente. En primer lugar el uso de la transferencia embrionaria está muy consolidada en un número importante de ganaderías, teniendo en cuenta que durante este
año esperamos el nacimiento de una
hembra de embrión al día en Galicia tras
la transferencia de 1.5000 embriones du-
Biotecnologias de la reproducción. Evolución
GENERACION
PRIMERA: 1908
SEGUNDA: 1970
TERCERA: 1980
Inseminación artificial
Control hormonal de la ovulación
Transferencia de embriones, congelación, división
Sexaje de semen y de embriones
Fecundación in vitro
CUARTA: 1990
Clonación con células somáticas
QUINTA: 2000
Transgénesis, gene farming, celulas madre
Daniel Martínez con John Hasler, uno de
los pioneros de la transferencia
embrionaria, que hizo de instructor en
micromanipulación y sexaje por PCR en
el centro de Bioniche en Pullman,
Washington (EEUU)
Desarrollo generacional de la biotecnología de la reproducción, modificado de Thibier, 1990 (Biotecnología de la Reproducción, Gustavo A Palma, segunda edición).
Cada generación de la biotecnolgía necesita de la consolidación y uso rutinario de
la generación precedente para poder alcanzar un nivel de uso importante a nivel de
campo.
Desde las primeras experiencias que
realizamos en Transferencia Embrionaria la
pregunta que sin duda escuchamos mas
veces es la de si podemos diferenciar y escoger los machos de las hembras. Esta es
una cuestión por la que todos los ganaderos con los que trabajamos, ha mostrado curiosidad en un momento u otro.
Hasta ahora se trataba de una técnica inaccesible especialmente por el coste de
rante 2008 y paralelamente los avances
en la técnica de sexaje la hicieron algo
mas asequible tanto por el coste de los
materiales como en el tiempo que se necesita para cada análisis. En noviembre
pasado se publicaba un nuevo método
de diagnóstico del sexo del embrión en
ganado vacuno en Estados Unidos, y tuvimos la oportunidad de conocerlo de la
mano de sus creadores.
Daniel Martínez Bello. Veterinario. Director Técnico de la U.T.E. de
Bos-Fefriga.
Instalaciones de BIOTECH-Minitub of
América, en Verona-Wisconsin, donde se
desarrolló el kit de sexaje embrionaria
para fluorescencia “Sex-y kit” Minitub®.
() Micromanipulador Twinner System.
() Detalle de la cuchilla del micromanipulador. Con esta
pieza podemos dividir el embrión en dos partes iguales u
obtener una porción de células que sirve como
biopsia para realizar análisis.
LA MICROMANIPULACIÓN.
CARACTERÍSTICAS Y POSIBILIDADES
El primer paso en la determinación del
sexo necesita inevitablemente de la micromanipulación del embrión: aplicándola podemos dividir un embrión en dos
mitades o bien obtener un pedazo del
mismo que servirá como biopsia para
analizar y diagnosticar el sexo u otras cualidades de los genes que interese determinar (diagnóstico preimplantacional).
Los aparatos que se emplean son múltiples, desde más rudimentarios y básicos
hasta complejos y sofisticados y de alto
coste.
Existe una opción muy práctica, económica, y de uso posible a nivel de
campo que es el “Twiner System”, de Bioniche. Fue diseñado inicialmente para dividir el embrión en dos mitades idénticas
y consiste en un microscopio invertido con
un micromanipulador mecánico de tres
ejes, cada uno con su motor, que se controlan desde un mando tipo “joystick”,
desde el que se mueve una pequeña cuchilla colocada en el soporte del micro-
manipulador. De esta forma puede controlarse el movimiento de la microcuchilla
en todas las direcciones con precisión absoluta.
DIVISIÓN EMBRIONARIA (splitting)
La primera dificultad que surge a la
hora de cortar un embrión es que éste es
esférico y muy resbaladizo, por lo que necesitamos fijarlo de algún modo. La manera mas práctica de inmovilizarlo es
ponerlo en un medio especial (splitting
medium) que hace que el embrión se
pegue al fondo e inmediatamente se procede a cortarlo (básicamente es una solución de PBS sin proteínas ni surfactantes
de ningún tipo). Para retirarlo hay que
añadir de nuevo el medio que habitualmente mantiene a los embriones para rehidratarlos y poder manipularlos y desde
donde deben ser transferidos lo antes posible en la receptora o receptoras: independientemente cada mitad en una
receptora o bien las dos mitades juntas
en una misma novilla. Este proceso conduce al nacimiento de animales identi-
cos, del mismo sexo, sin ningún riesgo de
freemartinismo, aunque pueden tener alguna diferencia pequeña en la capa (en
la distribución de las manchas) debido a
efectos epigenéticos, pero básicamente
son idénticos y capaces de transmitir las
mismas características a su descendencia. Las mitades de embrión solamente
pueden transferirse en fresco y alcanzan
el 50-55% de preñez lo que se traduce en
un aumento del número de crías que
puede llegar hasta el 40%, naciendo en
ocasiones más animales que embriones
de partida, y como mínimo podemos
contar con el mismo número de crías que
embriones teníamos al principio.
La mayor aplicación de esta técnica
se da en nuestra opinión en el caso de
vacas que producen bajo número de embriones cada vez: sólo 1 ó 2, y teniendo
ese día más receptoras disponibles, o
bien, vacas con producciones moderadas de en torno a 6 embriones, en el caso
de vender por ejemplo 4 e intentar sacarles el máximo partido los 2 que guardemos para nuestra ganadería.
() Manejo del micromanipulador.
Usando el joystick se mueve la cuchilla
(en la pantalla) hasta encima del embrión y se procede a su corte.
() Detalle del corte de un embrión
en dos mitades (splitting)
Porcentajes de preñez de embriones bovinos in vivo FRESCOS
intactos (703) vs biopsiados (341)
80
70
b
60
50
a
Porcentaje de preñez en novillas (n=585) y vacas (291)
transferidas con embriones congelados (EG, in vivo)
intactos vs biopsiados
80
70
Novillas
60
50
66%
40
30
40
30
20
20
10
0
10
0
M
(Hasler et al., 2002)
EB
MB
XB
Estado del embrión
a, b
P<0,02
Total
Biopsiado
BIOPSIADO DEL EMBRION
La siguiente posibilidad que nos
ofrece la micromanipulación, es obtener
una porción de células que constituye
una biopsia.
Hay datos publicados ya desde el año
2000 de uso rutinario de sexaje mediante
biopsia de embriones por el método de
corte y posterior análisis por PCR (polimerase Chain reaction).
Es un método relativamente reciente
pero ya suficientemente contrastado. El
corte causa un daño al embrión que reduce su viabilidad pero el resultado en
preñeces es muy satisfactorio. Para obtener un éxito importante hay que respetar
dos premisas fundamentales: utilizar exclusivamente embriones de primera calidad, y reducir al mínimo el tiempo de
manipulación del embrión: después de
cortarlo debe ser transferido rápidamente
(mejor antes de 1 hora), y muy especialmente en el caso de congelarlo en que
debe hacerse de modo inmediato. Según
datos facilitados por John Hasler los embriones bipsiados (sexados) frente a intactos pierden entre el 8 y el 10% de
fertilidad cuando se transfiren enseguida
y en fresco. Hasta el momento no disponemos de datos propios ya que es una
técnica que aplicaremos en los próximos
meses en nuestro servicio de transferencia
Intacto
Vacas
48%
b
44%
a
22%
M
EB
(Hasler et al., 2002)
embrionaria en las ganaderías.
En el caso de la congelación en EG,
que es la que utilizamos de rutina ya que
permite la descongelación y transferencia directa, debemos contar con un 15%
de reducción de la fertilidad si bien trabajando en buenas condiciones y reservando las mejores receptoras para estos
embriones Roger Holtby, de Canadá dispone de datos en los que muestra un 53%
de preñez de embriones sexados congelados, transferidos en novillas.
DETERMINACIÓN DEL SEXO DEL EMBRIÓN
En cualquier caso, una vez obtenida
la biopsia hay que analizarla y aquí empieza otro capítulo de esta técnica. Todas
las células contienen ADN, y hasta ahora
lo que se hacía comunmente era analizarlo mediante PCR (polimerasa chain reaction). Esto necesita una cantidad
importante de equipos de laboratorio de
gran precisión, delicado mantenimiento,
a, b
MB
XB
Total [h]
Estado del embrión
Total [c]
P<0,005
Intacto
Biopsiado
y muy costosos, con un material fungible
también costoso y de difícil manejo debido a su conservación exclusivamente
congelado, etc. Además necesita una
habitación o local dedicado exclusivamente a este fin para reducir el riesgo de
contaminaciones con ADN bovino distinto
el de la muestra que queremos analizar. El
proceso tarda alrededor de 3 horas (incluyendo preparativos), y es muy difícil de
realizar en las ganaderías con suficientes
garantías. Uno de los paises donde mas se
usa es Canadá y la rutina establecida por
muchos grupos es obtener la muestra en
la granja, procesarla de regreso en la clínica veterinaria para ofrecer los resultados
al dia siguiente y administrar prostaglandina a las receptoras portadoras de embrión macho. Y todo teniendo en cuenta
fiabilidades del 90 al 95% como máximo.
Estas características hicieron que mantuviésemos esta tecnología fuera de los servicios ofrecidos desde U.T.E Bos.
Efecto de la técnica empleada para la biopsia en la tasa de gestación tras la
transferencia de embriones producidos In Vitro.
Nº transferencias
% preñez
Microcuchilla*
Técnica de Biopsia
276
66a
Eficiencia de la PCR
96c
Aspiración**
216
45b
85d
(Carbonneau et al., 1997) *Nota: embriones D-7 cultivados 3-5 h tras la biopsia;
** embriones de D-5 cultivados 48 h tras la biopsia. abP<0.01; cdP<0.001
Detalle de la obtención de la biopsia por el método de corte.
La porción de células separadas del embrión se recoge con
micropipetas y se procesa de diferentes modos según el tipo
de análisis al que se va a someter.
Detalle de obtención de biopsia por el método de aspiración.
Este método necesita dos micromanipuladores, y material
mas sofisticado.
La novedad en la detección del sexo fue
la reciente presentación comercial de un
kit algo mas sencillo, que evita por completo el uso de la PCR. Investigadores de
Biotech (Minitub of América) desarrollaron
un marcador del cromosoma Y de los machos que puede verse directamente
usando un microscopio con fluorescencia. Está disponible comercialmente en
envases de tipo kit rápido con presentación para 10 muestras por caja. Todos los
pasos del procesado de la muestra
suman menos de 1 hora, y parece perfectamente factible a nivel de campo pudiendo conocer el sexo del embrión antes
de transferirlo o congelarlo. El diagnóstico
mediante observación necesita un cierto
entrenamiento y dominio de las técnicas
de fluorescencia a parte del microscopio
adecuado y se tardan de 2 a 5 minutos
por muestra. Si la biopsia contiene de 6 a
10 células la fiabilidad podría considerarse
óptima, siempre y cuando el procesamiento haya sido realizado correctamente.
Una vez que dispongamos de la tecnología necesaria tenemos todavía que
decidir sí nos conviene o no hacerlo y en
que casos. Las ventajas están claras: en el
caso del ganadero de frisón la primera
ventaja es librarse de los machos no deseados, aprovechamos mejor las receptoras, y logramos conseguir mas hembras
de T.E. por año. Estos atractivos pueden
ocultar los inconvenientes y también es
preciso conocerlos para dirigir bien su uso
ya que se da una reducción leve de la
fertilidad que si bien permite trabajar también representa una merma con su coste
aparejado. Por este motivo aunque aparentemente nacerán más hembras, de
modo global y desde el punto de vista de
un programa de transferencia, serán
menos. Por otra parte los embriones biopsiados (sexados), debido la ruptura de la
Zona Pelúcida, no son aptos para comercio internacional ni intracomunitario. Lógicamente incrementa algo el coste de
producción en cuanto a que precisa materiales específicos y un tiempo importante de prepartivos y ejecución. Al
eliminar los machos reducimos los embriones disponibles e incluso puede conducir
a situaciones de gasto sin fruto al igual
que cuando se superovula una vaca y no
produce embriones, en este caso tendremos también las que se tratan y no nos
dan hembras. En realidad estos casos ya
se dan y simplemente tardamos mucho
más tiempo en enterarnos.
Por todas estas características consideramos que el sexaje de embriones tiene
un espacio muy concreto para usar en
unas condiciones muy determinadas. El
uso preferente de esta tecnología está indicado para explotaciones con experiencia en transferencia embrionaria con
resultados aceptables, solo en vacas o
cruces en que los machos no tengan posibilidad de ser aceptados en un centro
de inseminación y además produzcan
muchos embriones cada vez (más de 10 ó
12) y especialmente en el caso de que es-
Representación esquemática del procesamiento de una biopsia para poder
evaluarla mediante microscopia de ultrafluoresecencia y determinar el sexo.
Localizar la biopsia en el
centro del círculo
Introducir el
porta en fijador
durante 5 min.
y luego escurrir
y dejar secar
completamente
Secar al aire y marcar la
posición de la biopsia
60ºC durante 1 min.
Cubrir la biopsia con
una gota de solución
Buffer 1 durante
20 segundos
Llenar el círculo con solución Boffuer 2.
Escurrir y volver a llenar.
Esperar 2
Escurrir y llenar con la
solución Sex-Y probe.
Incubar a 40ºC durante
25 min.
Escurrir y llenar con
solución Buffer 2. Esperar
5 min. y repetir
Escurrir y poner una gota
de medio de montaje
sobre el área marcada
Poner el cubre objetos
en el disco y observar al
microscopio
R
E
S
U
L
T
A
D
O
S
Resultados. Imágenes después de la tinción de células embrionarias bovinas
con Kit Sex-Y
Células embrionarias macho con
núcleo marcado con SEX -YTM
Núcleo de células con ADN
marcado con tinción DAPI
Células embrionarias hembra sin
reacción específica al SEX -YTM
Núcleo de células con ADN
marcado con tinción DAPI
Comparación de las imágenes de fluorescencia de las muestras macho y hembra.
Cada muestra debe examinarse con el filtro azul para comprobar la correcta tinción del ADN (filtro DAPI). Con el filtro rojo se aprecian puntos brillantes correspondientes al cromosoma Y exclusivamente presentes en los machos. Este método
diagnóstico precisa de un observador experimentado y cada muestra hay que
observarla durante 2 minutos como mínimo.
caseen las receptoras, lo cual es muy frecuente. Apoyan esta tesis los datos de
Canadá donde recogen la actividad de
sexaje y splitting desde el año 2000. Los ultimos datos disponibles (www.ceta.ca)
son de 2007 en el que 2.500 embriones
fueron transferidos ya sexados, el doble
frescos que congelados. Son cifras importantes que se mantienen durante los ultimos años pero que representan sola-
mente el 3,5 % de la producción de embriones canadiense, lo que podemos interpretar como signo de que es algo que
se hace pero en una medida muy concreta. Y lo mismo podemos decir respeto
la división de los embriones que es una
práctica en vigor y con uso cotidiano,
pero que en Canadá representa el 1,5%
de la producción.