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Diagnóstico Molecular de Plagas
en la UCDSV mediante la PCR
Laboratorio de Biología Molecular
Dra. Ida Bartolini
Blgo. Arturo Olórtegui
El laboratorio de Biología Molecular constituye un apoyo muy
importante
para
los
distintos
laboratorios
de
la
UCDSV
y
continuamente implementa, capacita y transfiere los métodos de
diagnóstico molecular del tipo PCR a los laboratorios para su ejecución.
Viroide de la Mancha Solar del Palto
“Sunblotch” (ASBVd)
Virus de la Leprosis de los
Citricos (CiLV)
Virus del Falso Amarilleo del
melón (BPYV)
Viroide del Tubérculo ahusado de la
papa (PSTVd)
Virus del Mosaico de la Bractea del
Banano (BBrMV)
Viroide de Exocortis de
los Cítricos (CEVd)
Virus del Cogollo Racimoso del
Banano (BBTV)
Fitoplasmas en diversos cultivos
Viroide de la Cachexia de los
Cítricos, (CCaVd)
Virus del Tristeza de los
Cítricos (CTV)
Virus del Mosaico del
Pepino (CMV)
Virus del Pallidosis de la
Fresa (SPaV)
Xylella fastidiosa (Clorosis Variegada
de los Cítricos, CVC)
Candidatus liberobacter (Huan Long Bing de
los Cítricos, HLB)
PORQUE SON IMPORTANTES LOS METODOS
MOLECULARES BASADOS EN LA PCR?
• son muy específicos porque están
basados en la secuencia genética del
agente infeccioso
• son muy sensibles porque replican
millones de veces la secuencia del
patógeno de interés
• son muy versátiles porque se aplican a
todas las áreas biológicas
• son muy rápidos
EN QUE CONSISTE LA PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa)?
Extracción de
ácidos nucleicos
ADN/ARN
Muestra
FASES de la
PCR :
1.- DENATURACION
Termociclador
Separación de
las hebras
(94°C)
2.- ANILLAMIENTO
Unión de los
primers al ADN
(52-62°C)
El Proceso de la PCR se
puede comparar al trabajo de
una
fotocopiadora
que
obtiene millones de copias
por hora
3.- EXTENSION
Duplicación del
número de copias
(72 °C)
METODOLOGIA DE LAS TECNICAS MOLECULARES DE PCR
Selección y Extracción de ácidos nucleicos (ADN/ARN)
Pre - PCR
PCR
Toma y envío
de muestras
Post- PCR: Análisis de resultados
Usuario
H 2O
PCR tiempo real
Control -
+
Control
Man
GeP
GeVds
NaH3
LiP2
LiP1
100bp
PCR convencional
ASBVd
SANO
Envío de muestras:
• Tomar las muestras, envolverlas en papel toalla y colocarlas
dentro de bolsas debidamente rotuladas
• Tratar de enviar las muestras el mismo día de la toma.
En caso contrario refrigerarlas pero nunca congelarlas.
congelarlas
• Enviar las muestras en una caja que las proteja de los
golpes, se puede colocar un gel refrigerante envuelto en
papel toalla, teniendo cuidado de no humedecerlas.
• Que el tiempo de envío sea de 1 a 2 días
Causales de rechazo:
• No cumplir con la calidad y cantidad indicada en
el Instructivo de Trabajo
• Tejidos necróticos.
• Tejidos en mal estado de conservación.
• Tejidos con demasiado tiempo de haber sido colectados.
Calidad de material vegetal correcto
para diagnostico molecular
Material vegetal degradado
que será rechazado
Material fresco y turgente
Con síntomas (en lo posible)
No se recibirá material marchito,
en descomposición, o desecado
Servicios de Diagnóstico Molecular ofrecidos por el SENASA:
LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA:
LABORATORIO DE VIROLOGÍA:
Candidatus liberobacter en Cítricos (HLB) con PCR
Viroide del “Sunblotch” Mancha Solar del Palto
1 tiempo real
20 (ASBVd) con RT-PCR tiempo real
Candidatus liberobacter (HLB) en Diaphorina citri con
Viroide del Tubérculo Ahusado de la Papa(PSTVd) con
2 PCR tiempo real
21 RT-PCR convencional
Xyllela fastidiosa en Cítricos (CVC) con PCR tiempo
Viroide del Exocortis de los Cítricos (CEVd) con
3 real
22 RT-PCR convencional
Xyllela fastidiosa en Vid (enfermedad de Pierce) con PCR
Viroide de la Cachexia de los Cítricos (CCaVd) con
tiempo
real
4
23 RT-PCR convencional
Virus del Mosaico de la Bráctea del Banano (BBrMV)
5 Spiroplasma citri con PCR tiempo real
24 con RT-PCR tiempo real
6 Burkholderia glumae con PCR tiempo real
Virus del Cogollo Racimoso del Banano (BBTV) con
7 Burkholderia gladioli con PCR tiempo real
PCR tiempo real
25
8 Fitoplasmas en general con PCR tiempo real
Virus de la Tristeza de los Cítricos (CTV) con RT-PCR
9 Fitoplasma "Flavescence Dore" con PCR tiempo real
26 convencional
10 Fitoplasma "Bois Noir" con PCR tiempo real
Virus de la Pallidosis de la Fresa (SPaV) con RT-PCR
27 convencional
LABORATORIO DE MICOLOGÍA:
Virus del Falso Amarilleo de la Remolacha (BPYV) con
Fusarium oxysporum f. sp cubense raza 4 Tropical con
28 RT-PCR convencional
11 PCR convencional
Virus del Mosaico del Pepino (CMV) con RT-PCR
Guignardia
citricarpa
con
PCR
convencional
12
29 convencional
13 Phaeoacremonium sp. con PCR convencional
Virus de la Leprosis de los Citricos (CiLV) con RT-PCR
14 Phaeoacremonium aleophilum con PCR en tiempo real
30 tiempo real
Virus de Psorosis de los citricos (CPsV) con RT-PCR
15 Phaeoacremonium viticola con PCR en tiempo real
31 tiempo real
16 Phaeoacremonium parasiticum con PCR en tiempo real
17 Phaeoacremonium mortoniae con PCR en tiempo real
LABORATORIO DE ENTOMOLOGÍA:
18 Phakopsora pachyrhizi con PCR en tiempo real
19 Phakopsora meibomiae con PCR en tiempo real
32 Planococcus ficus con PCR convencional
Guía 2014:
Guía 2012:
UNIDAD DEL CENTRO DE DIAGNÓSTICO DE SANIDAD VEGETAL
GUÍA DE SERVICIOS DE DIAGNÓSTICO DE PLAGAS
N°
Denominación del servicio
1. LABORATORIO DE ENTOMOLOGÍA:
1.01 Identificación morfológica de insectos en semillas
1.02 Identificación morfológica de insectos en vegetales con uso de preparaciones no microscópicas
1.03 Identificación morfológica de insectos en vegetales con uso de preparaciones microscópicas
1.04 Curso de identificación taxonómica de insectos
1.05 Diagnóstico molecular de Planococcus ficus con PCR convencional
2. LABORATORIO DE MICOLOGÍA:
2.01 Diagnóstico micológico en semillas con uso de medios de cultivo
2.02 Diagnóstico micológico en plantas con uso de medios de cultivos específicos
2.03 Diagnóstico micológico en órganos aéreos o subterráneos con uso de medios de cultivo específicos
2.04 Diagnóstico micológico en turba y suelo con uso de medios de cultivo
2.05 Curso de capacitación en diagnóstico de hongos fitopatógenas en material vegetal
2.06 Diagnòstico molecular de Fusarium oxysporum f. sp cubense raza 4 Tropical con PCR convencional
2.07 Diagnóstico molecular de Guignardia citricarpa con PCR convencional
2.08 Diagnóstico molecular de Phaeoacremonium sp. con PCR convencional
2.09 Diagnóstico molecular de Phaeoacremonium aleophilum con PCR en tiempo real con Sonda
2.10 Diagnóstico molecular de Phaeoacremonium viticola con PCR en tiempo real con Sonda
2.11 Diagnóstico molecular de Phaeoacremonium parasiticum con PCR en tiempo real con Sonda
2.12 Diagnóstico molecular de Phaeoacremonium mortoniae con PCR en tiempo real con Sonda
2.13 Diagnóstico molecular de Phakopsora pachyrhizi con PCR en tiempo real con Sonda
2.14 Diagnóstico molecular de Phakopsora meibomiae con PCR en tiempo real con Sonda
3. LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA:
3.01 Diagnóstico bacteriológico de material vegetal empleando DAS-Elisa doble sandwich de anticuerpo
3.02 Diagnóstico bacteriológico de material vegetal empleando medios de cultivos específicos.
3.03 Diagnóstico bacteriológico en turba y suelo empleando medios de cultivos
3.04 Curso de capacitación en diagnóstico de bacterias fitopatógenas en material vegetal
3.05 Diagnóstico molecular de Candidatus liberobacter en Cítricos (HLB) con PCR tiempo real con Sonda
3.06 Diagnóstico molecular de Candidatus liberobacter (HLB) en Diaphorina citri con PCR tiempo real con Sonda
3.07 Diagnóstico molecular de Xyllela fastidiosa en Cítricos (CVC) con PCR tiempo real con Sonda
3.08 Diagnóstico molecular de Xyllela fastidiosa en Vid (enfermedad de Pierce) con PCR tiempo con Sonda
3.09 Diagnóstico molecular de Spiroplasma citri con PCR tiempo real con Sybr Green
3.10 Diagnóstico molecular de Burkholderia glumae con PCR tiempo real con Sybr Green
3.11 Diagnóstico molecular de Burkholderia gladioli con PCR tiempo real con Sybr Green
3.12 Diagnóstico molecular de Fitoplasmas en general con PCR tiempo real con Sonda
3.13 Diagnóstico molecular del Fitoplasma "Flavescence Dore" con PCR tiempo real con Sonda
3.14 Diagnóstico molecular del Fitoplasma "Bois Noir" con PCR tiempo real con Sonda
4. LABORATORIO DE VIROLOGÍA:
4.01 Diagnóstico de virus en semillas con uso de Elisa indirecto
4.02 Diagnóstico de virus en semillas con uso de DAS-Elisa
4.03 Diagnóstico de virus en semillas con uso de Immunostrips
4.04 Diagnóstico de virus en plantas con uso de Elisa indirecto
4.05 Diagnóstico de virus en plantas con uso de DAS-Elisa
4.06 Diagnóstico de virus en plantas con uso de Immunostrips
4.07 Curso de capacitación en diagnóstico de virus fitopatógenos
4.08 Diagnóstico molecular del Viroide del “Sunblotch” Mancha Solar del Palto (ASBVd) con RT-PCR tiempo real con Sonda
4.09 Diagnóstico molecular del Viroide del Tubérculo Ahusado de la Papa(PSTVd) con RT-PCR convencional
4.10 Diagnóstico molecular del Viroide del Exocortis de los Cítricos (CEVd) con RT-PCR convencional
4.11 Diagnóstico molecular del Viroide de la Cachexia de los Cítricos (CCaVd) con RT-PCR convencional
4.12 Diagnóstico molecular del Virus del Mosaico de la Bráctea del Banano (BBrMV) con RT-PCR tiempo real con Sonda
4.13 Diagnóstico molecular del Virus del Cogollo Racimoso del Banano (BBTV) con PCR tiempo real con Sonda
4.14 Diagnóstico molecular del Virus de la Tristeza de los Cítricos (CTV) con RT-PCR convencional
4.15 Diagnóstico molecular del Virus de la Pallidosis de la Fresa (SPaV) con RT-PCR convencional
4.16 Diagnóstico molecular del Virus del Falso Amarilleo de la Remolacha (BPYV) con RT-PCR convencional
4.17 Diagnóstico molecular del Virus del Mosaico del Pepino (CMV) con RT-PCR convencional
4.18 Diagnóstico molecular del Virus de la Leprosis de los Citricos (CiLV) con RT-PCR tiempo real con Sybr Green
4.19 Diagnóstico molecular del Virus de Psorosis de los citricos (CPsV) con RT-PCR tiempo real con Sybr Green
5. LABORATORIO DE NEMATOLOGÍA:
5.01 Extracción e identificación de nemátodos del suelo y tejido vegetal por el método de Baerman modificado
5.02 Extracción e identificación de nemátodos formadores de quiste por el método de Fenwick modificado
5.03 Curso de capacitación en identificación taxonómica de nemátodos fitoparásitos
6. LABORATORIO DE MALEZAS:
6.01 Identificación de malezas al estado de semillas
6.02 Identificación de malezas al estado de planta
6.03 Curso de capacitación en identificación taxonómica de semillas de malezas
7. LABORATORIO DE BIOLOGIA MOLECULAR:
7.01 Curso de capacitación en Diagnóstico Molecular mediante PCR convencional y en Tiempo Real
Muchas Gracias!!!