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SEMINARIO 3 – CINÉTICA ENZIMÁTICA
Diseño de un protocolo experimental
Daniel Martínez trabaja en el “Laboratorio de Cinética Enzimática”. Allí se estudia el
comportamiento de diversas enzimas, entre ellas la Ca2+-ATPasa de membrana
plasmática (PMCA).
A)
Para sus experimentos dispone de varias preparaciones a) membranas
fragmentadas de glóbulos rojos (abundancia de Ca2+-ATPasa = 0.1% de las proteínas
totales), b) Ca2+-ATPasa purificada e inserta en micelas, c) Ca2+-ATPasa purificada e
inserta en liposomas. Esquematice las distintas preparaciones. ¿Cuáles cree que serían
las potenciales ventajas y desventajas de cada una de ellas?
B)
Desea determinar la velocidad de hidrólisis del ATP en función de la
concentración de Ca++. Para ello en laboratorio se puso a punto el ensayo colorimétrico
de Fiske Subarrow para la medida de fósforo inorgánico. Brevemente, este ensayo se
basa en la formación de un complejo entre el fósforo y el molibdato de amonio capaz de
ser reducido dando lugar a un compuesto coloreado. El método permite estimar la
cantidad de fósforo liberado en base a la absorbancia de la muestra a 690 nm. Elija una
preparación y justifique su elección. Diseñe el protocolo experimental. ¿Cuál cree que
sería la utilidad del experimento?
C)
Los resultados obtenidos se encuentran en la tabla entregada por el docente.
Realice los gráficos que se propuso en el ítem anterior.
D)
Discuta los resultados. ¿Cuál podría ser el origen de la dispersión entre los
puntos? ¿Qué observa en las medidas de absorbancia a tiempos prolongados? ¿Debe
tener en cuenta esos datos para la estimación de la velocidad inicial?
E)
¿Qué puede concluir acerca de la cinética de la reacción de la Ca++ ATPasa?
F)
¿Qué métodos puede usar para estimar Km y Vmáx? ¿Cuáles son los valores de
Km y Vmáx en este caso?
G)
En una etapa posterior Daniel desea calcular la estequiometría de la reacción en
condiciones donde la Ca++ ATPasa funciona a su máxima velocidad. ¿Qué preparación
del item a) considera más apropiada para ello y por qué? ¿Qué variables debería medir?
¿Cómo calcularía la estequiometría de la reacción? De acuerdo a sus conocimientos,
¿qué valor esperaría obtener?
H)
En el laboratorio se hizo un estudio similar para Ca++ ATPasa del retículo
sarcoplásmico (SERCA) utilizando células musculares. En este caso, los parámetros
cinéticos fueron Km 0.4 M y Vmáx 25 nmoles de Ca++ / mg prot/ seg. Grafique
cualitativamente la curva de MM de la SERCA en el mismo par de ejes que para la
PMCA. Para ello considere que para los experimentos con la PMCA usó 1 g prot en
cada condición y que la abundancia relativa de la enzima en estudio es la misma en
ambos casos. ¿Qué explicación encuentra a la diferencia de comportamiento?