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Optimization of an RT-PCR test for diagnosis of avian leukosis virus.
Optimización de una prueba de RT-PCR para el diagnóstico del virus de leucosis
aviar (ALV)
M. Calderón., L.Rodriguez, V. J Vera*, G.CRamírez1
1
Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia. Departamento de Salud y
Producción Animal. Universidad Nacional de Colombia, Bogotá.
Summary
The presence of Avian leukosis virus was established in Colombia in 1998 by ELISA
without virus isolation. Due to the necessity for a right diagnosis and differentiation
between ALV subtypes, an RT-PCR was optimized. Two pairs of primers against the
gp85 glicoprotein were used. 47 serum samples from a field outbreak were evaluated
using the RT-PCR. From a previous ELISA test conducted at the ICA (Instituto
Colombiano Agropecuario) 33 out of the 47 samples were diagnosed as positive,
without subgroup differentiation. The RT-PCR for the same serum samples indicated
39 positive to ALV A-D and 8 negative. With specific primers for ALV-J 14 positive
and 33 negative results were obtained. According to that 12 samples were positive for
ALV-J as for ALV-D.
Introducción
La leucosis aviar (ALV) caracterizada por ser una entidad inmunosupresora, es
causada por un retrovirus - oncovirus tipo C, el cual agrupa enfermedades comunes
que inducen neoplasias benignas y malignas. Los virus del género ALV que afectan
usualmente a las aves son los subgrupos A,B,C,D, E y J los cuales ocasionan
importantes pérdidas económicas en integraciones avícolas. Los trabajos sobre
leucosis han sido dirigidos a la obtención de métodos diagnósticos sensibles y
específicos, que aseguren la detección certera del virus y a su vez orienten los planes
de control y erradicación a nivel mundial. Pensando en esto se han desarrollado varias
pruebas diagnósticas entre las cuales se encuentran la prueba de ELISA, COFAL, el
aislamiento viral y la RT-PCR. El uso de PCR es justificado por ser rápido, especifico
y mas sensible que las pruebas diagnósticas convencionales para la detección de ALV.
Objetivo
Normalizar una prueba de RT-PCR , para el diagnóstico y diferenciación de la
infección por virus de leucosis aviar subgrupo J.
Material y método
Se evaluaron 47 muestras de suero provenientes de brotes de Leucosis Aviar
presentados en 1998 en Colombia, pertenecientes al banco de sueros del laboratorio de
Proceedings of the 10th International Symposium on Veterinary Epidemiology and Economics, 2003
Available at www.sciquest.org.nz
patología aviar en el Instituto Colombiano Agropecuario (ICA), los cuales fueron
analizados previamente por prueba de ELISA directa para determinar antígeno de
ALV (IDEXX ALV-Ag).
Los sueros se trataron con buffer lisis TRIZOLReagent (Life Technologies) en
relación de 2:3, se centrifugaron a 12.000g a 4°C (centrífuga refrigerada BECKMAN
J2-21) por 10 minutos, luego se tomó el sobrenadante y se agregaron 200µl de
cloroformo; se centrifugó a 12.000g a 4°C (centrífuga BECKMAN J2-21) por 15
minutos; se tomó el sobrenadante (fase acuosa) y se le adicionaron 250µl de
isopropanol y 250µl de una solución de NaCl 1.2M y citrato de sodio 0.8M, se
centrifugó bajo las mismas condiciones, se eliminó el sobrenadante y al pellet de
RNA, se le agregó 1 ml de etanol, se centrifugó a 7500g (centrífuga BECKMAN J221) por 5 minutos, se retiró el sobrenadante y el pellet fue llevado a baño maría a
68°C y posteriormente se resuspendió en 60µl de agua DEPC a 68°C.
Como control positivo se emplearon muestras de sobrenadante de cultivo celular CEF
(fibroblastos de embrión de pollo) de virus de leucosis aviar de los subgrupos A, B,
C, D y J, provenientes del banco de virus de la Universidad de Athens en Georgia.
Como control negativo se usó sangre completa de pollos SPF y el virus de leucosis
bovina VLB. Se emplearon los primers H5, H7, AD1. El par de primers H5-AD1
reconoce los virus de leucosis aviar subgrupos A-D, y el H7-H5 reconoce virus del
subgrupo J. Se tomaron 5 µl de RNA a los cuales se le adicionaron 5 µl de random
primer (500ng) y 10 µl de agua DEPC y se calentaron a 70°C por 5 minutos, a esta
solución se le agregó una premezcla para RT de acuerdo con Smith, 1998. Se
tomaron 5 µl del producto obtenido en la RT (cDNA), 10µl de Buffer A Taq DNA
Polymerase, PROMEGA, (50 mM de Tris HCl (pH 8.0), 100 mM NaCl, 0.1 mM
EDTA, 1 mM DTT, 50% Glicerol y 1% Triton X-100) MgCl2 3 mM, 10 mM dNTPs,
100 pmol de cada primer, 5 U de Taq polimerasa y se completaron 50 µl de reacción
final con agua DEPC. Se emplearon las siguientes condiciones de amplificación:
denaturalización inicial a 94 °C por 4 minutos seguido de 35 ciclos con temperatura
de denaturación de 94 °C por 30 segundos,
annealing 58°C por un minuto,
extensión de 72°C por 90 segundos y una extensión final a 72 °C por 10 minutos.
Resultados y Discusión
Al evaluar las 47 muestras de brotes locales se hallaron 39 sueros positivos a leucosis
aviar de los subgrupos A-D y 14 sueros positivos al ALV-J, encontrándose que 12
muestras fueron positivas tanto para ALV A-D como para ALV-J. Lo anterior sugiere
la presencia de infecciones mixtas como causantes del brote de leucosis aviar
presentado en 199 en Colombia.
Como se demostró, en el brote de leucosis, la prueba de ELISA de captura de antígeno
diagnostica la enfermedad más no el subgrupo actuante; en el caso de RT- PCR,
cuando se emplea con primers específicos para los subgrupos, permite diferenciar la
presencia del subgrupo J de los restantes, lo cual desde el punto de vista de acciones
sanitarias en el manejo de la enfermedad es importante. Por otra parte, el empleo del
RT-PCR permite detectar el virus aún en casos en los cuales se presentan infecciones
persistentes.
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Teniendo en cuenta que en ésta investigación no se dispuso de un número de muestras
suficiente para llevar a cabo comparaciones de sensibilidad y especificidad entre las
pruebas evaluadas se recomienda llevar a cabo dicha evaluación aumentando el
número de muestras analizadas. Así mismo, es importante establecer la secuencia del
cDNA del producto obtenido en la amplificación, con el fin de establecer mapas
genéticos que permitan determinar en un momento dado variaciones en el genoma del
virus, las cuales son importantes desde el punto de vista de epidemiología molecular y
finalmente determinarán el diseño de estrategias de control y eventualmente
erradicación de la enfermedad más efectivas.
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