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Obtención de plantas por embriogénesis somática a partir de hojas
inmaduras de Arachis Pintoi triploide
Rey, Hebe Y. - Mroginski, Luis A.
Trabajo parcialmente financiado por el CONICET y por la SGCyT (UNNE)
IBONE - CC 209 - Facultad de Ciencias Agrarias - UNNE.
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INTRODUCCION
La especie A. Pintoi es una interesante forrajera para áreas tropicales y subtropicales (Pizarro y Rincón,
1994). Arachis Pintoi Krapov. & W.C. Gregory (Leguminosae) contiene plantas diploides (2n= 2x= 20) y
triploides (2n=3x=30) (Peñaloza et al, 1996). Estas últimas son perennes y no producen semillas.
Hasta este momento, si bien se han desarrollado varios sistemas in vitro que posibilitan la regeneración
de plantas de diversas especies de Leguminosas, con A. Pintoi diploide se han publicado trabajos que incluyen
diferentes estrategias de regeneración de plantas via organogénesis (Burtnik y Mroginski, 1985) y vía
embriogénesis somática, (Rey et al, 2000) pero aún no se ha publicado ningún procedimiento que involucre a
Arachis Pintoi (2n=3x=30).
En este trabajo se da a conocer un procedimiento que permite la obtención de plantas de Arachis Pintoi
triploide mediante el cultivo de hojas inmaduras
MATERIALES Y METODOS
Se cultivaron hojas inmaduras de aproximadamente 2- 4 mm de largo de plantas establecidas in vitro de
A. Pintoi (2n=3x=30).
Para el establecimiento de las plantas in vitro se cultivaron ápices caulinares provenientes de plantas
que crecen en macetas en el jardín del IBONE. La desinfección de los ápices se realizó sumergiéndolos en etanol
70% durante 1 min y luego en una solución de NaOCl al 1,1% más una gota de Tween 20® durante 12 minutos,
seguidos por tres lavados con agua destilada estéril.
Los ápices fueron cultivados en el medio basal de Murashige & Skoog (1962) MS, suplementado con
0,01 mg/L de ácido naflatenacético (ANA) y 0,01 mg/L de 6-bencilaminopurina (BAP). Para el cultivo de hojas
se utilizó MS + 10 mg/L de picloram (PIC) sólo o suplementado con 1 mg/L (BAP) ó 1 mg/L de cinetina (CIN).
El pH de los medios fue ajustado a 5,8 con KOH y/o HCl antes de la adición de 0,65 % de agar. Los medios
contenidos en tubos de vidrio de 11 mL. (a razón de 3 mL. de medio/tubo) fueron obturados con papel de
aluminio y esterilizados en autoclave a 0,101MPa durante 20 minutos.
Los tubos cultivados y obturados con Resinite AF 50 fueron incubados en un cuarto climatizado a 27 ±
2°C, con un fotoperíodo de 14 horas (116 µm.m-2.s-1). Los experimentos fueron repetidos por lo menos tres
veces.
RESULTADOS Y DISCUSION
Luego de una semana de cultivo se pudo apreciar la expansión de las hojas cultivadas, y a los 30 días,
en algunos explantes (6%), la formación de embriones somáticos. Como en otros experimentos los explantes
necesitaron más tiempo para diferenciar embriones somáticos (Rey et al, 2000), los experimentos fueron
evaluados a los 90 días. En la mayoría de los explantes los embriones se formaron en el pecíolo y en la base de
la hoja en la nervadura media, concordando con lo encontrado en otras especies (Vázquez et al, 1991; Ruiz et al,
1992), y en las nervaduras secundarias (Michler & Bauer, 1991), en otras especies como Manihot esculenta los
embriones se forman en lóbulos jóvenes de las hojas (Raemakers et al 1993a; 1993b).
En la Fig.1 se puede observar que la eficiencia en la regeneración de embriones somáticos depende en
gran medida del medio de cultivo empleado, ya que los máximos valores tanto en porcentaje de explantes que
regeneran embriones como el número de embriones por explante se consiguieron con 10 mg/L PIC. Cuando los
medios estuvieron compuestos por una auxina y una citocinina el porcentaje de explantes que regeneraron y el
número de embriones por explante fue menor. Estos porcentajes obtenidos en estos últimos medios concuerdan
con lo observado por Rey et al (2000), con explantes provenientes de la primer hoja desplegada de A. pintoi
diploide. En cambio, los resultados obtenidos en el presente trabajo con PIC 10 mg/L superan en un 30% a los
conseguidos por Rey et al (2000). En este sentido son interesantes los resultados de Baker & Wetzstein, 1998,
que demuestran que la embriogénesis somática en Arachis hypogaea está influenciado por el estado de la planta,
el tamaño de la hoja, el medio de inducción y el tiempo de inducción en el medio. Con Arachis hypogaea se han
publicado varios trabajos, en la mayoría de ellos cuando se cultivan explantes provenientes de plántulas se logra
regeneración vía organogénesis Mroginski et al., (1981), Pittman et al (1983) y en otras especies de Arachis
(Pittman et al., 1983, 1984). Cuando se emplearon embriones sexuales intactos o partes de ellos, se diferencian
embriones somáticos con eficiencia variable dependiendo del medio de cultivo empleado (Sellars et al. (1990;
Baker and Wetzstein 1992; Durham and Parrot 1992; Eapen et al. 1993; Chengalrayan et al 1994; Wetzstein and
Baker 1993).
Las formas de los embriones somáticos de A. pintoi triploide se asimilan a las obtenidas por Rey et al
(2000) con A. pintoi diploide y a las obtenidas por Wetzstein and Baker (1993) en A. hypogaea.
Para la germinación, los embriones fueron transferidos a MS + 0,01 mg/L ANA + 0,01 mg/L BAP,
donde transcurridos 14 días se visualizó 70 % de maduración de los mismos y también conversión de algunos de
ellos a plantas. Las plantas fueron exitosamente transferidas a suelo.
Fig. 1 Efecto del medio inicial en la inducción de respuestas morfogénicas a partir de explantes de hojas
inmaduras de A. pintoi (triploide) a los 90 días de cultivo. Las barras verticales indican error
estandar.
20
40
15
30
10
20
5
10
0
0
PIC 10
BAP 1
CIN 1 mg/L
PIC 10
BIBLIOGRAFIA
Baker CM, Wetzstein HY (1992). Plant Cell Rep 11:71-75.
Baker CM, HY Wetzstein (1998). Plant Cell Reports 17: 925-929.
Burtnik O.J. y L.A. Mroginski. (1985). Oléagineux 40: 609-611
Chengalrayan K, Sathaye SS, Hazra S (1994). Plant Cell Rep 13: 578-581.
Durham RE, Parrot WA (1992). Plant Cell Rep 11: 122-125.
Eapen S, George L (1993). Plant Cell Tissue Organ Cult 35: 151-156.
Embriones / explante
Callos con embriones (%)
50
Krapovickas, A; Gregory, W (1994).. Bonplandia 8: 1-186.
Milcher CH, Bauer EO (1991). Plant Sci 77: 111-118.
Mroginski, LA, KK Kartha, and JP Shyluk. 1981. Can. J. Bot. 59: 826-830.
Murashige, T & Skoog, F (1962). Physiol. Plant. 15: 473-497.
Peñaloza, AP, Pozzobon, MT, Valls, JFM. 1996. In: Congresso Nacional da Genética, 42, 1996, Caxambu,
Program and Abstracts. Caxambu, SBG, 1996, p 129. (Revista Brasilera de Genética, V. 19 (3,
suplemento), p. 129.
Pittman, R, Banks, DJ, Kirby, JS and Richardson, PE. 1983. Peanut Sci. 10: 21-25.
Pittman, R, Johnson, BB and Banks, DJ. 1984. Peanut Sci. 11: 24-27.
Pizarro EA y Rincón, A. (1994). In: Kerridge PC, Hardy W (eds) Biology and agronomy of forage Arachis.
CIAT, Cali, Colombia, pp 144-157.
Raemakers, CJJM, Schavemaker, CM; Jacobsen E & Visser, RGF. 1993a. Plant Cell Reports 12: 226-229.
Raemakers, CJJM, Bessembinder, JJE; Staritsky, G; Jacobsen E & Visser, RGF. 1993b. Plant Cell, Tissue and
Organ Culture 33: 151-156.
Rey, HY, Scocchi, AM; González, AM & Mroginski, LA (2000). Plant Cell Reports 19: 856-862.
Ruiz ML, Rueda J, Peláez MI, Espino FJ, Candela M, Sendino AM, Vázquez AM (1992). Plant Cell Tissue
Organ Cult 28: 97-101.
Sellars, RM; Southward GM, Phillips GC. 1990. Crop Sci. 30:408-414.
Vázquez AM, Espino FJ, Rueda J, Candela M. Sendino AM (1991). Plant Cell Rep 10: 265-268.
Wetzstein, HY, Baker CM (1993). Plant Science 92:81-89.