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Nature Protocols (2006) 1 (2); 1-8
Cell tracking using a photoconvertible
fluorescent protein
Hatta K., Tsujii H. & Omura T.
Laboratory for Vertebrate Body Plan, Center for Developmental Biology, RIKEN Kobe 2-2-3
Minatojima Minamimachi, Chuo-ku, Kobe 650-0047, Japan.
Valeria Larenas H.
06 enero 2011.
Introducción
W Técnicas de Imaging han sido útiles para comprender
procesos como embriogénesis describiendo tipos
celulares involucrados (linaje celular) y patrones de
migración in vivo.
W Marcaje celular no invasivo (reporteros fluorescentes)
han sido clave para describir estos procesos celulares
con una alta resolución.
W Se ha tomado ventaja de propiedades de moléculas
fluorescentes para lograr responder preguntas.
Objetivo
Seguimiento in vivo de células durante la embriogénesis
(neurulación) de zebrafish utilizando como reporteros
moléculas fotoconvertibles en microscopía de fluorescencia
convencional y confocal laser scanning
Fotoconversión
Propiedad por la cual una molécula que emite fluorescencia,
la cual al ser irradiada con luz UV, es capaz de modificar su
estructura cambiando a la ves su espectro de excitación y
emisión, presentando fluorescencia diferente al inicial.
La fotoconversión es estable y puede ser reversible o
irreversible
Sonja N., Cell, Marzo 2009
Ejemplos de moléculas fotoconvertibles
Sonja N., Cell, Marzo 2009
Moléculas fotoconvertibles
Kaede
Características
Fotoconvertible
Fluorescente verde
Tetramerico
λ fotoconversion
Microscopía
λ excitación post FC
λ emision post FC
Kaede
(+)
tripeptido (Hys, Tyr,Gly)
(+)
403 nm
Fluorescencia/Confocal
508
518
KikGR
(+)
tripeptido (Hys, Tyr,Gly)
(+)
760 nm
Dos fotones
583
593
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/tutorials/fluorescentproteins/kaedeeoschroma/index.html
Protocolo
Tg(deltaD:Gal4)
Microinyección
mRNA
DNA
x
Tg(UAS:Kaede)
Crecimiento
Tg Kaede
28ºC
(tej específico)
Fotoconversión
10 s
UV
UV
Fotoconversión Kaede
rojo
verde
* Kaede mRNA
Fotoconversión Kaede
Microscopio convencional
Confocal
Marcaje de neuronas usando Kaed
Marcaje anterógrado
Marcaje retrogrado
Marcaje de neuronas usando Kaede y KikGR
Confocal
Tg(deltaD:Gal4)x Tg(UAS:Kaede)
Dos fotones
Tg (deltaD:Gal4)x Tg(UAS:KikGR)
Resumiendo
Microscopía
Convencional
Tiempo de fotoactivación seg a minutos
Resolución espacial
(-)
Confocal
Dos Fotones
10 min
(++)
~1000 veces mas
(+++)
Conclusión
W Esta técnica permite la visualización de
movimientos celulares y de tipos neuronales en
embriones de zebrafish in vivo.
W Resulta ser una poderosa herramienta en el proceso
de desarrollo de permitiendo describirlo a través del
tiempo, pudiendo ser aplicado a modelos de estudio
distintos (C. elegans, drosophila melanoganster etc…).
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