Download Bases Teóricas de las Técnicas del ADN Recombinante

UNIVERSIDAD SIMÓN BOLÍVAR
Vicerrectorado Académico
Departamento: Biología Celular
Asignatura: Bases Teóricas de las Técnicas del ADN Recombinante
Código: BC. 6221
Requisitos: BC. 3221
No de unidades créditos: 4
No de horas semanales: 4 teóricas
Vigencia: 2006
Objetivo General
Estudiar y comprender los fundamentos de las técnicas básicas de la biología
molecular, los avances recientes y sus aplicaciones en las diferentes disciplinas de la
Biología
Contenidos
Unidad I. Estructura y propiedades de los ácidos nucleicos y su relación con
los principios de las técnicas moleculares. (4 horas)
Complementariedad de bases, Curvas Cot y Tm, Desnaturalización. Significado
práctico de las curvas de desnaturalización. Agentes desnaturalizantes:
temperatura, ácidos y bases y agentes químicos. Hibridación molecular:
principios, factores que influyen y rigor de la hibridación.
Unidad II. Métodos para la purificación y análisis de los ácidos nucleicos. (6
horas)
Separación y purificación de ADN genómico (a partir de Bacterias, o células
eucariotas), ADN plasmídico, ARN total y ARN mensajero. Extracción por
solubilidad en fases inmiscibles y por precipitación salina diferencial.
Procedimientos alternativos: utilización de microesferas magnéticas o sílice.
Fraccionamiento de los ácidos nucleicos: Centrifugación zonal, centrifugación
isopícnica, cromatografía (intercambio iónico y afinidad) y electroforesis. Bases
fisicoquímicas de la electroforesis: soportes (agarosa, poliacrilamida), Gradiente
de campo: campo eléctrico uniforme, pulseado, etc.
Cuantificación
(espectrofotometría y electroforesis). Grado de resolución según el tipo de
soporte y campo eléctrico aplicado. Curva de calibración de la electroforesis para
el cálculo del tamaño de los fragmentos de ADN. Transferencia e Hibridación de
ADN y ARN: Hibridación en fase líquida. Hibridación en soporte sólido: “Dot
blot” y “slot-blot”, Southern y Northern; Proteínas: Western. Hibridación in situ.
Preparación de Sondas para la hibridación: Clasificación (convencionales y
sintéticas), tipo de marcaje (directo o indirecto).
Unidad III. Enzimas utilizadas en biología molecular. (2 horas)
Enzimas de restricción del tipo I, II y III: origen: sistemas de modificación y
restricción en bacterias. Enzimas de corte infrecuente. Isosquizómeros. Enzimas
de restricción de otros tipos: Sistema Mcr (modified cytosine restriction).
Aplicaciones de las enzimas de restricción: Fragmentación de genomas.
Elaboración de mapas físicos utilizando enzimas de restricción, Polimorfismos de
fragmentos de restricción (RFLP). Otras enzimas empleadas en biología
molecular: ligasas, polimerasas, transcriptasa inversa, nucleasas, fosfatasas,
quinasas, transferasas y otras enzimas.
Unidad IV. La reacción en cadena de la Polimerasa (PCR). (4 horas)
Descripción del método y sus componentes. Selección de secuencias blanco.
Diseño y síntesis de cebadores. Etapas del proceso. Algunas variantes: L-PCR
(Long PCR), PCR anidada (nested PCR), PCR inversa, PCR con adaptadores,
PCR asimétrica, AS-PCR (Allele Specific – PCR), RT-PCR (Reverse
Transcription – PCR) y PCR en Tiempo Real.
Unidad V. Etapas para crear moléculas de ADN Recombinante: Clonación.
(8 horas).
Objetivos de la clonación. Origen del ácido nucleico para el clonamiento: ADN
digerido con enzimas de restricción, ADNc, producto de PCR o ADN sintético.
Vectores de clonamiento, propiedades que deben reunir: Plásmidos,
bacteriófagos, cósmidos, fagémidos, pYAC, vectores eucarióticos. Vectores de
expresión. Criterios para la escogencia del vector de clonamiento. Estrategias
para el clonamiento: dirigido o al azar. Ligamiento: Extremos cohesivos, romos,
unión nucleotidos repetidos (Tailing) u oligos con sitios de restricción o extremos
cohesivos (linkers). Transferencia a sistemas celulares: Tipo de célula receptora:
bacterias (transformación), células eucariotas (transfección), Método de
introducción del ácido nucleico en la célula receptora: Con Ca++,
Electroporación, lipofección (con liposomas), Transducción o transfección con
virus,
biolística y Microinyección. Detección y selección de clones
recombinantes: uso de sondas y anticuerpos o por métodos genéticos o
complementación fenotípica. Construcción de Genotecas genómicas y de ADNc.
Cálculos de la eficiencia. Genotecas sustraídas.
Unidad VI. Secuenciación. (4 horas)
Secuenciación del ADN: Método químico y método enzimático. Ventajas y
desventajas de cada método. Secuenciación automatizada. Análisis de
secuencias. Secuenciación por PCR. Secuenciación del ARN.
Unidad VII. Bioinformática. (4 horas)
Usos y demostración con Programas y Bases de Datos en el análisis de
secuencias. Páginas WEB: http://us.expasy.org/
http://bio.lundberg.gu.se/
http://rna.lundberg.gu.se/cutter2/
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gquery/gquery.fcgi?tool=toolbar
Unidad VIII. Proyectos genomas y análisis de genomas. (4 horas)
Mapas genéticos y físicos. Secuencias completas de genomas. Geonómica
funcional. Banco de datos de genomas secuenciados
Unidad IX. Aplicaciones del ADN Recombinante. (6 horas)
La Ingeniería genética en plantas. La ingeniería genética en la medicina, y
otros potenciales campos de aplicación.
Estrategias Metodológicas y Didácticas
Clases magistrales
Seminarios
Diseño de Proyectos de Investigación
Estrategias de evaluación
Pruebas escritas
Presentación de proyectos de investigación
Ejercicios para fuera del aula
Presentación y discusión de seminarios
Bibliografía
- Brown, T. Gene Cloning. An Introduction. Second Edition. Chapman and Hall.
1990.
- Brown, T. Genomes. 1999. Jonh Wiley & Sons, Inc. New York
- Glick, B. And Pasternak, J. Molecular Biotechnology. Principles and applications
of Recombinant DNA. 1998. Second Edition. ASM Press.
- Izquierdo, M. Ingeniería Genética y Transferencia Génica. 2.001. Ediciones
Pirámides.
- Luque, J. y Herraez, A. Biología Molecular e Ingeniería Genética. Conceptos,
técnicas y aplicaciones en ciencias de la salud. 2.002. Elsevier Science.
- Maniatis, T, Fritsch, E., Sambrock J. Molecular Cloning. A Laboratory Manual.
1992. Cold Spring Harbor Laboratory.
- Strachan, T and Read, A. Human Molecular Genetic. 1999. 2nd ed. Jonh Wiley &
Sons, Inc. New York
- Watson, J., Gillman, M., Witkowski, J. and Zoller, M. Recombinant DNA. Second
Edition. 1992. Scientific American Book.
- Separatas entregadas en clase por los Profesores participantes.