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Variabilidad genética del virus de la hepatitis C.
Su impacto en el diagnostico y el tratamiento de la
enfermedad.
Juan Cristina* - Laboratorio de Virología Molecular,
Centro de Investigaciones Nucleares, Facultad de Ciencias, Universidad de la República.
RESUMEN
INTRODUCCIÓN
El virus de la Hepatitis C (VHC) representa uno de los
patógenos mas importantes para la salud humana. Se estima
que 170 millones de personas en el mundo están infectadas por
este virus. La evolución de VHC es un proceso altamente
dinámico. VHC explota todos los mecanismos conocidos de
variabilidad genética para asegurar su superviviencia. Como
la mayoría de los virus ARN, VHC circula in vivo como una
compleja población de variantes virales fuertemente
relacionadas, denominadas cuasispecies. Este trabajo
describe la variabilidad genética de VHC en Uruguay, la
región Latino Americana y como ésta tiene un impacto
fundamental en el diagnóstico, el tratamiento y la persistencia
de este importante patógeno.
Se estima que 170 millones de personas en el mundo están
infectadas por VHC, lo cuál crea un grave problema de salud, a
través de una enfermedad hepática crónica y progresiva
(Simmonds, 2004). VHC se ha convertido en una causa mayor
de transplante hepático y una de las causas mas comunes para
indicar dicho transplante (para una revisión ver Hoofnagle,
2002; Pawlotsky, 2003). VHC ha sido clasificado en la familia
Flaviviridae, aunque difiere de otros miembros de la familia
en algunos detalles de su organización genómica de los
miembros originales de la familia que son transmitidos por
vectores (Simmonds, 2004). Como la mayoría de los virus
cuyo genoma está constituído por RNA, VHC circula in vivo
como una compleja población de variantes virales
fuertemente relacionadas genéticamente, comúnmente
denominadas cuasiespecies (Chambers 2005; Laskus et al.,
2004; Feliu et al., 2004; Martel, 1992).
VHC es un virus envuelto, con un genoma constituído por una
única molécula de RNA de aproximadamente 9400 bases. La
mayoría del genoma forma un único marco de lectura abierto
(ORF) que codifica tres proteínas estructurales (core, E1, E2)
y siete proteínas no-estructurales (p7, NS2-NS5B). Dos
regiones no codificantes, ubicadas en ambos extremos del
genoma (5'NCR y 3'NCR) son requeridas para la transcripción
y replicación del genoma (Figura 1).
Este proceso también requiere un elemento de replicación en
cis situado en la secuencia codificante del gen NS5B,
recientemente descrito (You et al., 2004). La traducción a
partir del único marco de lectura (ORF) es dependiente de un
sitio interno de iniciación (IRES) en la región 5' NCR, que
interactúa directamente con la subunidad 40 S ribosomal
durante la iniciación de la traducción (Pestova et al., 1998).
Diversas metodologías han sido desarrolladas para
identificación de grupos genéticos de VHC utilizando
distintas regiones genómicas. Entre ellas, las mas utilizadas
cuando un gran número de muestras es analizado son las
siguientes: polimorfismos de fragmentos de restricción de
amplicones obtenidos por PCR de la región 5'NCR (Davidson
Palabras clave: virus de hepatitis C (VHC), variabilidad
genética, cuasiespecies, evolución molecular.
SUMMARY
Hepatitis C virus (HCV) has been the subject of intense
research and clinical investigations as its major role in human
disease has emerged. HCV evolution is a highly dynamic
process. HCV exploits all known mechanisms of genetic
variation to ensure their survival. Like most RNA viruses,
HCV circulates in vivo as a complex population of different
but closely related viral variants, commonly referred to as a
quasispecies. This work describes the genetic variability of
HCV in Uruguay and the Latin American region, and how this
variation has a fundamental impact in diagnosis, treatment and
persistence of this important pathogen.
Key words: hepatitis C virus (HCV), genetic variability,
quasiespecies, molecular evolution.
*Correspondencia: Juan Cristina.
Centro de Investigaciones Nucleares - Iguá 4225,
Facultad de Ciencias, UdelaR
Montevideo 11400, Uruguay.
Tel.: (598 2) 525 0901 - Fax: (598 2) 525 0895
e-mail: cristina@cin.edu.uy
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et al., 1995), tipificación basada en core (Okamoto et al., 1992;
Okamoto et al., 1996) o NS5B (Robertson et al., 1998). Otras
regiones, tales como regiones hipervariables de E2 o NS5A,
muestran una variabilidad mucho mayor y un cambio mayor
en la secuencia de aminoácidos. Esta variabilidad puede
generarse a través de mecanismos de selección específicos
que operan en el virus y que están asociados con escape del
sistema inmune, por ejemplo, la región HVR en E2 puede ser
un blanco de anticuerpos neutralizantes y la persistencia
entonces requiere variaciones continuas de la secuencia viral
para evadir la respuesta de células B (Kantzanou et al., 2003).
Comparaciones de secuencias de nucleótidos de variantes de
VHC obtenidas de diferentes pacientes de distintas regiones
geográficas del mundo revelaron la existencia de al menos seis
tipos genéticos distintos (Simmonds et al., 1993, 2004). En
promedio, considerando el genoma completo, estos grupos
difieren en 30-35 % de sitios de nucleótidos. Cada uno de los
seis grupos mayores contienen una serie de sub-tipos que en
general difieren entre sí en 20-25 % en su secuencia de
nucleótidos (Simmonds et al., 1993). Algunos de ellos, tales
como 1a, 1b o 3a están ampliamente distribuidos y presentes
en la mayoría de los países occidentales (Simmonds, 2004).
Distintos genotipos y sub-tipos correlacionarían de manera
diferente para la susceptibilidad al tratamiento terapéutico con
interferón (IFN) o IFN/ribavirina (RBV). Solo un 10-20 % y
un 40-50 % de los pacientes crónicamente infectados con
genotipo 1 de VHC en monoterapia con INF o terapia
combinada IFN/RBV, respectivamente, exhiben una
desaparición completa y permanente del virus. Estas tasas son
mucho mas inferiores que las tasas de 50 y 70-80 % que son
observadas en tratamientos de genotipos 2 o 3 de VHC
(Pawlotsky, 2003; Zeuzem, 2004).
Diversidad genética y genotipos.
Existe una substancial diversidad genética entre los mayores
genotipos de VHC, los cuales están frecuentemente
relacionados con distribuciones geográficas (Simmonds,
2004). Asimismo, VHC se diversifica en un individuo
infectado a lo largo del tiempo, formando cuasiespecies
En el diagrama se muestra la organización del genoma de VHC, la
ubicación de las proteínas estructurales y no estructurales, así como las
dos regiones no codificantes del genoma (5'NCR y 3' NCR).
Figura 1. Diagrama del genoma de VHC.
Metaloproteasa
1657/1658
1711/1712
1026/1027
746/747
809/810
383/384
-173/174
191/192
Sitio de Clivaje
2420/2421
Ns3 Proteasa (+Ns4a)
Señales para la peptidasa
1972/1973
Enzimas de
Clivaje
9030-9099 nt
C E1
5`
E2
NS2
NS3
341nt
a
NS4
b
a
NS5
3`
b
27-66nt
poly (U)
or
poly (A)
3010-3033 aa
Tamaño de la
Proteína
21-22 gp3137
gp6172
Proteínas
estructurales
Posible
Función
18
IRES
Glicoproteína
de la envoltura
7 21-23
?
70-72
4-10 27
56-58
68-70
Proteínas no estructurales
Zn+
Serin-proteasa
?
Metalo
helicasa
Proteasa
Requerida por
la proteasa Ns3
Interacción ARN-polimerasa
con PKR ARN dependiente
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(Domingo et al., 2001). La variabilidad genética preexistente, combinada con una población extremadamente
grande de estirpes virales en un paciente infectado
crónicamente, provee un amplio rango de variantes que
pueden adaptarse a nuevas presiones selectivas, tales
como reconocimiento inmunológico y terapia antiviral.
El genotipo 1 es el tipo mas prevalente en Uruguay y en las
regiones de Sudamérica y el Caribe (Martial et al., 2004;
Sosa et al., 2004; San Roman et al., 2002; Vega et al., 2001;
Colina et al., 1999; Munoz et al., 1998; Picchio et al.,
1997; Munoz et al., 1998; Picchio et al., 1997; Pujol et al.,
1997; Krug et al., 1996). Sin embargo, es posible observar
diferencias en la distribución de genotipos en distintas
áreas de una región y aún en diferentes áreas dentro de un
país (Busek & Oliveira, 2003; Re et al., 2003; Parana et al.,
2002; Levi et al., 2002; Alfonso et al., 2001; Aguilar et al.,
2001; Sanchez et al., 2000; Silva et al., 2000).
Recientemente, análisis filogenético de la región 5'NCR
de cepas pertenecientes al tipo 1 de VHC aisladas en
Uruguay, Chile, Brasil y Costa Rica revelaron la presencia
de aislados del tipo 1 que pertenecen a un linaje genético
diferente de los sub-tipos mayores del genotipo 1 (1a y 1b)
e indicaron una diversificación de VHC en las regiones
Centro y Sudamericana (Colina et al., 1999; Vega et al.,
2001; San Roman et al., 2002). Recientes análisis
filogenéticos de pacientes de Argentina han confirmado
estos resultados (Gismondi et al., 2004). Estudios
recientes también han demostrado un incremento de la
diversificación de VHC en otras áreas geográficas del
mundo, tales como diversificación del genotipo 4 en
Francia (Morice et al., 2001), del genotipo 2 en Moldavia
(Samokhvalov et al., 2000) y genotipo 3 en Somalía (Abid
et al., 2000).
La infección primaria con VHC parecería ser un evento
oligoclonal y la adaptación de VHC para persistir in vivo
involucraría el crecimiento selectivo de variantes virales
pre-existentes del gran espectro de cuasiespecies de la
población de VHC (Domingo et al., 2001; Morice, 2001;
Nousbaum, 2000). Esto probablemente represente la
contraparte molecular de la adaptación del virus a nuevas
condiciones medioambientales. Si esta hipótesis fuera
correcta, la emergencia de cepas del tipo 1 en Centro y
Sudamérica que muestran una relación genética mas
distante con los sub-tipos mayores del genotipo 1 puede
estar asociada con este fenómeno.
Debido a que distintos tipos y sub-tipos parecen
correlacionar de manera distinta a la terapia antiviral
(Pawlotsky, 2003), la presencia de nuevos linajes de VHC
en el genotipo 1 en Centro y Sudamérica deben ser
evaluadas en relación con el tratamiento antiviral.
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Recombinación
Hasta 1999, no había evidencia de recombinación entre
estirpes virales en la familia Flaviviridae, aunque la
posibilidad había sido considerada anteriormente (Blok et al.,
1992; Kuno et al., 1997; Monath, 1994). Por consiguiente, la
gran mayoría del trabajo en flavivirus, incluyendo estudios de
vacunas y análisis filogenéticos, en los cuales algunas veces
los genotipos fueron identificados y correlacionados con la
gravedad de la enfermedad (Chen et al., 1990; Leitmeyer et al.,
1999; Rico-Hesse, 1990), han tenido como base
implícitamente que la evolución en la familia Flaviviridae es
clonal, con la diversidad genética generada a través de
acumulación de cambios mutacionales.
Estudios recientes han demostrado que esta hipótesis no era
válida, dado que evidencias de recombinación homóloga han
sido demostradas en pestivirus (virus de la diarrea bovina)
(Becher et al., 2001), flavivirus (todos los serotipos de virus
dengue) (Holmes et al., 1999; Tolou et al., 2001; Uzcategui et
al., 2001; Worobey & Holmes, 1999), hepacivirus (GB virus
C/hepatitis G virus) (Worobey & Holmes, 2001), virus de la
Encefalitis Japonesa o Encefalitis de St Louis (Twiddy &
Holmes, 2003).
Por consiguiente, los métodos actuales de identificación de
genotipos de VHC no tienen en consideración la
recombinación homóloga.
Dada la importancia que la recombinación puede tener para la
evolución viral (Worobey et al., 1999) y el desarrollo de
vacunas, programas de control, manejo de pacientes y terapias
antivirales, es importante determinar cual es el grado de
participación que los mecanismos de recombinación juegan
en la evolución de VHC. Ignorando la presencia de posibles
eventos de recombinación, se pueden comprometer los
análisis filogenéticos (Posada & Crandall, 2001; Schierup &
Hein, 2000).
Recientemente, una variante natural inter-típica (2k/1b) de
VHC ha sido identificada en San Petersburgo (Rusia)
(Kalinina et al., 2002; 2004). Análisis filogenético de cepas
VHC circulantes en Perú, han demostrado la existencia de
variantes naturales intra-típicas (1a/1b). El punto de
recombinación en la cepa sudamericana está situado en la
región NS5B (Colina et al., 2004). Por consiguiente, es
necesario un estudio mas profundo de la variabilidad genética
de las estirpes de VHC que circulan en la región Latino
Americana.
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Co-infección con distintos genotipos de VHC
Co-infección con el virus de la Hepatitis B (VHB)
y Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH)
La co-infección con diferentes genotipos de VHC ha sido
previamente reportada (Giannini et al., 1999). En un estudio
reciente, la relación entre carga viral de VHC en relación con
el genotipo de los pacientes co-infectados con distintos
genotipos de VHC fue establecida para 12 pacientes
(Schijman et al., 2004). La mayoría de los pacientes coinfectados fueron co-infectados con genotipos 1a y 1b. Solo
dos pacientes fueron co-infectados con genotipo 1b mas 2a/c o
2a/c mas 2b. La media de niveles de ARN de VHC para los
pacientes co-infectados (356.000 ± 56.000 [desviación
estándar (SD)] unidades internacionales (UI)/ml) no fue
significativamente mayor que para aquellos pacientes
infectados con solo un genotipo en el mismo estudio (344.000
± 52.000 [SD]UI/ml) (P > 0.05). Comparaciones de medianas
de niveles de ARN de VHC para pacientes co-infectados con
genotipos específicos en el mismo grupo etario (por ejemplo,
genotipo 1a mas 1b; 364.000 ± 60.000 [SD]) con medianas de
niveles de ARN de VHC para pacientes infectados con un
único genotipo (por ejemplo, tanto 1a o 1b; 360.000 ± 56.000
[SD] y 352.000 ± 48.000 [SD] UI/ml, respectivamente) no
mostraron diferencias estadísticamente significativas entre
ambos grupos (P > 0.05). Estos resultados sugieren que no hay
un efecto aditivo en los pacientes co-infectados. Por otra parte,
no tenemos evidencia de si los dos genotipos replican con
igual eficiencia, dado que mecanismos de interferencia entre
dos genotipos pueden ser posibles, tal como lo han sugerido
algunos autores (Kao et al., 1994; Laskus et al., 1996; Pujol et
al., 1989.).
Aproximadamente un tercio de todos los pacientes infectados
con VIH están co-infectados con VHC. La progresión de una
infección inicial con VHC a cirrosis hepática es acelerada en
pacientes co-infectados con VIH en comparación con
pacientes infectados solo con VHC (Alvarez & Latorre,
2004). Debido a que VHB y VHC comparten rutas de
transmisión, co-infección con VHB y VHC, o ambos, entre los
pacientes infectados con VIH es habitual, afectando
aproximadamente 15-30 % y 10-15 % de estos pacientes,
respectivamente (Sterling & Sulkowski, 2004). La coinfección entre VIH, VHC, VHB y virus Linfotrópico T
humano (HTLV) ha sido reportada en países latinoamericanos
(De los Angeles et al., 2004; Bonamigo et al., 2004; Segurado
et al., 2004).
Interacción con la célula huésped
VHC ha desarrollado un rango de mecanismos de evasión de
las defensas del huésped que están centradas alrededor de las
actividades de la proteína NS5A (ver Fig. 2) (Tan & Katze,
2001; Reyes, 2002; MacDonald & Harris, 2004). NS5A es una
proteína necesaria e involucrada en el complejo de replicación
viral. Además, posee otras actividades, entre ellas unirse e
inactivar PKR (Gale et al., 1997) y por consiguiente, bloquear
vías apoptóticas a través del secuestro de p53, modulación de
los niveles de calcio intracelular, interaccionar con el receptor
En el diagrama se muestra la ubicación de la región ISDR que interactúa
con PKR y otras vías celulares asociadas con respuesta innata anti-viral.
Otras regiones de NS5A bajo aparente selección durante terapia se indican
en celeste intenso en la figura.
Figura 2. Diagrama del gen NS5A de VHC.
Sitio de hiperfosforilación 2194
Sitios de fosforilación 2197, 2201, 2204
V3
ISDN
1973
2135 2139
Interacción
con NS4A
2209
2248
2209
2288
2302
2353
2382
2419
2274
Interacción con PKR
2248
2418
Interacción con Grb-2
2326
2334
Señal de localización
nuclear
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Roche
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de factor de crecimiento unido a proteína 2 (Tan et al., 1999;
Gong et al., 2001; Majumder et al., 2001) e inducir secreción
de interleukina 8 (Polyak et al., 2001).
Mucho antes de dilucidar las funciones de NS5A, se había
observado la existencia de clusters de cambios de aminoácidos en NS5A luego de tratamiento con IFN. Se estableció
una asociación entre respuesta al tratamiento y la posesión de
una secuencia prototipo de NS5A en la región donde las
mutaciones han ocurrido, denominada región determinante de
sensibilidad al IFN (ISDR) (Enomoto et al., 1995). También se
asoció poseer una ISDR prototipo con una mayor carga viral
en pacientes no tratados (Watanabe et al., 2003). Debido a que
ISDR co-localiza con la región de NS5A que interactúa con
PKR (ver Fig. 2), se ha sugerido que una evasión de PKR era
un determinante fundamental de la persistencia de VHC. Un
estudio reciente ha demostrado una correlación entre
secuencia prototipo ISDR y resistencia al tratamiento y por
consiguiente, un gran número de cambios de amino ácidos en
no respondedores (Witherell & Beineke, 2001). Este balance
entre la función de NS5A y el reconocimiento inmunológico
puede diferir entre genotipos de VHC. Por ejemplo, la razón
por la cual infecciones causadas por genotipos 2 y 3 de VHC
son generalmente mas proclives a una respuesta al tratamiento
con IFN pudiera ser que una gran proporción de pacientes
reconocen una secuencia en NS5A como prototipo
inmunológicamente.
Una mejor comprensión de la relación huésped-virus será de
fundamental importancia para comprender la patogénesis
causada por VHC, así como para el desarrollo de futuros
tratamientos y estrategias anti-virales.
AGRADECIMIENTOS
Juan Cristina agradece apoyo del Consejo Nacional de
Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICYT),
Uruguay, a través del Fondo Clemente Estable (Proyecto No.
8006).
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Juan Cristina
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