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Centro de Biotecnología, Vol. 4 Nro. 1. 2015 61
DETECCIÓN DEL VIRUS DE NEWCASTLE EN GALLINAS CRIOLLAS EN LA
PROVINCIA DE LOJA
DETECTION OF NEWCASTLE DISEASE VIRUS IN NATIVE HENS IN LOJA PROVINCE
Janeth E. Armijos Montaño1
Agusto Luzuriaga Neira2
Fredy Cueva Castillo3
Galo Escudero Sánchez4
Loidy Zamora Gutierrez2
Gustavo Villacís Rivas1*
1. Carrera de Medicina Veterinaria. Universidad Nacional de Loja.
Ciudadela Guillermo Falconi “La Argelia”- PBX 072547252 – Casilla
Letras ¨S¨, Loja-Ecuador
2. Universidad de Porto. Porto-Portugal.
3. Agrocalidad. Ministerio de Agricultura, Ganaderia, Acuacultura y Pesca. Loja. chazo1970@hotmail.com
4. Centro de Biotecnología. Universidad Nacional de Loja. Ciudadela
Guillermo Falconi ¨La Argelia¨- PBX 072547252 – Casilla Letras ¨S¨,
Loja-Ecuador. loydizamorag@gmail.com
* Autor para correspondencia
Resumen
La enfermedad de Newcastle es causada por cepas virulentas de paramixovirus tipo1 (PMVA-I). El
objetivo de este estudio fue determinar la presencia del virus en las parroquias de Cazaderos, Garza
Real, Mangahurco, Paletillas y Bolaspamba en el cantón Zapotillo en la provincia de Loja. Se tomaron
350 muestras de suero sanguíneo y 140 muestras de hisopados cloacales, provenientes de aves aparentemente sanas y que presentaron signos clínicos de la enfermedad. Las muestras de suero fueron
analizadas Kit de ELISA IDEXX, de las cuales un 49,7 % de las mismas resultaron positivas. A partir
de los hisopados se realizó el aislamiento viral en huevos embrionados de 9 a 11 días de desarrollo
libres de patógenos específicos (LPE). Se realizó hemoaglutinación en el fluido alantoideo para comprobar la presencia del virus. A partir del líquido alantoideo se extrajo ARN y posteriormente se les
realizó una RT-PCR con cebadores específicos, donde se obtuvo productos de 362 pb. La presencia
viral se comprobó en 10,71% de las muestras. Para realizar la identificación de cepas patogénicas se
realizó una segunda RT-PCR en un solo paso con cebadores específicos, donde se obtuvo amplificaciones de 254. Este es el primer estudio de la detección molecular del virus Newcastle en el Ecuador,
lo que contribuye al manejo de la enfermedad.
Palabras claves: Virus de Newcastle, ELISA, aislamiento viral, RT-PCR.
Abstract
The Newcastle Disease is causing by virulent strains of paramyxoviruses type 1(PMVA-I). The aim
of this study was to determine the presence of the virus in the Loja province. The places survey were
Cazaderos, Garza Real, Mangahurco, Paletillas and Bolaspamba. 350 serum and 140 cloacael swabs
samples were taken, from apparently healthy birds and showed disease clinical signs. Serum samples
were analyzed by IDEXX ELISA kit, which 49.7 % of them were positive. From the swabs it was performed virus isolation in eggs specific pathogen free (SPF) of 9-11 days of development. The Hemagglutination probe was performed in the allantoic fluid for determined virus presence. From allantoic
fluid RNA was extracted and subsequently RT-PCR was made with specific primers, products of 362
bp were obtained. Viral presence was found in 10.71% of the samples. To make identification of pathogenic strains a second RT-PCR was performed in a single step with specific primers, where amplifications of 254 bp were obtained. This is the first study of the molecular detection of Newcastle virus in
Ecuador, contributing to disease management.
Keywords: Newcastle virus disease, ELISA, viral isolation, RT-PCR.
Recibido: febrero 08 de 2015
Aprobado: mayo 27 de 2015
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Armijos et al. (2015); DETECCIÓN DEL VIRUS DE NEWCASTLE EN GALLINAS CRIOLLAS EN LA
PROVINCIA DE LOJA
Introducción
La industria avícola en el Ecuador aporta
aproximadamente el 23% del valor de la producción agropecuaria nacional. Constituye un
componente básico en la seguridad alimentaria. En el catón Zapotillo de la provincia de
Loja existen pequeños productores que crían
aves en sus propiedades bajo un sistema tradicional (traspatio). Donde el control sanitario
es carente, así como la existencia de programas de bioseguridad. Estos constituyen factores de riesgo para el desarrollo de enfermedades (Villacís et al., 2014).
Una de las enfermedades más importantes
que afecta al sector avícola en el cantón Zapotillo es la Enfermedad de Newcastle (EN)
causada por Newcastle disease virus (NDV)
que es uno de los patógenos de mayor importancia social y económica en la industria avícola (Villacís et al., 2014). Este virus produce
una elevada morbilidad y mortalidad, presenta un amplio rango de hospedero, afectando
a más de 240 especies aviares (OIE, 2012).
Newcastle disease virus pertenece a la familia Paramyxoviridae, del género Aluvavirus (ICTV, 2014). Existen tres tipos de cepas:
lentogénica o leve, mesogénica o moderada, y velogénica o muy virulenta. Las cepas
lentogénicas cursan con signos respiratorios
leves y caída de la postura en las aves más
sensibles. Las cepas mesogénicas dan lugar a formas clínicas agudas, cursando con
sintomatología respiratoria y las alteraciones
nerviosas no son frecuentes. Las cepas velogénicas dan lugar a formas clínicas sobreagudas, la morbilidad puede llegar a alcanzar valores del 100% y la mortalidad puede
superar el 50% en aves adultas y el 90% en
aves jóvenes. El cuadro clínico es de corta
duración, aparece bruscamente y se propaga
con rapidez (OIE, 2012).
Como medida de control de la enfermedad se
ha establecido la vacunación rutinaria contra
el virus de Newcastle en todas las aves comerciales, sin embargo, las aves de traspatio
no son sometidas a este procedimiento por
razones socio-culturales y económicas. Se
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ha descrito la aparente resistencia de estas
aves a la enfermedad, pero se reconoce que
actúan como importantes portadores y fuentes de infección para la avicultura comercial
(Senne, 2004).
El objetivo de este estudio fue determinar la
presencia del virus en las parroquias de Cazaderos, Garza Real, Mangahurco, Paletillas
y Bolaspamba en el cantón Zapotillo en la
provincia de Loja. Lo que posibilitará establecer un control epidemiológico a través de
planes de prevención. Esto contribuirá a evitar la diseminación de la enfermedad a otros
sectores, favoreciendo a la sanidad animal y
a la economía de los productores.
Materiales y métodos
Se tomaron 140 muestras de hisopados cloacales y 350 muestras de suero sanguíneo de
gallinas criollas aparentemente sanas y con
signos de la enfermedad en el cantón Zapotillo. El catón está ubicado en la parte occidental de la provincia de Loja, a 240 km aproximadamente, a 835 metros de altura sobre el
nivel del mar en la zona alta y a 182 metros de
altura sobre el nivel del mar en la zona baja.
Se recolectaron muestras de las parroquias:
Cazaderos, Garza Real, Limones Paletillas,
Bolaspamba y Mangahurco.
Las muestras se tomaron en etapas sucesivas, para lo cual se utilizó como guía el III
Censo Nacional Agropecuario realizado en el
2000, en el que existen 2266 Unión de Pequeños Agricultores.
Detección de anticuerpos
La detección de anticuerpos en las muestras
de suero sanguíneo se realizó mediante ELISA
con el Kit Newcastle Disease Virus Antibody
(IDEXX). En la cual se reportó como muestras
seropositivas a todas las aves con títulos superiores a 396 según las indicaciones del fabricante. Se realizó la prueba x2 para determinar
si existen diferencias significativas entre positivos y negativos utilizando el paquete estadístico Infostat (Di Rienzo et al., 2011).
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Aislamiento
del virus a partir de hisopados
cloacales
Los hisopados cloacales se inocularon en
embriones de pollo de 9-11 días de desarrollo,
libre de patógenos específicos (LPE). Se utilizaron a razón de 10 embriones por muestra
y se inocularon por la vía de la cavidad alantoidea con volumen de 0.25 mL por embrión.
Los embriones fueron incubados a 370C y
diariamente se chequeó su viabilidad. A las 72
horas post-inoculación, se cosechó el líquido
alantoideo y se realizaron dos pases ciegos
en embrión de pollo. Posteriormente a partir
del líquido alantoideo se realizó la prueba de
hemaglutinación (OIE, 2012).
Extracción de ARN Técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa – Reverso Transcriptasa
La extracción de ARN se realizó mediante el Ki
Viral RNA/DNA mini Kit (Invitrogen). Se realizó
la cuantificación del ARN viral en un equipo
Nano Drop (2000). La RT-PCR se llevada a
cabo con SuperScript® III One-Step RT-PCR
System with Platinum® Taq DNA Polymerase
(Invitrogen). Los cebadores utilizados para
determinar la presencia de NDV fueron ALLs
y Alle, mientras que para cepas virulentas
del virus se utilizó ALLs y AVLe (Wang et al.,
2001). Las reacciones de PCR se llevaron a
cabo con los mismos cebadores siguiendo las
condiciones descritas por Wang et al., 2001.
Los productos de PCR fueron visualizados en
geles de agarosa 1,5%.
Resultados
Detección de anticuerpos
Un total de 174 muestras fueron seropositivas
mediante el método de ELISA, lo que representa
un porcentaje del 49,7%, mientras que 176
resultaron seronegativas lo que representa
el 50,3% de las muestras colectadas. En la
figura 1 se puede observar que la parroquia
con mayor presencia de anticuerpos fue
Paletillas, así como la de menor presencia fue
la parroquia Bolaspamba.
En el Cuadro 1 se muestran los resultados
de la prueba x2 donde se observa que
solamente existen diferencias significativas
en la Parroquia Paletillas entre el número de
muestras positivas y negativas.
Figura 1. Presencia de anticuerpos contra el Virus de Newcastle en gallinas criollas en parroquias del cantón Zapotillo.
Aislamiento
cloacales
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del virus a partir de hisopados
Los resultados del aislamiento viral después
de 3 pases sucesivos realizados en embrión
de pollo revelaron que en 15 de las muestras
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Parroquias
Positivos
Negativos
X2
p-value 0,05
Garza Real
37
35
0.067
0.7958
Limones
23
37
2.6578
0.103
Cazaderos
22
26
0.2544
0.614
Mangahurco
26
31
0.3297
0.5658
Bolaspamba
21
32
1.877
0.1707
Paletillas
45
15
13.1606
0.0002
Cuadro 1. Comparación de los casos positivos y negativos por en las parroquias del cantón Zapotillo mediante prueba x2.
evaluadas se evidencia multiplicación viral,
lo que fue determinado por mortalidad
embrionaria con lesiones similares a las
producidas por NDV. Dichas muestras
resultaron positivas para la prueba de
hemaglutinación.
Determinación
Newcastle disease virus mediante técnica Reacción en Cadena de la Polimerasa – Reverso Transcriptasa
de la presencia
Se confirmaron 15 muestras positivas mediante
la RT-PCR con cebadores específicos para
Newcastle disease virus lo que representa
10,71%. Donde se obtuvo productos de
amplificación 362 (bp) en las parroquias
de Cazaderos, Garza Real, Mangahurco,
Paletillas y Bolaspamba. La RT-PCR para
determinar cepas patogénicas arrojó que 5
de las muestras son virulentas con cebadores
específicos, en las parroquias Cazaderos,
Garza Real, Paletillas y Bolaspamba.
Discusión
Las aves que presentaron títulos mayores
a 396 se consideran valores altos lo que
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sugiere una hipótesis de circulación viral
en estas aves con clínica compatible. Esto
puede atribuirse a factores como el sistema
de manejo de producción tradicional, porque
tienen pocas medidas sanitarias las cuales
favorecen la diseminación del virus; la continua
exposición a aves silvestres; las deficiencias
de la nutrición; la ausencia de control de la
enfermedad a través de la vacunación y el
contacto de aves no infectadas con aves
portadoras de patógenos.
En la parroquia Paletillas se presentan
diferencias significativas entre el número
de seropositivos y seronegativos, siendo
el porcentaje de positivos de 12,8%. Esta
parroquia es un lugar muy comercial, en
donde campesinos de las distintas cercanías e
incluso de Perú, acuden a este lugar a vender
sus animales, siendo estas aves de dudosa
procedencia que pueden ser portadores de la
enfermedad (Villacís et al., 20014).
Otra de las parroquias en las que se encontró
alta sero-prevalencia fue Garza Real (10,5%).
En cambio este lugar es preferido por aves
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la migratorias como garzas las cuales han
sido informadas como una de las especies
silvestres portadoras del virus. Las aves
domésticas pueden ser infectadas a través
del contacto con las heces fecales de las aves
migratorias (Severino, 2007).
Mediante la técnica de RT-PCR se logró
determinar la presencia del virus de Newcastle a
partir de muestras de campo, previo aislamiento
viral donde se evidencian amplificaciones de
la talla esperada según los descrito por Wang
et al., 2001. La ventaja de disponer de una
herramienta de diagnóstico como RT-PCR
permite revelar de forma rápida y específica
pequeñas concentraciones de ARN viral,
independientemente de la viabilidad del mismo.
El hecho de poder conocer si la cepa circulante
es patogénica o no es de gran importancia,
lo que está relacionado con lo descrito
por diversos autores quienes proponen la
detección específica y simultánea de las
diferentes cepas virales (Tiwari et al., 2004;
Zhang et al., 2010; Miller et al., 2010). Este es
el primer estudio de la detección molecular
del virus Newcastle en el Ecuador, lo que
contribuye de manera positiva al manejo de
la enfermedad.
Conclusiones
virulentas del virus.
Referencias bibliográficas
Di Rienzo, J.A., Casanoves, F., Balzarini, M.
G., Gonzalez, L., Tablada y M., Robledo, C.
W. 2011. Grupo InfoStat, FCA, Universidad
Nacional de Córdoba, Argentina. URL http://
www. infostat. com. ar.
International Committee on Taxonomy of
Viruses (ICTV). 2014. http://ictvonline.org/
virustaxonomy.asp
Miller, P.J., Decanini, E.L. y Afonso, C.L. 2010.
Newcastle disease: evolution of genotypes
and the related diagnostic challenges. Infect
Genet Evol. 10: 26-35.
Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE).
2012. Manual Terrestre de la OIE. Enfermedad
de Newcastle
Severino J. 2007. Migracao de aves: Influenza
aviaria e a doenca de Newcastle no Brasil.
En: Conferencia APINCO 2007 de Ciencia e
Tecnologia Avicola. Porto Alegre, Brasil.
Senne, D. A., King, D. J. y Kapczynski, D. R. 2004.
Control of Newcastle disease by vaccination.
Dev Biol (Basel).119:165-70.
Tiwaria, A. K., Katariaa, R. S., Nanthakumara,
T., Dashb, B. B. y Desa, G. 2004. Differential
detection of Newcastle disease virus strains
by degenerate primers based RT-PCR.
Comparative Immunology, Microbiology &
Infectious Diseases. 27: 163–169.
La parroquia con mayor sero-prevalencia en
el cantón Zapotillo es Paletillas.
Villacís, G., Escudero, G., Cueva, F. y Luzuriaga,
A. 2014. Aislamiento del virus de la enfermedad
de Newcastle en zonas rurales del sur del
Ecuador. CEDAMAZ. 4: 86-90.
Se determinó la presencia del virus de
Newcastle en las parroquias de Cazaderos,
Garza Real, Mangahurco, Paletillas y
Bolaspamba en el cantón Zapotillo en la
provincia de Loja.
Wang, Z., Vreede, F. T., Mitchell, J. O. y Viljoen,
G. J. 2001. Rapid detection and differentiation
of Newcastle disease virus isolates by a triple
one-step RT-PCR. Onderstepoort J Vet Res.
68:131-4.
Se obtuvo el aislamiento de quince cepas del
virus de Newcastle, cinco de las cuales son
patogénicas.
Se optimizó la técnica RT-PCR con cebadores
específicos para la detección de cepas
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