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UNIVERSIDAD
DE
COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
POSGRADO INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS
VIABILIDAD DE EMBRIONES BOVINOS CONGELADOS CON ETILENGLICOL
Y SEXADOS MEDIANTE TECNICAS DE MICROMANIPULACION Y BIOLOGIA
MOLECULAR
TESIS PARA OBTENER EL GRADO DE
MAESTRO EN CIENCIAS PECUARIAS
P R E S E N T A
M. V. Z. JOSE DE JESUS CARLOS FREGOSO AGUAYO
DIRECTOR DE TESIS
Ph. D. DANIEL A. F. VILLAGOMEZ ZAVALA
ASESOR DE TESIS
Ph. D. CARLOS G. GUTIERREZ AGUILAR
DR. ENRIQUE SILVA PEÑA
TECOMAN, COLIMA, NOVIEMBRE DEL 2005.
1
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
POSGRADO INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS
COORDINACIÓN DEL POSGRADO
INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Con base en el reglamento del Posgrado Interinstitucional en Ciencias Pecuarias, le
comunico que he revisado el trabajo de tesis del M.V.Z.. JOSÉ DE JESÚS CARLOS FREGOSO
AGUAYO, titulado:
VIABILIDAD DE EMBRIONES BOVINOS CONGELADOS CON ETILENGLICOL Y
SEXADOS MEDIANTE TÉCNICAS DE MICROMANIPULACIÓN Y BIOLOGÍA
MOLECULAR.
Que presenta el candidato en cuestión, como requisito parcial para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIAS PECUARIAS, a partir de lo cual considero que el trabajo cumple con
los requisitos para ser discutido en el examen de defensa de tesis, correspondiente. Por lo
anteriormente expuesto, otorgo mi voto aprobatorio.
Se extiende el presente a los 9 días del mes de noviembre de 2005, para los trámites
administrativos necesarios para el interesado.
ATENTAMENTE
ESTUDIA*LUCHA*TRABAJA*
DR. ENRIQUE SILVA PEÑA
PROFESOR INVESTIGADOR PICP.
c.c.p EXPEDIENTE.
2
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
POSGRADO INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS
COORDINACIÓN DEL POSGRADO
INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Con base en el reglamento del Posgrado Interinstitucional en Ciencias Pecuarias, le
comunico que he revisado el trabajo de tesis del M.V.Z.. JOSÉ DE JESÚS CARLOS FREGOSO
AGUAYO, titulado:
VIABILIDAD DE EMBRIONES BOVINOS CONGELADOS CON ETILENGLICOL Y
SEXADOS MEDIANTE TÉCNICAS DE MICROMANIPULACIÓN Y BIOLOGÍA
MOLECULAR.
Que presenta el candidato en cuestión, como requisito parcial para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIAS PECUARIAS, a partir de lo cual considero que el trabajo cumple con
los requisitos para ser discutido en el examen de defensa de tesis, correspondiente. Por lo
anteriormente expuesto, otorgo mi voto aprobatorio.
Se extiende el presente a los 9 días del mes de noviembre de 2005, para los trámites
administrativos necesarios para el interesado.
ATENTAMENTE
ESTUDIA*LUCHA*TRABAJA*
DR. CARLOS ENRIQUE IZQUIERDO ESPINAL
PROFESOR INVESTIGADOR PICP.
c.c.p EXPEDIENTE.
3
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
POSGRADO INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS
COORDINACIÓN DEL POSGRADO
INTERINSTITUCIONAL EN CIENCIAS PECUARIAS
FACULTAD DE MEDICINA VETERINARIA Y ZOOTECNIA
Con base en el reglamento del Posgrado Interinstitucional en Ciencias Pecuarias, le
comunico que he revisado el trabajo de tesis del M.V.Z.. JOSÉ DE JESÚS CARLOS FREGOSO
AGUAYO, titulado:
VIABILIDAD DE EMBRIONES BOVINOS CONGELADOS CON ETILENGLICOL Y
SEXADOS MEDIANTE TÉCNICAS DE MICROMANIPULACIÓN Y BIOLOGÍA
MOLECULAR.
Que presenta el candidato en cuestión, como requisito parcial para obtener el grado de
MAESTRO EN CIENCIAS PECUARIAS, a partir de lo cual considero que el trabajo cumple con
los requisitos para ser discutido en el examen de defensa de tesis, correspondiente. Por lo
anteriormente expuesto, otorgo mi voto aprobatorio.
Se extiende el presente a los 9 días del mes de noviembre de 2005, para los trámites
administrativos necesarios para el interesado.
ATENTAMENTE
ESTUDIA*LUCHA*TRABAJA*
Ph. D. DANIEL A. F. VILLAGÓMEZ ZAVALA
PROFESOR INVESTIGADOR PICP.
c.c.p EXPEDIENTE.
4
AGRADECIMIENTOS
Con infinita gratitud:
A la Universidad de Colima, a la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia y
especialmente al Posgrado Interinstitucional en Ciencias Pecuarias por brindarme la
oportunidad de realizar mis estudios de Posgrado.
Especialmente al Ph. D. Daniel A. F. Villagómez Zavala, por su gran apoyo, orientación para la
elaboración del proyecto de tesis y fundamentales comentarios que enriquecieron este trabajo.
Mi más sincero agradecimiento al Dr. Enrique Silva Peña, coordinador de posgrado de la
Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad de Colima y asesor de este
estudio, por su valioso tiempo, acertados y oportunos comentarios para el manuscrito final de este
trabajo.
Cordialmente al Ph. D. Carlos G. Gutiérrez Aguilar, jefe del departamento de Reproducción
Animal de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la UNAM, por su valiosa crítica al
presente estudio, asesoría y amistad.
Infinitamente al M. en C. Miguel Angel Ayala Valdovinos, del Instituto de Biotecnología
Animal del CUCBA de la Universidad de Guadalajara, por toda la disponibilidad y apoyo
incondicional para la culminación del presente estudio y gran amigo.
A los integrantes de mi H. Jurado: Ph. D. Daniel A. F. Villagómez Zavala, Dr. Enrique Silva
Peña, Dr. Carlos Izquierdo, quienes con su excelente calidad profesional realizaron valiosas
aportaciones en la revisión del presente trabajo.
Al Instituto de Biotecnología Animal del CUCBA de la Universidad de Guadalajara por la
disponibilidad de su personal e infraestructura para el desarrollo del proyecto de tesis.
Especialmente al Jefe del Laboratorio Ph. D. Daniel A. F. Villagómez Zavala y al M. en C.
Miguel Angel Ayala Valdovinos por su valioso asesoramiento en técnicas de biología Molecular
y sexaje embrionario.
5
A los propietarios y personal de las Ganaderías: Los Pinos, La Providencia, Los Eucaliptos,
El Raicero y El Mirador por su valiosa aportación con ganado y embriones para la realización
del estudio.
Al Instituto Tecnológico Agropecuario de Jalisco por facilitarme su infraestructura para
realizar la micromanipulación embrionaria.
. . . Gracias
6
CONTENIDO
Página
Agradecimientos ………………………………………………………………………..
vi
Contenido ………………………………………………………………………………..
vii
Indice de Cuadros ………………………………………………………………………. ix
Indice de figuras ………………………………………………………………………...
x
Siglas .................................................................................................................................. xi
Resumen …………………………………………………………………………………. xii
Abstract .............................................................................................................................. xiii
1. Introducción …………………………………………………………………….…….. 1
1.1. Reproducción Sexual …………………………………..……………………… 4
1.2. Importancia del sexo en la producción lechera …………………….…….…..... 4
1.3. Cromosomas sexuales …………………………………..…………………….
5
1.4. Secuencias de ADN de copia única del cromosoma Y ……………..………...
6
1.5. Transferencia de embriones (TE) bovinos …………………..……………..…
7
1.6. Selección de Donadoras y Receptoras …………………………..……………. 8
1.7. Tratamiento Superovulatorio ……………………..…………………………... 9
1.8. Mortalidad embrionaria ………………………………………………….…… 11
1.9. Colecta y manejo embrionario ………………………………………………..
11
1.10. Técnica de micromanipulación embrionaria ………..….…………….…....
12
1.11. Técnicas utilizadas para el diagnóstico del sexo …………………...….......
12
1.11.1 Técnica citológica ……………………………………………………..
13
1.11.2 Técnica inmunológica ………………………………………………… 14
1.11.3 Técnicas de biología molecular ……………………………………….
15
1.12. Sincronización del celo …………………………………………………….. 21
1.13. Transferencia de los embriones …...……………………………………….
21
1.14. Criopreservación embrionaria ……………...……………………………....
22
2. Planteamiento del Problema …………………………………….…………..….... 24
3. Justificación …………………………………………….…………….……………. 25
4. Hipótesis ………………………………………………….………………….…....... 26
5. Objetivos …………………………………………………….………………….......
7
27
5.1. Objetivo General …………………………………………………...…….....
27
5.2. Objetivos Específicos …………………………………………………….... 27
6. Materiales y Métodos …………………………………….………………………... 28
6.1. Animales …………………………………………….………………………. 28
6.2. Obtención de la biopsia ……………………………………………………... 29
6.3. Estandarización de la técnica de PCR ………………………………………. 30
6.4. Sexado de los embriones ……..…………………………………………….
30
6.5. Diagnóstico de preñez …………………………………..………………….
31
6.6. Modelo económico …………………………...……………………………. 31
7. Resultados ………………………………………………………………………...
32
8. Discusión ………………………………………...………………………………..
37
9. Conclusiones ……………………………………………………………………… 38
10. Literatura citada ..............……………………………………………………….
8
40
INDICE DE CUADROS
Página
Cuadro 1. Resultados de los tratamientos TW1, 2, 3 y 4 …………………….. 32
Cuadro 2. Análisis de costo:beneficio de TW1, 2, 3 y 4 ……………………... 33
Cuadro 3. Tasa de preñez después de biopsar los embriones y transferirlos …. 36
9
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Electroforesis de ADN bovino amplificado por PCR digerido
con PstI…………………………………………………………......... 34
Figura 2. Representación esquemática de electroforesis de ADN bovino
con amplificación de genes ZFY y ZFX por PCR y digerido
con PstI……………………………………………………………… 35
Figura 3. Fotografía del manejo del micromanipulador y microfotografía
del embrión ya biopsado mediante una microsección al trofoblasto… 35
10
SIGLAS
ACTH
Hormona Adenocorticotrópica (del inglés; Adrenocorticotropic Hormone).
ADN
Ácido Desoxiribonucléico.
BSA
Albúmina Sérica Bovina (del inglés; Bovine Serum Albumin).
CL
Cuerpo Lúteo.
DMSO
Sulfóxido de Dimetilo (del inglés; Dimethyl Sulfoxide).
DT
Transferencia Directa (del inglés; Direct Transfer).
ECG
Gonadotropina Coriónica Equina (del inglés; Equine Chorionic Gonadotrophin).
EG
Etilenglicol (del inglés; Ethylene Glycol).
FIV
Fertilización in vitro
FSH
Hormona Folículo Estimulante (del inglés; Follicle Stimulating Hormone).
IA
Inseminación Artificial.
LH
Hormona Luteinizante (del inglés; Luteinizing Hormone).
OIE
Oficina Internacional de Epizootias.
PCR
Reacción en Cadena de la Polimerasa (del inglés; Polymerase Chain Reaction).
RFLP
Fragmentos de Restricción de Longitud Polimórfica (del inglés; Restriction
Fragment Length Polimorphism).
TDF
Factor Determinante Testicular (del inglés; Testes Determining Factor)
TE
Transferencia Embrionaria o Transferencia de Embriones.
TP
Tasa de Preñez.
TSO
Tratamiento Superovulatorio.
W
Embrión (acuerdo de la Sociedad Internacional de Transferencia de Embriones).
11
Viabilidad de Embriones Bovinos Congelados con Etilenglicol y Sexados
Mediante Técnicas de Micromanipulación y Biología Molecular
Autor: Fregoso Aguayo José de Jesús Carlos
Comité Tutorial: Villagomez Z. Daniel A.F
Silva P. Enrique
Gutiérrez A. Carlos G.
RESUMEN
En el presente estudio se evaluó la viabilidad de los embriones (W) bovinos reflejada esta en tasa
de preñez (TP), la cual depende de un gran número de factores, los cuales han sido en los últimos
15 años cuidadosamente estudiados por numerosos investigadores, considerando el manejo
(higiene, medios, temperatura, congelación, biopsia para análisis genotípico múltiple como por
ejemplo: determinación del sexo preimplantación y otros marcadores genéticos mediante el uso
de PCR) que se da a el W desde la colecta hasta la transferencia, con el propósito de que los
ganaderos adopten estas biotecnologías en reproducción animal como una herramienta más en la
mejora genética y repoblación del hato. Regularmente dichos trabajos se realizan en regiones
diferentes a la nuestra, por ello fue pertinente medir la viabilidad del W calidad 1 de ganado
bovino lechero de la raza Holstein en nuestra región y realizar un análisis económico (costobeneficio) mediante 4 tratamientos embrionarios (TW) de n= 25 para cada uno, de la forma
siguiente: TW1: TP de W transferidos frescos; TW2: TP de W congelados con etilenglicol (EG) y
transferidos; TW3: TP de W biopsados y transferidos frescos y TW4: TP de W biopsados,
congelados con EG y transferidos. Los resultados de TW1, 2, 3 y 4 fueron de 52, 40, 24 y 20%
respectivamente, observando que TW1 y TW2, son entre 10 y 15% menores a lo reportado: para
TW3 y TW4 nuestros resultados son menores a lo reportado de 15 a 25%; por lo que el protocolo
de manipulación para TW3 y 4 deberá mejorarse. Por otro lado la tasa de costo-beneficio para
cada tratamiento TW1, 2, 3 y 4 fue de 1: 1.46, 1:1.35, 1:0.99 y 1:0.89 respectivamente. En
conclusión, estos resultados muestran que estas biotecnologías reproductivas son onerosas en
hatos lecheros de la raza holstein, con respecto al modelo de reproducción tradicional establecido
en nuestra región, y por lo tanto su uso a escala comercial deberá ser reconsiderado.
Palabras Clave: transferencia embrionaria, sexado de embriones, micromanipulación, viabilidad
embrionaria, bovinos.
12
Viability of Freezing Bovine Embryos with Ethylene Glycol and Sexed by
Micromanipulation and Molecular Biology Techniques.
Author: Fregoso Aguayo José de Jesús Carlos
Tutorial Committee: Villagomez Z. Daniel A.F
Silva P. Enrique
Gutiérrez A. Carlos G.
ABSTRACT
In this research, the bovine embryos viability (W), after embryo transfer, related to pregnant rate
(PR), was evaluated. PR after embryo transfer depends on a number of factors which has been
under study for a number of researchers during the last fifteen years, considering sanitary
management, culture media, temperature, freezing and biopsy of embryos to determine multiple
genotype (required to establish pre-implantation sex or other genetic markers by PCR). All these
protocols from recovery to the final embryo transfer have to be reproducible and profitable, with
the purpose that this animal biotechnology may be adopted for the livestock breeders, as a tool for
breeding and genetic improvement. Most of those researches have been carried out in places
with different characteristics that we have in México, therefore is important to know the W values
specifically in the west México region (Jalisco, Colima and Nayarit). With the objective to
determine PR after embryo transfer, one hundred Holstein dairy cows were distributed in four
treatments groups (TW) with n=25 each; the groups according to the embryos transferred were as
follows: TW1 (fresh embryos), TW2 (ethylene glycol freezing embryos), TW3 (fresh and biopsy
embryos) and TW4 (fresh, biopsy and freezing embryos). The PR observed for TW1, 2, 3 and 4
were 52, 40, 24 and 20 % respectively. Comparing these results with other previously reports, it is
evident that treatments TW1 and TW2, TW3 and TW4, were 10-15 % and 15-25 % lower,
respectively. Therefore, the manipulation protocol for TW3 and TW4 has to be improved. On the
other hand, the cost-profit rate for each treatment was 1:1.46, 1:1.35, 1:0.99 and 1:0.89,
respectively. In conclusion, these results show this biotechnologies are expensive in Holstein
dairy cattle, with respect to the traditional reproductive model established in the west México
region, and therefore, its use has to be reconsidered at commercial scale.
Key words: embryo transfer, embryo sexing, micromanipulation, embryo viability, cattle.
13
1. INTRODUCCION
Desde inicios de la civilización, la población de genes en los animales domésticos fue
pasivamente modificada por la selección de individuos basada en criterios de producción,
fertilidad, comportamiento o estéticos, siendo el cimiento para las generaciones próximas. Con el
descubrimiento de las leyes de Mendel, este arte de la ganadería sería una ciencia en la
modificación lenta y pasiva de los fenotipos de animales domésticos.
Uno de los principales parámetros en la producción de animales domésticos es el fenotipo sexual
que puede ser manipulado por medios biotecnológicos. En recientes años, la clonación molecular
ha tenido avances rápidos en la identificación de genes involucrados en la determinación y
diferenciación del sexo. La clonación de células de embriones ha proporcionado nuevos medios
para identificar a temprana edad embrionaria el posible fenotipo sexual de un individuo. Estos
desarrollos ahora permiten considerar el fenotipo sexual como un potencial para mejorar la
producción del ganado (34).
Con el propósito de mejorar la calidad genética de individuos en la ganadería se han realizado
cruzas de individuos con características hereditarias selectivas, procedimiento que ha sido
utilizado desde hace mucho tiempo. Sin embargo, los cruzamientos naturales en algunos casos
han sido desplazados por técnicas reproductivas como la inseminación artificial (IA) que tiene la
ventaja primordial de disminuir los costos involucrados, considerando la selección única de un
macho para la obtención de un gran número de progenies de alto valor genético. Esta técnica ha
sido combinada con la técnica de transferencia de embriones (TE), donde se utilizan
procedimientos para que de hembras superovuladas e inseminadas se obtengan embriones que
pueden ser transferidos en fresco o almacenados por congelación para su posterior transferencia a
hembras receptoras con el propósito de contribuir a multiplicar una población seleccionada.
También en recientes avances de la biología de la reproducción, la técnica de fertilización in vitro
(FIV) ha tenido gran importancia para la obtención de embriones, buscando el mismo propósito
que en la TE (50)
Estos tipos de procedimientos han tenido varias ventajas, tales como el gran rendimiento
reproductivo. No obstante, una de las importantes limitantes es el desconocimiento que se puede
tener del sexo del producto obtenido al final de la gestación, aunque este es determinado desde el
14
momento de la fertilización; así es que, al desconocer el sexo del embrión transferido se obtiene
un resultado sexual impredecible que puede ocasionar pérdidas económicas al productor.
Para resolver estas limitaciones se ha propuesto diagnosticar el sexo del embrión y viabilidad
antes de su transferencia, permitiendo de esta manera, programar el nacimiento de hembras o
machos y así obtener los beneficios en la comercialización y explotación del ganado. Un ejemplo
de esto, es la pre-selección de progenies de hembras en la industria lechera, donde se obtendrían
beneficios si los embriones se sexaran rutinariamente antes de ser transferidos a hembras
receptoras. Es decir, la disponibilidad de sexar embriones en la producción láctea, permitiría la
selección de la descendencia para sus estirpes de embriones que posean características deseables,
tales como el incremento de la producción láctea y calidad (sólidos) de la misma, reducción del
costo de los reemplazos e incremento del tamaño del hato (55).
El sexado de embriones, es un procedimiento donde se diagnostica el sexo de embriones antes de
que estos sean transferidos a hembras que llevarán a término su gestación. Para esto, en las
últimas décadas se han desarrollado varios métodos para realizar el diagnóstico, pero algunos han
sido limitados e inespecíficos. En recientes reportes, se han utilizado métodos de biología
molecular donde al analizar genes específicos del cromosoma Y en el ADN de un animal,
identifica el sexo de un individuo especialmente en mamíferos, en los cuales, el sexo puede ser
determinado por la identificación de secuencias de ADN que están asociadas específicamente con
el cromosoma Y (43, 44).
Varios investigadores han identificado secuencias de ADN en bovinos que están exclusivamente
en el ADN del macho. Estas secuencias se han utilizado como sondas de ADN para el sexado de
embriones y fetos por tener la propiedad de hibridar con el ADN del macho (6).
De manera que con el advenimiento de la identificación de secuencias de ADN específicas del
cromosoma Y se han logrado grandes avances para identificar el sexo de los embriones
preimplantados, pero, la viabilidad del embrión por la micromanipulación y manejo para la
obtención de la biopsia en muchos casos es incierta (62).
El programa reproductivo del hato constituye un componente básico de toda explotación de
bovinos lecheros, las tecnologías reproductivas antes mencionadas, permiten hacer más eficiente
15
la reproducción animal (15, 16, 18, 19); sin embargo, el manejo de la donadora y receptora así
como del embrión al congelarlo o tomarle biopsia para sexado o determinación de genes de
importancia económica, influyen en forma determinante en la viabilidad de este (56).
Actualmente la industria lechera se maneja con una baja confiabilidad en el valor genético de los
animales jóvenes debido a que los registros de los animales no están disponibles o no se cuenta
con un número suficiente de observaciones, mermando esto la eficiencia reproductiva y
productiva del hato (53).
Por otra parte, en lo referente a la determinación del sexo de los embriones (W) previo a su
transferencia, varios métodos han sido descritos (1, 2, 3, 29, 34, 43, 54, 55, 56, 57, 61), algunos
incluyen técnicas no invasivas pero muy tardadas, como por ejemplo, detección de antígenos
específicos de macho, actividad enzimática específica del cromosoma X, e invasivas como el
análisis citogenético o el uso de sondas de ácido desoxiribonucléico (ADN) con una eficiencia de
alrededor del 95% y confiabilidad de hasta el 98% (4, 8, 10, 19, 24, 26) y que específicamente
identifican y amplifican mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y el análisis de
fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP´s) regiones particulares de los
cromosomas sexuales permitiendo en forma rápida y confiable la detección del sexo de aquellos
embriones que de acuerdo a la especie animal en cuestión tendrán mucho mayor valor económico
al nacimiento. Así pues, la IA y la TE, aunadas a la FIV, bipartición y el sexado de los embriones,
permiten eficientar al máximo la capacidad reproductiva de los animales pie de cría (52).
Estas tecnologías han permitido a los criadores de ganado compartir su germoplasma más valioso,
tanto local como internacionalmente sin perder su base genética. El movimiento de embriones
también proporciona una alternativa más humana a los métodos estresantes del transporte de los
animales vivos. La investigación y la experiencia han mostrado, de acuerdo a la Oficina
Internacional de Epizootias (OIE) de la Organización Mundial para la Salud Animal, que la
transferencia de embriones producidos in vivo es un método muy seguro para prevenir la
introducción de enfermedades infecciosas en poblaciones no infectadas. Debido a la resistencia
primaria proporcionada por la zona pelúcida, es muy poco probable que los embriones producidos
in vivo sean portadores de agentes patógenos (49). Además, la exposición potencial de los
embriones a los agentes patógenos está reducida por factores como la fase temprana de desarrollo,
su pequeño tamaño y su limitada movilidad. El confinamiento de las donadoras limita su
16
exposición a los agentes infecciosos y proporciona la oportunidad de realizar análisis antes,
durante y después de la colecta de los embriones. Los resultados de estas pruebas pueden
evaluarse antes de que los embriones sean transportados y transferidos a receptoras.
1.1. REPRODUCCIÓN SEXUAL
La reproducción sexual es la base de la vida multicelular que se da por la unión de dos eventos
biológicos: reproducción, que es la renovación de individuos entre generaciones; y el sexo, como
la recombinación de genes. La reproducción como una acción genética pasiva ocurre entre cada
generación, asegurando la posible variedad de combinaciones genéticas que pueden ocurrir dentro
de una población de individuos de una especie, un rasgo deseable para asegurar la sobrevivencia
de una especie (45). El enfoque central de la reproducción sexual radica en los mecanismos
moleculares y de desarrollo que son específicos para la determinación de los dos morfotipos
(macho y hembra). En mamíferos la determinación del sexo se basa en un gen llevado sobre el
cromosoma Y, y por ende, la segregación mendeliana de los cromosomas sexuales (X y Y)
durante la espermatogénesis, asegurando que el 50% del esperma lleve cromosomas X y el 50%
lleve cromosomas Y, por lo que aproximadamente el 50% de los embriones resultarían en
individuos macho y el 50% resultarían en individuos hembra (12).
1.2. IMPORTANCIA DEL SEXO EN LA PRODUCCIÓN LECHERA
En sistemas de producción de leche es importante tener un control de la proporción del sexo de
los animales, donde se busca favorecer concepciones más altas y el nacimiento de animales de
sexo femenino, sin embargo, en estos sistemas se presentan gestaciones no deseables que son las
del sexo masculino. Por otro lado, en sistemas de producción de carne los animales del sexo
masculino son generalmente más ventajosos. Para controlar el sexo de los nacimientos se ha
tenido el interés de realizar el diagnóstico del sexo antes del nacimiento de los individuos, donde
el sexado de fetos comúnmente puede efectuarse después de la implantación vía ultrasonido, pero
este método resulta dar un diagnóstico sexual en una etapa tardía de la gestación proporcionando
gastos innecesarios para la producción (55). Sin embargo, se puede realizar el sexado antes de la
transferencia o implantación de embriones por métodos moleculares de ADN, en donde al sexar
17
embriones preimplantados en técnicas de TE la selección del sexo puede tan pronto como sea
posible llegar a ser comercialmente aprovechable. Por lo tanto, al considerar los métodos
moleculares en la selección del sexo en bovinos lecheros es importante considerar el enfoque de
los cromosomas sexuales X y Y y la expresión de los genes.
1.3. CROMOSOMAS SEXUALES
En todas las especies de mamíferos los machos son heterogaméticos, conteniendo un cromosoma
sexual X y un cromosoma sexual Y (presentan espermatozoides haploides con un cromosoma X ó
un cromosoma Y), mientras que las hembras son homogaméticas conteniendo dos cromosomas
sexuales XX, así cada ovocito contiene un cromosoma X (42).
Tanto el cromosoma X como el Y, se dividen en brazos cortos (Xp y Yp) y en brazos largos (Xq y
Yq). La parte distal de Xp y de Yp presentan regiones homólogas, al igual que una de
recombinación (42). Los loci comunes entre Xp y Yp permiten recombinaciones frecuentes como
un evento normal durante la meiosis del macho, intercambiando material genético en un lugar
denominado “Región Pseudoautosómica”.
Para el entendimiento de la organización y comportamiento de los cromosomas X y Y en la
determinación del sexo, se parte de que estos, están altamente diferenciados, donde el cromosoma
X es más grande y contiene de tres a cuatro mil genes; siendo que la mayoría no tienen un papel
particular en la determinación sexual y están sujetos a la inactivación. El cromosoma Y es más
pequeño pero presenta genes que son primordiales para la determinación del sexo y por ende el
desarrollo gonadal de un individuo. Específicamente, el cromosoma Y de bovino representa
alrededor del 2.1% del total del genoma haploide. Se asume que aproximadamente el 50% de Y
es específico del macho; por lo que la parte específica de Y podría ser el 1% del total del genoma
del macho (38).
1.4. SECUENCIAS DE ADN DE COPIA ÚNICA DEL CROMOSOMA Y
El SRY es un gen que está representado únicamente sobre el cromosoma Y, no existiendo
secuencias homólogas de este en el cromosoma X. Esta característica marcó a SRY como un
blanco ideal para ser usado en métodos de diagnóstico sexual y para la selección fenotípica
18
sexual. Se menciona (44) que SRY por tener características similares de conservación entre
especies puede ser utilizado como un marcador en el diagnóstico sexual de bovinos, ovinos y
caprinos. En base a lo anterior se propone (55) determinar el sexo genético a partir de ADN de
muestras embrionarias de bovinos utilizando sondas de ADN de SRY e iniciadores derivados de
secuencias de ADN de bovino. Los mismos autores revelan que SRY de bovino es de 1,644 pb
compuesto de una región promotora no codificada de 5´ de 911 pb, un codón de iniciación ATG,
un marco abierto de lectura (ORF; del inglés Open Reading Frame) de 688 pb, un codón de paro
TAG y secuencias no codificadas 3´ de 45 pb. En concordancia a lo expuesto, se propusieron
sondas de ADN para la amplificación de ADN por PCR para diagnosticar el sexo de embriones
de bovino a partir de un par de iniciadores externos diseñados para amplificar entre 300 y 400 pb
de las secuencias de ADN centrales de SRY de bovino alrededor de HMG (grupo de alta
movilidad; del inglés High Mobility Group) y además, un par de iniciadores internos diseñados
para amplificar entre 200 y 300 pb .
Por otra parte, el gen ZFY está presente no solo en el cromosoma Y, sino que tiene un homólogo
(región pseudoautosómica) en el cromosoma X (gen ZFX), dado su polimorfismo se ha utilizado
para determinar el sexo en diferentes especies incluyendo bovinos, a través de la detección de los
genes SRY y ZFY por medio de PCR, utilizando el locus DXNd3 (microsatélite polimórfico
localizado en el cromosoma Y del ratón) como una secuencia control de amplificación (23).
Se tiene alta sensibilidad para el diagnóstico del sexo por PCR a partir de biopsias utilizando 5 a
10 blastómeros en etapa de blástula y un primer par de iniciadores para la amplificación del
segmento original entre ZFX/ZFY en una primera reacción; una segunda amplificación con el uso
de un par de iniciadores anidados para proporcionar un segundo fragmento interno para el primer
fragmento amplificado y utilizando adicionalmente la enzima de restricción Pstl que es capaz de
cortar el segundo fragmento amplificado del ADN del cromosoma sexual, cuando es un
cromosoma Y, y no es capaz de cortar cuando es un cromosoma X (17).
1.5. TRANSFERENCIA DE EMBRIONES (TE) BOVINOS
La transferencia de embriones es una técnica para el mejoramiento genético del ganado bovino,
que consiste en provocar que una vaca o vaquilla “Donadora”, mediante un tratamiento
hormonal e inseminación artificial con semen de un toro probado con un alto valor genético,
19
produzca varios embriones que siete días después le son extraídos del útero para ser transferidos a
otras hembras “Receptoras”, que previamente fueron sincronizadas con el celo de la donadora.
La receptora no transmite ninguna característica genética a la cría y solo sirve para mantenerla
hasta el parto y durante la lactancia (16).
Las primeras transferencias de embriones en vacas fueron realizadas en 1949 por Umbaugh,
usando técnicas quirúrgicas , pero ninguna de las tres receptoras que empleó llevó a término la
gestación. En ese mismo año se publicó el primer diseño de instrumental para realizar la
recolección no quirúrgica de embriones, aunque no sería sino hasta 25 años después que dicho
método se empezaría a usar en forma rutinaria. Mientras tanto, las donadoras seguirían siendo
sometidas a cirugía para obtener sus embriones (53).
La transferencia de embriones ha tenido enormes avances a nivel comercial desde la década de
1970, especialmente con bovinos. Las primeras compañías comerciales surgieron en Inglaterra,
Canadá, Estados Unidos y Japón. El primer becerro de registro logrado en Estados Unidos con la
técnica fue logrado en la Compañía Río Vista en 1972 por Kraemer y Dula (50).
La transferencia de embriones dio un gran paso con la salida al mercado de las prostaglandinas
como sincronizadores de estro y en 1974 el número de preñeces comerciales en bovinos de
Norteamérica aumentó a 3,000, cifra que en 1976 se incrementó a 5,000 gracias al
perfeccionamiento desde 1970 de las técnicas no quirúrgicas de recolección embrionaria (52),
dando pauta a las usadas en la actualidad. En 1978 se empiezan a obtener resultados alentadores
con la transferencia no quirúrgica y el número de preñeces se duplica a 10,000 (53).
En nuestro país, las primeras transferencias de embriones bovinos se realizaron en 1978 por
técnicos americanos. El 26 de Febrero de 1979 se inauguró en Ajuchitlán , Querétaro, la clínica
de Transferencia de Embriones, dependiente del Instituto Nacional de Inseminación Artificial y
Reproducción Animal de la Secretaría de Agricultura y Recursos Hidráulicos. La primera cría
viva obtenida ahí a partir de un embrión transferido fresco fue una Holstein nacida el 12 de
Marzo de 1980, y la primera con un embrión congelado, fue una becerra de la raza Salers nacida
el 11 de Marzo de 1987 (SAGARPA, 2000).
20
La sociedad Internacional de Transferencia de Embriones (IETS por sus iniciales en inglés),
realiza encuestas a nivel mundial entre sus afiliados para conocer el número de donadoras
recolectadas, embriones obtenidos in vivo e in vitro, embriones congelados, embriones
transferidos en fresco o después de descongelar, embriones bipartidos y embriones sexados en las
diferentes especies domésticas y exóticas; documentando en el año 2003 a nivel mundial 600,000
embriones transferidos; México participó con el 1% de los embriones transferidos a nivel mundial
(16).
En condiciones normales, cada vaca produce una sola cría al año, lo cuál significa que cuando
mucho producirá 6 a 8 crías durante su vida. A través de la IA se pueden obtener miles de crías de
un toro ; con la TE han llegado a tener más de cien crías de una vaca durante su vida productiva,
lo cual facilita el mejoramiento genético, con el consecuente incremento de la producción de
leche y/o carne (59).
Con la ayuda de la bipartición de embriones se pueden obtener partos gemelares y aumentar la
cosecha de crías, sin el riesgo de obtener hembras estériles (freemartin) ya que ambas crías, por
proceder del mismo embrión, serán del mismo sexo (2).
1.6. SELECCIÓN DE DONADORAS Y RECEPTORAS
Una buena donadora debe tener tres cualidades: 1) buena fertilidad; 2) alta demanda y valor
económico y 3) ser genéticamente superior. Los mejores embriones producidos provienen de
vacas con buena historia reproductiva, la rentabilidad de un programa de transferencia de
embriones dependerá de la demanda y valor económico de estos embriones, también la
justificación del programa se sustenta en su contribución al incremento en el hato de hembras
genéticamente superiores.
Para elegir las donadoras en el hato lechero habrá que combinar los siguientes rasgos: producción
de leche, clasificación de la vaca en función del prototipo de la raza, buena historia reproductiva
referente a servicios por concepción, edad al primer parto y dificultad al mismo, preferentemente
que ya hayan completado su primer lactancia o bien que tengan suficientes datos de producción y
21
tipo para proyectarse al estado maduro, y ser esto la referencia que de la pauta del toro a usar para
la reproducción.
La receptora ideal es aquella vaca que tiene cruza de ganado lechero con cárnico de talla media a
grande, saludables, vacunadas contra enfermedades abortivas, jóvenes y con buen historial
reproductivo y en balance energético positivo.
La relación entre nutrición y eficiencia reproductiva en ganado lechero bajo condiciones de
campo es mucho menos clara que bajo condiciones experimentales. Bajo condiciones de campo
deficiencias nutricionales, excesos o desbalances se dan en forma específica con algunos
componentes de la dieta, ya sea por enfermedades, estrés, condiciones medioambientales,
genéticas y prácticas de manejo incorrectas. De acuerdo a varios autores (5, 32, 53), la respuesta
al tratamiento superovulatorio en donadoras se mejora controlando el consumo de alimento de
acuerdo a las tablas del NRC (Consejo Nacional de Investigación; del inglés, Nacional Research
Council) al igual que en receptoras desde 60-70 días antes de la colecta o transferencia
embrionaria respectivamente y pasado ya el periodo crítico de balance energético negativo.
1.7. TRATAMIENTO SUPEROVULATORIO (TSO)
Esta parte del proceso de la técnica de transferencia embrionaria ha sido objeto de muchas
investigaciones durante los últimos 50 años, y ha sido de suma importancia en el desarrollo
comercial de la transferencia embrionaria en bovinos (50).
Las primeras descripciones de superovulación se remontan a 1927 hechas por Smith y Engle,
quienes usaron extractos pituitarios anteriores aumentando con ello hasta cuatro veces la tasa de
ovulaciones en ratas y ratones.
Posteriormente, estudios demostraron que el suero sanguíneo de yeguas preñadas inducía
múltiples ovulaciones en ratas, estableciendo las bases para el uso de gonadotropinas en TSO en
bovinos.
22
Existen factores que determinan la efectividad de la inducción de múltiple ovulación en el
bovino, algunos de los cuales son: 1) la gonadotropina empleada y la vía de administración; 2)
tratamientos hormonales colaterales y 3) donadora e influencias medio ambientales (51).
Numerosas comparaciones entre diferentes gonadotropinas comerciales han sido realizadas en los
últimos 30 años, resultando más efectivas para los TSO, aquellas que tienen bien definida la
cantidad de FSH y sobre todo el mínimo contenido de LH.
Demostrado está que al aplicar dosis excesivas de FSH se suprime la ovulación totalmente (53).
La mayoría de los investigadores coincide en que la respuesta al TSO en ganado lechero es más
eficiente cuando son seleccionados los folículos a desarrollar después del período crítico de
balance energético negativo, el cual se da en las primeras semanas de lactación. También es
recomendable el monitoreo de los niveles de nitrógeno en la ración, ya que altos niveles de
proteína y energía en la dieta deprimen la respuesta a la superovulación; sugiriéndose siempre dar
la ración en forma controlada y no ad libitum.
Cuando se han administrado dietas altas en energía, se ha afectado adversamente la respuesta
ovárica y la calidad embrionaria (16, 53). Investigadores franceses recomiendan como óptimo
para la producción y calidad de embriones viables un plan nutricional para las donadoras en el
cual ganen un kilogramo de peso vivo diariamente, desde 4 semanas antes de empezar el TSO.
La presencia de un cuerpo lúteo (CL) funcional debe ser verificado por palpación transrectal,
ultrasonografía o por análisis de progesterona antes de iniciar el TSO, el cual no se prescribirá en
dosis excesivas de gonadotropinas, ya que la sobrestimulación puede producir un aumento
excesivo del tamaño de los ovarios, el fracaso para recuperar embriones transferibles y el retraso
del retorno de la donante al ciclo estral normal.
El efecto del semen sobre el desarrollo embrionario y viabilidad ha sido estudiado y se indica que
aunque la diferencia en tasas de fertilización entre diferente semen de diferentes toros no es
significante, la producción de blastocitos si difiere significativamente (53, 59).
1.8. MORTALIDAD EMBRIONARIA
Después del apareamiento y ovulación, el ovocito es fertilizado en la región del ámpula del
oviducto y llega al útero 72-84 h después. El blastocito se forma cuatro días después, y por el día
23
nueve de gestación sale de la zona pelúcida, para el día 16 ó 17 de gestación se reconoce esta y
desde el día 22 de gestación se adhiere el embrión al endometrio. El tamaño del embrión y
contenido protéico se incrementa en forma muy importante desde que sale de la zona pelúcida
hasta el reconocimiento de la gestación (46, 49).
La mortalidad embrionaria ha sido reconocida ampliamente como la mayor fuente de pérdida de
preñez en bovinos. La tasa de fertilización postservicio es de alrededor del 90% mientras que el
promedio de nacimientos a partir de un servicio es menor al 50%, siendo la gran mayoría de estas
pérdidas por mortalidad embrionaria que se da entre el día 8 y 18 postservicio sin alterarse el
intervalo entre estros. Entre el día 18 y 50 postservicio mueren entre el 10 y 15% de los
embriones. Desde el día 50 postservicio hasta el término de la gestación ocurre muerte fetal del 5
al 8% (14, 46).
Los factores más importantes asociados a la mortalidad embrionaria son: edad del animal, estrés,
génicos, anormalidades cromosómicas, nutricionales, endócrinos, medio ambientales internos y
externos.
1.9. COLECTA Y MANEJO EMBRIONARIO
Los embriones son colectados de acuerdo al protocolo no quirúrgico estándar (16. 53), el día 7
después del estro. En el proceso se destaca la absoluta limpieza y esterilidad de los medios y
objetos que tengan contacto con los embriones. Una vez realizada la colecta, el medio obtenido se
lleva inmediatamente al laboratorio para la recuperación, evaluación, lavado, manipulación y
congelación de los embriones. En este proceso todas las superficies de trabajo deben permanecer
completamente limpias y secas; en el ambiente no debe haber insectos, el humo, polvo, aerosoles,
desinfectantes e insecticidas se acumulan rápidamente en el vidrio, plástico y superficies, y
también serán absorbidas por los medios; la luz del día y la luz ultravioleta en particular dañan a
los embriones (49).
1.10. TÉCNICA DE MICROMANIPULACIÓN EMBRIONARIA
Durante el desarrollo inicial del embrión, existe un período durante el cual este puede ser
separado a propósito en mitades o biopsado sin reducirle de manera drástica la probabilidad de
24
desarrollarse posteriormente en un feto; no obstante, cuando los embriones son seccionados antes
de la blastulación, el número de células y la talla de los blastocitos resultantes son afectados. La
técnica de PCR requiere de una muestra de ADN de un embrión preimplantado, la cual se puede
obtener por un número existente de métodos, siendo crucial para cualquier técnica donde la
biopsia no afecte adversamente el desarrollo potencial del embrión (56).
En embriones de humano y de ratón se han efectuado varios métodos para perforar la zona
pelúcida y remover células de embriones preimplantados como el uso de soluciones acidificadas,
por aspiración usando una fina micropipeta y por biopsias de blastómeros para no afectar el
subsecuente desarrollo embrionario (26).
El método más utilizado para la toma de la biopsia de embriones bovinos, se basa en utilizar un
microbisturí y al mismo tiempo el embrión se mantiene con succión ligera mediante el uso de un
micromanipulador asociado a un microscopio de fase invertida (2).
El sexo de embriones bovinos puede determinarse luego después de la colecta mediante la
obtención de una pequeña biopsia (5 a 10 blastómeros) de este. A partir de la biopsia, usando
PCR
se detecta la presencia de un segmento específico de ADN el cual corresponde al
cromosoma Y (58).
1.11. TÉCNICAS UTILIZADAS PARA EL DIAGNÓSTICO DEL SEXO
El sexo de un individuo es el proceso de desarrollo donde inicialmente las gónadas embrionarias
bipotenciales se diferencian en testículo u ovario, dando lugar a la adquisición del fenotipo
sexualmente dimórfico que es un evento crítico en el desarrollo de mamíferos a través de la
maduración de la función sexual y sucesos reproductivos después del nacimiento.
Temporalmente, estos pasos pueden ser divididos en dos fases: la determinación sexual, evento
inicial que determina si las gónadas se desarrollarán como testículos u ovarios; y la diferenciación
sexual, evento subsiguiente que produce finalmente cualquier fenotipo sexual de hembra o macho
(39).
25
En términos genéticos, el espermatozoide es el que determina el sexo ya que al penetrar un
espermatozoide (X o Y) en el ovocito, se da la fertilización y en ese mismo momento queda fijo
el sexo genético de un cigoto. El sexo gonadal y fenotípico se determinan posteriormente, pero
solo rara vez, estos difieren del sexo genético. Al tener un cierto número de cromosomas X por
célula y con la presencia de un cromosoma Y se desarrollarán testículos XY, XXY y XXXY; y en
la ausencia de Y se desarrollarán ovarios XO, XX, XXX y XXXX. Por lo que el papel del
fenotipo sexual (masculino o femenino) está correlacionado con la presencia (en machos) o la
ausencia (en hembras) del cromosoma Y (42). De esta manera, el fenotipo masculino de
mamíferos puede ser considerado una característica genética dominante ligada al cromosoma Y
con una correlación de genotipo-gónada-fenotipo. Esto lleva al supuesto de que sobre el
cromosoma Y se encuentra el “factor determinante testicular” (TDF; siglas en inglés de Testes
Determining Factor), o también “región que determina el sexo”.
1.11.1. Técnica citológica
Un primer método para el sexado de embriones fue a nivel citológico, donde se examinaron
células de blastocistos de conejo para la detección del cuerpo de Barr (20). Una biopsia contenía
de 200 a 300 células que fueron tomadas con la ayuda de un micromanipulador. Las células
fueron fijadas y teñidas sobre un portaobjetos con acetato de orceína al 1%, examinadas dentro de
pocos minutos y marcadas para la presencia o ausencia del cuerpo de Barr. De los 109
blastocistos, sexados y transferidos, 18 sobrevivieron al término de la gestación. Por lo tanto, la
técnica fue altamente segura para realizar el diagnóstico del sexo, aunque el porcentaje de
sobrevivencia embrionaria fue relativamente baja.
En 1976, Hare et al. utilizaron un método por el cual fueron removidas células trofoblásticas de
embriones de bovino de 14 y 15 días de edad y preparadas para evaluar los cromosomas sexuales,
obteniendo resultados poco satisfactorios en la precisión del método, ya que solo el 58% de los
embriones pudieron ser sexados con certeza, el 8.8% con resultados ambiguos y el 32.4% de los
embriones no fue posible realizarles el sexado (22).
El refinamiento del procedimiento anterior, incluyó la remoción de pocas células a partir de
mórulas para el análisis de los cromosomas sexuales. La seguridad del sexado para la remoción
de 8 a 17 células fue de 30 a 60%. Sin embargo, este tipo de procedimiento no puede ser aplicable
a embriones de todos los animales domésticos, debido a la naturaleza granular del citoplasma con
26
un material nuclear oscuro, de este modo, hace difícil la identificación del cromosoma X inactivo
(22). Además, se menciona que algunos embriones femeninos pueden ser diagnosticados
erróneamente como masculinos, debido a la ausencia del cuerpo de Barr, posiblemente la
ausencia sea porque no se haya llevado a cabo la inactivación completa del cromosoma X.
Asimismo, el método puede ser poco confiable, con una baja precisión y con un alto riesgo de
perder la viabilidad embrionaria; debido a que el método es muy laborioso ya que se involucran
procedimientos como: colecta de células en metafase, disociación de células, propagación de las
células, su fijación, disociación celular, adherencia celular, tinción de Giemsa 4% y evaluación
microscópica para el diagnóstico del sexo (30).
1.11.2. Técnica inmunológica
Un método para la selección sexual fue estudiado por medio de la detección inmunológica de un
factor (antígeno) que es específicamente expresado por los embriones masculinos y no por los
embriones femeninos, siendo este factor H-Y (60).
En 1984 se propuso el uso del anticuerpo monoclonal H-Y en un sistema de fluorescencia. Para
esto, los embriones fueron expuestos a un anticuerpo (H-Y) primario. Después de la incubación,
los embriones fueron expuestos a un anticuerpo secundario, para finalmente ser visualizados bajo
microscopio fluorescente. Los fenotipos H-Y presuntivos fueron asignados sobre las bases de los
blastómeros embrionarios fluorescentes (H-Y+ ) diagnosticados como machos o no fluorescentes
(H-Y) diagnosticados como hembras. Estos resultados sugirieron que este tipo de método, podría
ser usado para el diagnóstico temprano del sexo en embriones de bovino, realizando algunas
modificaciones del método. Sin embargo, es de considerar que la diferenciación gonadal del
macho puede también ocurrir en la ausencia del antígeno H-Y, porque su expresión no se requiere
para el desarrollo testicular y por lo tanto, la presencia del antígeno H-Y no garantiza que la
gónada XX se someterá al desarrollo testicular (37). Por lo anterior, se deduce que el utilizar H-Y
como un método de sexado a nivel embrionario no garantiza la especificidad del diagnóstico.
1.11.3. Técnicas de biología molecular
Se han utilizado técnicas de biología molecular para aislar secuencias de ADN específicas del
cromosoma Y bovino con el objeto de predecir el sexo embrionario por cuatro rutas
metodológicas: Hibridación in situ, Southern blot, Dot blot o por ensayos basados en PCR.
27
Para la identificación y para el aislamiento de las secuencias del ADN, inicialmente se utilizó un
método simple basado en el análisis de enzimas de restricción de muestras de ADN de macho y
hembra con la esperanza de localizar fragmentos repetitivos específicos de macho, La primera
secuencia obtenida y específica del cromosoma Y humano (DYZ-1) fue clonada usando este
método (11). Subsecuentemente, se desarrolló la técnica de hibridación que permitió la
búsqueda de secuencias específicas del macho. Este procedimiento fue descrito originalmente en
una biblioteca genómica de ratón en un bacteriófago Lambda que fue hibridado con ADN de
macho marcado radiactivamente, después de la pre-hibridación con un exceso de ADN de
hembra. El ADN de hembra debió “bloquear” todas las secuencias comunes para machos y
hembras, así es que, las secuencias específicas del macho fueron hibridadas por ADN de macho
(40).
Posteriormente, la combinación de enzimas de restricción y de hibridación fue utilizada para
desarrollar sondas enriquecidas del cromosoma Y por marcaje radiactivo para ADN de macho
bovino, el cual fue desnaturalizado e hibridado. Esto, con el propósito de proporcionar métodos
de hibridación para la identificación de embriones machos con la utilización de secuencias de
ADN específicas del cromosoma Y, obteniendo sondas de ADN para tales secuencias y ser
utilizadas en métodos de hibridación para pruebas de diagnóstico sexual.
La preparación de la sonda específica del macho fue después hibridada por Southern blot
utilizando ADNs de macho y hembra bovino, digeridos con varias enzimas de restricción.
Después de la transferencia a una membrana, fueron pre-hibridados con ADN de hembra. Por este
método, se observó un fragmento RsaII de 6.0 kb en el ADN del macho, pero no en ADN de la
hembra. Este fragmento fue clonado por restricción y preparado en un gel por electroforesis,
seguido por elusión y ligación en un plásmido (7).
La clonación por enriquecimiento de supresión, fue una técnica utilizada originalmente para
obtener secuencias específicas del cromosoma Y del ratón (31); y posteriormente para obtener
secuencias de ADN de humano para identificar problemas de distrofia muscular. En teoría, este
método tiene un significado para cualquier clonación de secuencias presentes en un genoma, pero
ausentes en un genoma relacionado. La clonación por enriquecimiento de supresión fue usada
para obtener dos fragmentos de ADN específicos del macho bovino (BOV35M y BOV97M) (38).
28
Las sondas de ADN específicas del cromosoma Y bovino, han sido utilizadas para realizar
ensayos por Dot blot con ADN obtenido de un número pequeño de células embrionarias (58).
Específicamente se reporta, que unas pocas células embrionarias pueden ser colocadas
directamente sobre una membrana para su posterior hibridación, evitando la necesidad de aislar el
ADN; y otros trabajos reportan una exactitud del 99% con este método (47). Sin embargo, el
reporte de estos autores menciona que el método presenta el inconveniente de consumir
demasiado tiempo, ya que el tiempo total requerido para el ensayo fue de 8 días.
El uso de sondas de ADN específicas del cromosoma Y para el diagnóstico sexual hace que el
desarrollo del método sea laborioso y con gran consumo de tiempo (58). Sin embargo, el medio
más factible para incrementar la velocidad de un ensayo que permita realizar diagnósticos del
sexo en un intervalo de tiempo más corto, es la utilización de la técnica de PCR que está basada
en la amplificación enzimática de ADN in vitro, sintetizando varias copias de una secuencia de
ADN de interés y por lo tanto, incrementar substancialmente la calidad del ADN blanco (47).
Además, para permitir la amplificación específica de la secuencia de ADN de interés se emplea
un grupo de oligonucleótidos que son usados como flanqueadores (asignados iniciadores). Es
decir, que para aplicar PCR en la determinación sexual, primero se debe de reconocer una
secuencia específica de nucleótidos para el cromosoma sexual, tales como secuencias de ADN de
copia única o secuencias de ADN repetidas (48).
En otros reportes se ha descrito el uso de la PCR de baja astringencia (LS-PCR) (13) o la
detección de fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLPs) específicos de X/Y, tales
como los genes ZFY y ZFX homólogos para los cromosomas X y Y en humanos, bovinos, ovinos
y caprinos (1), Sin embargo, el análisis de RFLPs requiere adicionalmente un paso más que
consta de una digestión con enzimas de restricción del producto de PCR, así que, con esto se
incrementa el tiempo de diagnóstico y el riesgo de contaminación que por ende, puede
proporcionar un diagnóstico incorrecto. No obstante, el uso de la técnica de PCR resulta ser un
procedimiento más promisorio para determinar el sexo, debido a sus características particulares
durante su práctica.
Uno de los primeros reportes publicados sobre el uso de PCR para el sexado de embriones fue un
estudio sobre la viabilidad del sexado de embriones preimplantados en humanos. En este caso,
29
una célula fue extraída de un embrión con 8 células. La amplificación de la secuencia repetida
específica del hombre fue parte de un fragmento HaeII de 3.4 kb. De 18 embriones normales que
fueron sexados por PCR, 15 fueron sexados correctamente y corroborados por otros métodos (11,
23).
En otro estudio, realizado también en humanos, se demostró que las células del hombre pueden
ser detectadas a través de sangre periférica de mujeres gestantes, llevando un feto masculino.
También, otros reportes (23) sugieren que el sexo fetal podría ser detectado por las secuencias de
ADN repetidas específicas del hombre, tomando en cuenta precauciones rigurosas como falsos
positivos (muestras de hembras, que serían diagnosticadas como machos o una posible
contaminación de la muestra experimental que podría ser el resultado en un macho). Las
precauciones tomadas, incluyen todas las manipulaciones internas de gabinete y de los
componentes de reacción.
Particularmente, la utilización de secuencias repetidas específicas del cromosoma Y en la técnica
de PCR es de gran utilidad, como se mencionan en estudios realizados en bovinos y en ovinos, al
indicar que la determinación del sexo de un embrión tiene una alta precisión con un tiempo
relativamente corto para que se lleve a cabo. Esto, también fue corroborado al determinar por
PCR el sexo de embriones de ratón a partir de 8 células (27).
Con esto, se confirma que la PCR resulta ser el procedimiento más promisorio para realizar
diagnósticos del sexo a partir de ADN de muestras celulares. Considerando además que la región
homóloga de los cromosomas X y Y presenta diferencias en su secuencias, siendo posible para
identificar el sexo de los embriones (8) o la utilización de secuencias de nucleótidos repetidos
específicos únicamente del cromosoma Y, indicando con esto, que solo se encuentran en
embriones masculinos (23); aparte de que es posible realizar el diagnóstico del sexo alrededor de
5 a 6 horas.
Entre los aspectos que se deben considerar durante la aplicación de la PCR para el diagnóstico del
sexo, se encuentran:
a) La obtención de una mínima cantidad de ADN obtenida de biopsias embrionarias para no
dañar el desarrollo y viabilidad de un embrión para su posterior transferencia y que llegue
a buen término su gestación;
30
b) La aplicación de secuencias específicas del cromosoma Y en la PCR que no proporcionen
resultados falsos positivos en el diagnóstico sexual, debido a que la modificación de una
base de oligonucleótido (iniciadores) puede causar drásticas alteraciones en los productos
de la reacción, traduciéndose en un diagnóstico sexual virtualmente imposible (6, 7);
c) Utilización de iniciadores para la amplificación de una secuencia autosómica que nos
indique una respuesta de amplificación con relación a embriones de hembra; y
d) Riesgo de contaminación que por ende, se puede proporcionar un diagnóstico incorrecto.
Se menciona, que cualquier célula de mamífero tiene cerca de 2 pg.(2 x 10-12 g de ADN). El ADN
podría tener cerca de 2-3 x 109 pb. Pero un gen, como por ejemplo el que determina el sexo,
podría tener alrededor de 1,000 pb, significando que es necesario para realizar la millonésima
parte del ADN de una célula (6).
Esta técnica, tiene una limitación, el número de fragmentos de ADN que sería finalmente
detectado es duplicado en cada paso, llegando a un momento en que por diferentes razones, un
número de fragmentos no relacionados al fragmento blanco producido en el mismo tiempo y los
fragmentos no relacionados, podrían enmascarar los resultados deseados; y al incrementar el
número de pasos de amplificación el fondo podría ser mayor.
Dado que es necesario la amplificación de un fragmento de ADN del cromosoma sexual para
obtener la suficiente sensibilidad para determinar el sexo de los embriones de una muestra de
pocas células, se discute a continuación los mecanismos moleculares para la amplificación de
ADN (6):
a) Una simple cadena de ADN tiene dos terminales (ó extremos), una de ellas con fosfato en
el carbón 5´ de la molécula de desoxirribosa (extremo 5´) y la otra con hidroxilo en
posición 3´ del azúcar (extremo 3´). Al mismo tiempo, la cadena complementaria tiene el
mismo tipo de extremos, pero en posiciones opuestas, siendo que el extremo 3´ de una
cadena tiene el otro extremo 5´ enfrente de si. Por esta razón, se considera que las dos
cadenas complementarias de una molécula de ADN tienen polaridades opuestas.
b) Es conocido que la replicación de una cadena de ADN es producida por la combinación
de un nucleótido-5´-trifosfato con el extremo 3´ de la cadena. Por lo tanto, este extremo 3´
es el punto creciente del ADN y el proceso de síntesis en direcciones opuestas en ambas
cadenas complementarias.
31
c) Una cadena plantilla es simplemente una cadena de ADN. No obstante, la cadena plantilla
no provee cualquier extremo 3´, capaz de fomentar la iniciación del crecimiento de una
nueva cadena que vaya a ser sintetizada. Por esta razón, la síntesis de una nueva molécula
de ADN es solo posible en la presencia de un fragmento de ácido nucleico que pueda
proporcionar el extremo 3´. El nombre dado a este fragmento de ácido nucleico es
“iniciador”.
d) Además, los mecanismos de la síntesis de ADN requieren de la acción de una serie de
enzimas que catalizan las reacciones. La presencia de ADN polimerasa es de gran
importancia para la extensión de la cadena de ADN para que en pasos consecutivos realice
la amplificación de un fragmento.
e) En cada paso de la técnica, el número de cadenas obtenidas en el paso anterior es
duplicado, así que, este número tiene un crecimiento geométrico. Sin embargo, la
aplicación de esta técnica, tiene una limitación derivada de la síntesis de un fragmento de
ADN falso de los mismos iniciadores que no corresponden a la plantilla (o templado) que
se desea para la copia. Esto puede atribuirse a la contaminación, así como a otras causas.
Pero las copias correctas del templado (o plantilla), así como de unas falsas, tienen en sus
terminales
las
secuencias
de
los
mismos
iniciadores
que
crean
secuencias
complementarias que en el próximo paso, serían amplificadas. Por consiguiente, las
cadenas blanco, así como la amplificación de algunas falsas, llevarían a un punto donde es
posible mejorar la sensibilidad
Investigadores (33, 34), realizaron ensayos de la precisión del sexado de embriones de bovino por
PCR, así como la evaluación del desarrollo potencial de los embriones biopsados hasta su
transferencia a hembras receptoras. Realizaron biopsias de una célula de embriones (obtenidos
por FIV) en etapa de 16 a 32 células (5° día después de la fertilización); y para la reacción de
PCR utilizaron un par de iniciadores para una secuencia repetida específica del cromosoma Y
bovino (BRY.1) de 301 pb y un par de iniciadores específicos de bovino (1.715) de 216 pb. Los
resultados obtenidos, indicaron que un blastómero de un embrión es suficiente para la
determinación del sexo por PCR en un 95.4%. Por otra parte, de 19 embriones que fueron
biopsados y sexados, y que fueron transferidos a hembras receptoras, solo 10 de estas quedaron
gestantes (52.6%) al corroborarlo por ultrasonografía. También mencionan que los resultados
obtenidos no difieren significativamente de lo alcanzado con un grupo control de embriones
32
obtenidos también por FIV que no fueron manipulados antes de su transferencia, donde se
encontró el 54% de gestaciones.
La PCR es el método más eficiente para determinar rápidamente el sexo en bovinos desde etapa
embrionaria previamente a su transferencia a receptoras (2). Los primers del gen ZFY y ZFX
empleados flanquean parte de una secuencia específica del cromosoma Y (región de 447 pb) del
gen ZFY, así como de su alelo ZFX en el cromosoma X, evitando así dictaminar casos como
falsos negativos o la necesidad de emplear un juego más de primers (PCR multiplex) para
amplificar una región de ADN presente tanto en machos como en hembras, ya que en ambos
obtenemos un producto amplificado que posteriormente debe de ser digerido. En cada prueba de
PCR se usan un control macho, uno hembra y uno negativo (muestra sin ADN) con el fin de
detectar la posible presencia de contaminación con ADN.
Una de las herramientas comúnmente empleadas en el estudio molecular de los genes es el
análisis de fragmentos de restricción de longitud polimórfica (RFLP; del inglés Restriction
Fragment Length Polimorphism). El empleo de la PCR ha hecho posible la amplificación de
regiones cortas de ADN que incluyan el sitio de restricción de interés, el cual después es expuesto
a una enzima de restricción para posteriormente el ADN amplificado y digerido ser utilizado
directamente en el gel apropiado usando electroforesis (técnica de separación de moléculas
cargadas en una matriz a la cual se aplica un campo eléctrico).
De esta forma, solo embriones del sexo hembra son transferidos en fresco o bien se congelan para
posterior transferencia; resultando esto especialmente benéfico en hatos productores de leche, en
los cuales la mayor limitante es la disponibilidad de reemplazos hembras y el número de
receptoras reducido.
El costo del sexado y los reemplazos, siempre será menor en relación a mantener una receptora
durante un año, la cual tiene el 50% de posibilidad de parir un macho cuyo valor es insignificante
para la explotación.
1.12. SINCRONIZACIÓN DEL CELO
33
Cuando los embriones van a ser transferidos en fresco posterior a la biopsia, es necesario disponer
de receptoras con el celo sincronizado a la par de las donantes; de forma ideal, la receptora debió
haber estado en celo el mismo día que la donante (+ 12 h), aunque asincronía de máximo 24 h
dan tasas de gestación aceptables (32).
Para asegurar que se transfieren embriones a las receptoras en la fase más apropiada del ciclo
sexual, es vital la observación cuidadosa y frecuente del celo; además se verifican (visualmente o
por palpación) la presencia y normalidad de un CL antes de la transferencia del embrión.
1.13. TRANSFERENCIA DE LOS EMBRIONES
Dependiendo de las instalaciones y el equipo, la transferencia de los embriones se ha vuelto tan
simple como realizar una inseminación artificial (IA) requiriendo de manera complementaria
sólo, habilidad para manipular el útero y los ovarios, pasar con éxito una pipeta a través del
cérvix hasta el cuerno uterino y lograr tasas de gestación de por lo menos el 40% (34, 35, 36).
El estrés o inyección de ACTH, se ha visto que retrasa (acortando o inhibiendo) la expresión del
celo, aun habiendo en la vaca concentraciones de estradiol inductoras del celo, y puede causar
esto una reducción significativa en la tasa de ovulación. Al parecer cualquier agente estresante
que active la respuesta de ACTH, incluyendo altos niveles de endotoxinas en el útero o la
glándula mamaria, puede llevar a una supresión de la descarga preovulatoria de LH (14).
De forma ideal, los animales deben adaptarse bien a las personas, permitiéndoles mantener
contacto visual con otros animales de la misma especie durante el manejo; es decir, debe
asegurarse que los animales no sufran como resultado de estos procedimientos.
1.14. CRIOPRESERVACIÓN EMBRIONARIA
David Whittingham et al (1971); mostraron que es posible la congelación embrionaria al lograr el
nacimiento de ratones a partir de embriones congelados utilizando glicerol como crioprotector.
Desde mediados de los 70´s se han comercializado embriones bovinos congelados, reportándose
34
el primer becerro nacido a partir de un embrión congelado a principios de los 70´s en Cambridge,
Inglaterra.
En condiciones normales, embriones transferidos de excelente calidad congelados-descongelados,
disminuyen por efecto de congelación alrededor de un 10% en tasa de preñez en relación a la
transferencia en fresco (41, 53).
Desde 1977, la técnica de criopreservación embrionaria se ha estandarizado en todas las especies
domésticas enfriándose los embriones desde los +20°C hasta -6 ó -7°C, induciendo aquí la
cristalización y llevando el proceso de congelación desde esta última temperatura hasta -30 ó 35°C a una tasa de enfriamiento de 0.3 a 0.5°C por minuto para luego sumergirlos en nitrógeno
líquido (-196°C) permaneciendo así hasta el momento de su descongelación (41).
Los crioprotectores son de dos categorías: intracelulares y extracelulares; los intracelulares son de
bajo peso molecular (v. gr.; glicerol, etilenglicol y DMSO). En los últimos años el etilenglicol
(EG) es el crioprotector para embriones más utilizado a una concentración de 1.5 molar,
popularizando esto el método de transferencia embrionaria directa (DT); los extracelulares son de
alto peso molecular (v. gr.; sacarosa, albúmina sérica bovina (BSA) y ácido hialurónico); aunque
no está muy claro como actúan, se cree que la BSA protege al embrión en la fase inmediata
postdescongelación estabilizando las membranas celulares (46).
La alta permeabilidad del EG confiere buena protección a las membranas de las estructuras
intracelulares incluyendo lisosomas (mayor estructura hidratada de la célula). Cuando por efecto
de la congelación ocurre destrucción de lisosomas, se liberan enzimas líticas, las cuales dañan la
estructura celular y se da destrucción de blastómeros (41, 46).
Tanto el proceso de congelación y descongelación pueden dañar la zona pelúcida y alterar la
morfología celular permitiendo la entrada de patógenos y contaminantes, dicha permeabilidad
hace que el EG penetre fácilmente a la célula precongelación, así como también salga de
inmediato de ella postcongelación, permitiendo esto que el embrión dentro del tracto reproductor
elimine el EG y se rehidrate allí mismo, dando la pauta para descongelar el embrión y transferirlo
directamente al útero sin requerir diluciones ni uso del microscopio (método de transferencia
directa).
35
El presente estudio pretende integrar y validar mediante un modelo económico diferentes
tecnologías de la reproducción animal (IA, TE y análisis genotípico múltiple por métodos
moleculares como son
PCR y RFLP’s) como herramientas para
aumentar la eficiencia
reproductiva y productiva en el ganado lechero y así obtener incrementos considerables en la
productividad del hato (50, 51).
2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El ganado lechero con mérito genético alto, sufre un desgaste prematuro por el estrés de la
producción, lo cual deriva en alta tasa de desecho anual, lo que se traduce en la necesidad de
mayor cantidad de reemplazos por año.
Se considera por los investigadores y practicantes de la transferencia de embriones, que los
embriones biopsados para sexado más viables, usando la técnica de PCR, son los blastocitos y
mórulas compactas, ambos calidad 1, considerando que estos definitivamente no necesitan zona
pelúcida para desarrollarse normalmente después de ser transferidos a receptoras y en esta etapa,
el efecto de la congelación o microsección no les resta viabilidad más allá del 15% (24, 35, 36).
En el presente estudio se determinó a nivel campo en nuestra región la viabilidad (determinada
por la tasa de preñez) de los embriones: frescos (TW1); congelados con EG (TW2); biopsados
frescos (TW3) y biopsados congelados con EG (TW4). Esta viabilidad no está referenciada en
nuestro país, ni se cuenta con un modelo económico referente que de sustento al uso de estas
36
biotecnologías en reproducción animal en la industria lechera como opción para mayor
disponibilidad de reemplazos y mejora del perfil genético del hato (50, 51, 52).
3. JUSTIFICACION
El estado de Jalisco se destaca por ser la entidad federativa que ocupa el primer lugar en cuanto a
producción de leche de bovino se refiere, con una aportación a la producción nacional en el 2003
del 18.4%, lo que equivale a un volumen anual de 1,709.3 millones de litros, (SIAP, SAGARPA
2004). Esta producción lechera se da en una diversidad de sistemas que van desde rústicos hasta
algunos hatos con un alto nivel de tecnificación y productividad. Es de interés de los criadores de
registro y productores comerciales de leche como resolver entre otras vicisitudes: el problema de
la baja eficiencia reproductiva puesto que esta declina conforme el rendimiento en leche por vaca
se incrementa, habiendo así carencia de reemplazos.
En este contexto, se considera relevante para la industria lechera, el ensayo, desarrollo y
aplicación de tecnologías reproductivas asociadas a técnicas en genética molecular que permitan
incrementar el número de reemplazos hembras de alto valor genético.
37
4. HIPOTESIS
Los embriones bovinos preimplantados, analizados para determinación del sexo a partir de una
biopsia (5-10 blastómeros) con la técnica de PCR y RFLP´s ; son actualmente, la opción más
directa, rápida, confiable y rentable para producir reemplazos lecheros de mayor calidad genética
y valor económico, con sólo un demérito en fertilidad o viabilidad de alrededor del 15% en
relación a la que se obtiene a partir de embriones transferidos frescos y sexados (52, 56);
porcentajes estos que todavía hacen rentable el proceso.
38
5. OBJETIVOS
5.1. OBJETIVO GENERAL
Evaluar la viabilidad y rentabilidad del sexado de embriones empleando PCR y RFLP´s y
criopreservados con etilenglicol; así como valorar el uso integral de diferentes técnicas en
biología de la reproducción (v. gr., IA, TE) con técnicas en biología molecular (PCR y RFLP´s)
como opción viable de avance tecnológico para mejorar la eficiencia reproductiva y
disponibilidad de reemplazos en los hatos lecheros.
5.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Utilizar la Transferencia de Embriones para expandir el número de crías de vacas elite en
un hato lechero.
39
2. Estandarización de la técnica de obtención de biopsia y PCR para la amplificación de
secuencias de ADN del cromosoma Y de copia única.
3. Uso de PCR y RFLP´s para detectar los genes ZFY y ZFX que definen el sexo en el
bovino.
4. Evaluar la viabilidad embrionaria, medida ésta por la tasa de preñez, confrontada dicha
viabilidad entre embriones transferidos frescos sin y con biopsia así como contra
embriones congelados con EG sin y con biopsia.
5. Evaluar la rentabilidad económica del uso de embriones sexados por técnicas moleculares
y congelados con EG.
6. Desarrollar un modelo económico (costo-beneficio) que de sustento a biotecnologías para
la reproducción eficiente en los hatos lecheros de nuestra región.
6. MATERIALES Y MÉTODOS
6.1. ANIMALES
El trabajo principalmente se desarrolló en forma continua, en un hato lechero de registro con alto
grado de tecnificación, cuyo ganado fue importado del Estado de California, USA, está
compuesto de 380 vacas en producción (promediando 26.7 litros de leche por vaca por día en
línea de ordeño), 90 en período seco, 170 reemplazos de diferente edad y estado reproductivo, de
la raza Holstein y cruza de Holstein/Suizo Americano; ubicado en el Municipio de Santana
Acatlán Jalisco, a 29 km al sur de la ciudad de Guadalajara, Jalisco, el clima es
predominantemente templado; colateralmente se trabajó también en las siguientes Ganaderías: La
providencia, Los Eucaliptos, El Raicero y El Mirador, todos ellos enclavados en la misma zona.
Por sus características raciales, árbol genealógico y sus registros de producción que incluyeron al
menos una lactancia completa, se eligieron las mejores 20 vacas como donadoras. Estas tenían
40
mínimo dos desviaciones estándar (cada desviación estándar = 6 litros) del promedio de
producción diaria en línea de ordeño del lote de altas productoras (36 litros). Por lo anterior, cada
donadora mínimo promedió durante los primeros 4 meses de lactancia 38 litros de leche por día
en línea de ordeño.
Las 20 donadoras seleccionadas acordes con las mejores predicciones de la raza, excelente
fenotipo, fertilidad probada, más de 60 días postparto (pp) y condición corporal (cc) entre 2.5 y 3
(escala 1-5), se sometieron a un régimen de superovulación convencional, usando FSH de
extracto pituitario ovino (400 U.I) durante 4 días cada 12 h por vía intramuscular y
prostaglandinas F2 α (dinoprost 35 mg)
por la misma vía, para inducir el celo y realizar
posteriormente la IA; la colección embrionaria se llevó a cabo mediante una técnica estándar no
quirúrgica entre el día 7-7.5 después de la presentación del celo (15, 16, 18); en el presente
trabajo, para la congelación embrionaria se siguió un protocolo estándar (16, 25, 35, 36, 41).
Como receptoras, se seleccionaron 80 vacas y 50 vaquillas puras y cruzadas (Holstein-Suizo
Americano; Holstein-Simmental y Simmental-Cebú); las vacas con fertilidad probada y las
vaquillas con buen record de desarrollo; ambas físicamente saludables, amplitud pélvica y aparato
reproductor apto para recibir y desarrollar un embrión, ya sea este fresco, congelado y/o biopsado
(9).
En el presente estudio se usó un arreglo factorial dos por dos, teniendo cuatro tratamientos de
transferencia embrionaria mediante una técnica estándar no quirúrgica (15, 16, 18); cada
tratamiento constó de transferencia de 25 embriones (W) y fue de la forma siguiente: Tratamiento
1 (TW1) = transferidos 25 W frescos; TW2 = Transferidos 25 W congelados con EG; TW3 =
transferidos 25 W biopsados frescos y TW4 = transferidos 25 W biopsados congelados con EG.
Se utilizó semen de toros comerciales los cuales fueron designados previamente acordes a la vaca
mediante el sistema de evaluación lineal y apareamiento dirigido, es decir, la elección del
semental para inseminar a las donadoras, fue en base a los índices de la raza Holstein (índice de
tipo-producción, compuesto de ubre, compuesto de patas y pezuñas), facilidad de parto y
marcadores genéticos (kappa.caseína y beta-lactoglobulinas).
6.2. OBTENCIÓN DE LA BIOPSIA
41
La zona pelúcida es útil durante el desarrollo del embrión precediendo la compactación, por lo
que mórulas compactas o blastocitos, ya no la requieren básicamente, es por eso que embriones
biopsados en estos estadíos se desarrollan bien después de ser transferidos (2). Para la obtención
de la biopsia mediante microsección, se contó con un microscopio de fase invertida (Leica®)
manual con micromanipulador adjunto para orientar los blastocistos manteniéndose con succión
ligera por un lado y por el otro un sostén del microbisturí; procediéndose enseguida a la
microsección con el microbisturí, evitando al máximo causar daño a las células de la masa interna
celular. Se utilizaron pipetas de 2, 5 y 50 µl para desplazar las biopsias, embriones y preparación
de las microgotas en cajas de petri con medio de biopsia respectivamente, así como etanol al
95%, agua destilada y medio de recuperación para el lavado del microbisturi.
Los medios utilizados para microsección, recuperación y mantenimiento de la biopsia fueron de
marca comercial (ViGro® Splitting Plus, ViGro® Retrieval Supplement PF y ViGro® Holding
plus; AB Technology, Inc., Pullman, WA).
Las biopsias inmersas en 2µl de medio de recuperación se depositaron en un tubo de prueba
Eppendorft®; conteniendo 8 µl de agua destilada, congelándose inmediatamente en nitrógeno
líquido para su transporte al laboratorio y enseguida determinación del sexo por PCR.
6.3. ESTANDARIZACIÓN DE LA TÉCNICA DE PCR
Se realizaron ensayos por PCR con ADN genómico de hembras y machos bovinos, con el objeto
de establecer las mejores condiciones de amplificación para las secuencias de ADN del
cromosoma Y de bovino, de copia única ZFX/Y (1, 6).
6.4. SEXADO DE LOS EMBRIONES
Al 50 % de los embriones seleccionados (blastocistos y mórulas) calidad 1 (16) se les realizó una
biopsia mediante una microsección al trofoblasto o en cualquier sitio a las mórulas compactas (542
10 blastómeros), con un microbisturí adaptado a un micromanipulador (3, 61, 62), procediendo
luego a transferir 25 de estos en fresco y los restantes 25 se congelaron con EG al 1.5 M
enseguida de la biopsia, para después ser transferidos (24, 35), las biopsias fueron material para
determinación del sexo por PCR ( 4, 10, 24).
De acuerdo a los datos de secuencia de DNA para los genes ZFX y ZFY (4), se eligieron los
oligonucleótidos iniciadores siguiendo un protocolo estándar (2, 29, 34, 43, 54), donde 100ng de
DNA son amplificados en una reacción de 100 µl, conteniendo 100 pmol de cada oligonucleótido
iniciador, 200µM de dNTP’s, y 2.5 U de Taq polimerasa.
Los ciclos de amplificación para la determinación del sexo, se realizaron en un termociclador
(Master-Gradient, Eppendorft®), con 35 ciclos de desnaturalización a 95ºC, 45 segundos;
alineación a 54ºC, 50 segundos y polimerización a 72ºC por 60 segundos.
Primeramente 15 µl del producto de reacción de la PCR se evaluaron por electroforesis en gel de
agarosa al 3% (Gibco® ultrapura) teñido con bromuro de etidio en buffer TBE 1x, para
determinar el tamaño del segmento amplificado.
Para el análisis de RFLP’s se tomaron de nuevo 15 µl del producto de reacción de PCR y fueron
digeridos por 3 horas con 10 unidades de enzima de restricción. Por último se realizó análisis por
electroforesis en gel de agarosa al 3% (Gibco® ultrapura) teñido con bromuro de etidio en buffer
TBE 1x y subsecuentemente las bandas se observaron y fotografiaron bajo luz UV en un sistema
de documentación de geles (UVP®).
6.5. DIAGNÓSTICO DE PREÑEZ
Todos los W de los tratamientos fueron transferidos a receptoras para finalmente determinar
entre los 60 y 70 días postransferencia la viabilidad de ellos (tasa de preñez) mediante diagnóstico
de gestación por palpación transrectal o ultrasonografía (21, 28) y así validar mediante un modelo
económico la eficiencia del uso en campo de técnicas de micromanipulación y biología
molecular.
43
6.6. MODELO ECONÓMICO
Se realizó acopio de datos para posteriormente realizar análisis económico (costo-beneficio) y
medir el impacto económico por introducir nuevas tecnologías en un sistema de producción
animal, tomando en consideración las tecnologías aplicadas, eficiencia de las mismas y costos del
establo en particular (33, 50, 51, 52)
7. RESULTADOS
De un total de 38 colecciones embrionarias que comprendieron un periodo de Abril de 2003 a
Septiembre de 2004, se obtuvieron un total de 209 W, resultando un promedio de 5.5 W por
colecta, de los cuales 102 (48.8%) fueron calidad 1 (2.7 W), y 107 (51.2%) calidad 2 (2.8 W); ya
sea mórulas o blastocistos. En el presente estudio, solo se contabilizaron las transferencias de los
de calidad 1 (15, 25), como se muestra en el cuadro 1:
CUADRO 1. RESULTADOS DE LOS TRATAMIENTOS TW1, 2, 3 Y 4.
TW1
TW2
TW3
TW4
25
25
25
25
4,1
7 (4)*
6 (3)
5 (1)
8 (1)
5,1
9 (5)
8 (5)
8 (2)
6 (2)
6,1
4 (2)
6 (2)
10 (3)
8 (2)
7,1
5 (2)
5 (0)
2 (0)
3 (0)
(6) 24%
(5) 20%
No. de W transferidos
Estadío y calidad W:
Tasa de preñez
(13) 52%
(10) 40%
______________________________________________________________________________
* Gestaciones
44
TW1= Embriones transferidos frescos.
TW2= Embriones transferidos congelados con EG.
TW3= Embriones biopsados y transferidos frescos.
TW4= embriones biopsados, congelados con EG y transferidos.
CUADRO 2. ANÁLISIS DE COSTO: BENEFICIO DE TW1, 2, 3 Y 4.
____________________________________________________________________________
TW1
TW2
TW3
TW4
_
Costo / W a la colecta (depreciación de la donadora y equipo, hormonales, medios y materiales,
alimentación extra, alojamiento especial, semen y mano de obra):
Calidad 1 ($)
1,255.50
1,255.50
1,255.50
1,255.50
350.00
350.00
350.00
350.00
400.00
400.00
400.00
400.00
Costo de recept. (30% extras) ($)120.00
120.00
120.00
120.00
Transferencia de W ($)
Manejo y suplementación extra
de receptoras / 45 días ($)
Costo de obtención de la biopsia / W ($):-Costo de congelación / W ($):
Costo / sexado/ embrión ($)
Costo de W gestado ($)
--
--
80.00
---
---
4,087.50
5,513.80
600.00
600.00
300.00
--
300.00
80.00
420.00
420.00
11,856.25
14,627.50
Costo por ocupación de
receptora ($)
Bajas perinatales: crías (5%)
600.00
600.00
234.40
305.70
592.80
656.40
Costo por cría nac. y viable($) 4,921.90
6,419.50
13,049.00
15,883.90
12,100.00
12,100.00
12,100.00
Costo del reemplazo desde nac.
hasta 7 meses de gestación ($) 12,100.00
45
Valor de vaquilla importada de registro
de + 7 meses de gest. ($)
Relación costo : beneficio:
25,000.00
25,000.00
25,000.00
25,000.00
1 : 1.46
1 : 1.35
1 : 0.99
1 : 0.89
TW1= Embriones transferidos frescos.
TW2= Embriones transferidos congelados con EG.
TW3= Embriones biopsados y transferidos frescos.
TW4= embriones biopsados, congelados con EG y transferidos.
Se estandarizaron las técnicas de PCR y RFLP´s, lo que permitió la amplificación de fragmentos
de ADN genómico de 447 pares de bases correspondientes a los genes ZFY y ZFX determinando
así el sexo en los embriones bovinos del estudio. Los fragmentos de restricción de longitud
polimórfica (RFLP) produjeron patrones de bandeo específico para bovino macho (447, 344 y
103 pb) y para bovino hembra (447 pb) (figuras 1 y 2).
50
100
103
344
350
447
1
2
3
4
5
6
46
7
8
9
10
Figura 1. Electroforesis de ADN bovino amplificado por PCR digerido con Pst I. Carril 1, Marcador molecular (50
pb Life Technologies), carril 2, macho control; carril 3, hembra control; carriles 4, 5 6, 8 y 9, embriones machos;
carril 7, embrión hembra; muestra sin DNA
Y = gtctgcagac
X = gtccgcagac
Pst I = gtctgca X gac
103
344
447
?
♀
X
Figura 2. Representación esquemática de electroforesis de ADN bovino
con amplificación de Genes ZFY y ZFX por PCR y digerido con Pst I.
Carril 1, macho control; carril 2, hembra control; carril 3, animal en
♂X
Se estandarizó la técnica para la toma de la biopsia mediante microsección al trofoblasto, (no
teniendo importancia para las mórulas la orientación del corte) (Figura 3).
Figura 3. Fotografía del manejo del micromanipulador y microfotografía del
47
embrión ya biopsado mediante una microsección al trofoblasto
Los análisis moleculares (PCR-RFLP), realizados a partir de ADN aislado de células
embrionarias mediante microsección al trofoblasto de los embriones transferidos que resultaron
en preñez postransferencia, fueron eficientes y confiables en lo referente a la determinación de los
genes ZFY (macho) y ZFX (hembra) (Figura 1).
Se evaluó viabilidad embrionaria; medida ésta como tasa de preñez (Cuadro 3).
CUADRO 3. TASA DE PREÑEZ DESPUES DE BIOPSAR LOS EMBRIONES Y
TRANSFERIRLOS
Tratamiento
Embriones transferidos /
No. de preñeces
No congelados.
Congelados con
etilenglicol al 1.5 M.
366 /214 (58%)*
25 /6 (24%)**
244 / 91 (37%)*
25 /5 (20%)**
* Shea B.F.; 1999. ** Fregoso C.; 2004.
Se hizo acopio de información y evaluación económica de todo el proceso (Cuadro 2 y gráfica 1)
para evaluar la rentabilidad de las biotecnologías en reproducción animal y en consecuencia
proponer el modelo económico para utilizar estas en los hatos lecheros de nuestra región.
GRÁFICA 1: RELACIÓN COSTO-BENEFICIO POR EL USO DE
BIOTECNOLOGÍAS EN REPRODUCCIÓN ANIMAL
1,6
1,4
1,2
1
Costo
Beneficio
0,8
0,6
0,4
0,2
0
TW1
TW2
TW3
48
TW4
8. DISCUSIÓN
Dadas las condiciones de manejo de los W en campo, los resultados en lo referente a tasa de
preñez, para TW1 y 2, están entre 10 y 15% abajo de lo reportado (8, 25, 53), pero para los
tratamientos TW3 y 4, los resultados son más deficientes, pues muestran diferencia entre 15 y
25% por abajo de lo que se reporta (18, 19, 25, 54, 57).
El diagnóstico molecular del sexo a partir de ADN aislado de blastómeros obtenidos mediante
microsección al trofoblasto comparado con el diagnóstico citogenético o ultrasonografía, ofrece
las ventajas de: mínimo daño al embrión, diagnóstico precoz, eficiente y confiable.
Estadísticamente, se aplicó la prueba de X2 , demostrándose que los embriones frescos y frescos
biopsados si tienen diferencia significativa (P<0.05) en viabilidad con respecto a los congelados
y congelados biopsados; por lo tanto, si depende la viabilidad embrionaria de la manipulación que
a estos se les dé.
La relación costo-beneficio para TW1, 2, 3 y 4 fue de 1: 1.46, 1:1.35, 1:0.99 y 1:0.89
respectivamente, demostrando esto, que en ganado lechero Holstein, realizando el proceso de
sexaje embrionario bajo condiciones de campo y conforme al modelo económico que se ha
propuesto; estas biotecnologías son onerosas en relación al
modelo de reproducción
tradicionalmente utilizado en las explotaciones de ganado bovino lechero.
49
9. CONCLUSIONES
1. Las biotecnologías reproductivas permiten a los criadores de ganado expandir y compartir
su germoplasma más valioso con la máxima bioseguridad y además, sin perder su base
genética.
2. Los resultados obtenidos en las colectas embrionarias tanto en calidad como cantidad
están acordes con lo reportado en la literatura.
3. Después de haber estandarizado la técnica de PCR-RFLP para la detección del gen ZFY y
ZFX, y la toma de la biopsia embrionaria; resalta el alto grado de confiabilidad que tienen
estas técnicas para el diagnóstico del sexo en fase temprana embrionaria.
4. Los resultados obtenidos indican que es factible, de acuerdo al análisis económico (costobeneficio), implementar biotecnologías en reproducción animal como lo es la
transferencia de embriones sexados frescos y congelados para transferencia directa,
siempre y cuando se alcancen TP de al menos 24.2%.
5. Los resultados sugieren la necesidad de reducir al máximo el tiempo para la toma de la
biopsia, así como probar otros medios que también sean aptos para el embrión y le resten
el mínimo de viabilidad durante el proceso de biopsado.
6. Se logró constatar el nacimiento de tres crías producto de embriones biopsadostransferidos en fresco, y una cría producto de embrión biopsado-congelado-transferido
habiendo concordancia con el diagnóstico obtenido en el Instituto de Biotecnología
Animal del Departamento de Producción Animal del CUCBA de la U de G.
7. Por los costos y resultados obtenidos, es necesario mantener la biopsia en nitrógeno
líquido sin procesar durante 15 días posteriores a la transferencia, dando esto oportunidad
para observar celo en las vacas o vaquillas en las cuales no se tuvo éxito en dicha
transferencia, abatiendo así costos de producción.
50
8. De no haber repetición de celo en el tiempo próximo esperado, a partir de la biopsia
almacenada, primero se determinará el sexo y solo para las que resulten hembras se
continuará con el análisis genotípico múltiple (marcadores genéticos; kappa-caseína y
beta-lactoglobulinas). Para el caso de los diagnosticados machos, se inducirá en la
receptora el celo mediante el uso de prostaglandinas F2α.
51
10. LITERATURA CITADA
1. Aasen E, Medrano JP. (1990). Amplification of the ZFY and ZFX for sex identification in
humans, cattle, sheep and goats. Biotechnology; 8:1279-1281.
2. A.B. Technology, Inc. (1997). Bipartición, biopsia y sexaje rápido de embriones bovinos.
A.B. Technology, Inc. 4ª. Ed: 2-61.
3. Agca Y. Monson R.L., Northery D.L., Peschel D.E., Scchaefer D.M. and Rutledge J.J.
(1998). Normal calves from transfer biopsied, sexed and vitrified IVP bovine embryos.
Theriogenology; 50: 129-145.
4. Alves B.C.A, De Lima Hossepian, Teixeira C.M. and Moreira-Filho C.A..(2003). Use of
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