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Biotransformación enzimática del ácido rosmarínico para
la producción de ácido cafeico a partir de extractos de
Salvia (Salvia officinalis L.)
Neri I. Padilla Caldera,1 María Soraya Osegueda Robles,1 Rosa Hernández Soto,1 Joaquín G. Marrero.1*
Unidad Profesional Interdisciplinaria de Ingeniería campus Guanajuato.
Av. Mineral de Valenciana No. 200 Fraccionamiento Industrial Puerto Interior, C.P. 36275.
Silao de la Victoria, Guanajuato
Resumen
En los últimos años ha existido un creciente interés en los compuestos naturales fenólicos, debido
principalmente a su capacidad antioxidante y los beneficios a la salud. La enzima clorogenato
esterasa cataliza la hidrólisis de los enlaces éster entre los ácidos hidroxicinámicos, que constituyen
una clase importante de ácidos fenólicos ampliamente disponibles en semillas, frutas y verduras.
Estos ácidos han recibido una gran atención debido a su capacidad como antioxidantes naturales.
El ácido rosmarínico es un potente antioxidante, que se encuentra en especies de la familia
Lamiaceae, y que presenta acción antiinflamatoria, prevención de la enfermedad de Alzheimer y
anti-carcinogénica. Del ácido rosmarínico se deriva el ácido cafeico, un ácido hidroxicinámico con
propiedades antioxidantes y efecto inhibidor sobre las enzimas específicas responsable de los
radicales libres. Para la síntesis enzimática del ácido cafeico empleando la enzima clorogenato
esterasa, se ha utilizado como sustrato subproductos agroindustriales naturales como manzana y
pulpa de café. Sin embargo la utilización de nuevos sustratos aumenta las posibilidades de
obtención de nuevos productos y propiedades antioxidantes. Con base en esto, la transformación
enzimática de los compuestos fenólicos en salvia (ácido rosmarínico) con la enzima clorogenato
esterasa, podría aumentar la capacidad antioxidante de la planta. Se realizó el estudio de la
relación enzima-sustrato a condiciones estándares de pH 7 y 35 °C. Una vez establecida la relación
enzima-sustrato, se varió las condiciones de reacción mediante el control de temperatura y pH. La
actividad antioxidante de los productos obtenidos tras la realización de estos experimentos se
realizó con el método DPPH.
Introducción.
En los últimos años ha existido un creciente interés en los compuestos naturales fenólicos,
debido principalmente a su capacidad antioxidante y los beneficios a la salud [1]. Los radicales
libres son especies químicas altamente reactivas, causantes de diversas enfermedades tales
como cirrosis, aterosclerosis, cáncer y diabetes, y las sustancias capaces de inhibir su
formación, o destruirlos, tienen un gran potencial para el tratamiento de dichas enfermedades
[2]. Los antioxidantes sintéticos tales como BHA, BHT, TBHQ y PG son altamente efectivos,
aunque están sometidos a una regulación estricta debido a que son sospechosos de producir
daños a la salud [3].
Por este motivo, se está en la búsqueda de nuevos antioxidantes de origen natural. El género
salvia, es una importante fuente de antioxidantes naturales, por lo que ha despertado nuestro
interés. Siendo esta un género importante que consta de unas 900 especies de la familia
Lamiaceae. Algunas especies de Salvia han sido cultivadas en todo el mundo para el uso en la
medicina popular y con fines culinarios [4]. Esto, aunado al amplio uso que se ha hecho de la
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biocatálisis para la preparación de nuevos antioxidantes, nos ha llevado a investigar el uso de la
enzima clorogenato esterasa [5] para la obtención de nuevos y mejores antioxidantes, a partir
de extractos de Salvia officinalis L., rica en compuestos fenólicos como el ácido rosmarínico.
Del ácido rosmarínico se deriva el ácido cafeico, un ácido hidroxicinámico [6] con propiedades
antioxidantes y efecto inhibidor sobre las enzimas específicas responsable de los radicales
libres [7].
Figura 1.Esquema de la transformación enzimática.
Material y Métodos
Reacción enzimática del extracto de salvia.
Se trabajó el extracto acetónico de la parte aérea de Salvia officinalis L., disolviendose en buffer
fosfato (pH 7) y etanol (10%), y se trató con la enzima clorogenato esterasa a diferentes
concentraciones (5, 10 y 20% enzima respecto al extracto). La disolución se agitó a 35°C durante
toda la noche (17−20 h). Después de ese tiempo, la mezcla de reacción se extrajo con AcOEt, se
secó la fase orgánica sobre MgSO4, y el disolvente se eliminó a vacío.
Cromatografías en capa fina (CCF)
Se realizaron CCF para identificar los productos en las diferentes fracciones, para su realización
se emplearon cromatofólios de aluminio con gel de sílice; y como fase móvil una mezcla etanolacetato de etilo en diferentes proporciones y etanol al 100 %. Las placas fueron reveladas con
óleum.
Comprobación de la capacidad antioxidante.
Una vez obtenido el extracto modificado, se evaluó su capacidad antioxidante aplicando el
método descrito por Burda y Oleszek [8]. Se prepararon varias disoluciones a diferentes
concentraciones del extracto en MeOH, y se adicionaron por separado a una disolución de
DPPH en MeOH (7.5 mg/250 mL). La disolución resultante se dejó en reposo durante 90
minutos y posteriormente se midió la absorbancia a 520 nm. Los resultados obtenidos fueron
promediados y la actividad antiradicalaria fue calculada como porcentaje de DPPH remanente
mediante la siguiente ecuación:
% DPPHR = [1-(DPPH)T/(DPPH)T=0] X 100
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(1)
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Donde (DPPH)T es la concentración de DPPH a los 90 minutos, (DPPH)T=0 es la concentración de
DPPH inicial. El porcentaje de DPPH remanente se representó frente a la concentración de la
muestra para obtener la cantidad necesaria de antioxidante (nM) necesaria para disminuir la
cantidad inicial de DPPH un 50% (EC50)
Resultados
Tabla 1. Resultados de la capacidad de cada una de las muestra; considerando que los datos reportados son
el promedio (cada una de las muestras se analizaron por triplicado).
Fase a la
cual se
realizó el
análisis
Fase
orgánica
Fase
acuosa
(DPPH)T=0
Muestra
Absorbancia
promedio
Extracto conc. 5.3 mg/
10 mL.
0.181
79.13
0.1625
83.21
0.1986
76.11
Muestra tratada con 5
% enzima con
concentración 5.1 mg/
10 mL.
Muestra tratada con
10 % enzima con
concentración 5.3 mg/
10 mL.
Muestra tratada con
20 % enzima con
concentración 5.3 mg/
10 mL.
Muestra tratada con 5
% enzima con
concentración 5.1 mg/
10 mL
Muestra tratada con
10 % enzima con
concentración 5.1 mg/
10 mL
Solución de DPPH
Capacidad
antioxidante
60.27
0.2656
80.54
0.163
82.14
0.155
0.87
Se emplea
como blanco
en la
ecuación,
representan
do la
cantidad
inicial de
DPPH inicial
Conclusiones.
Como se puede observar en la tabla 1, hemos conseguido incrementar la capacidad
antioxidante del extracto inicial, siendo la misma función de la cantidad de enzima empleada en
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la reacción. En este caso la reacción donde se empleó 20% de enzima, proporcionó el extracto
con mayor capacidad atrapadora de radicales libres.
Actualmente se están modificando las condiciones de reacción, así como las enzimas, para
optimizar el proceso. En un futuro próximo, se ensayaran otros sustratos diferentes a Salvia
Officinalis L.
Agradecimientos.
Este trabajo fue realizado con recursos otorgados por el Sistema de Administración de
Programas y Proyectos de Investigación (SAPPI) con las claves de los proyectos: 20131726 y
20130970, y por el Programa Integral de Fortalecimiento Institucional (PIFI).
Referencias
[1] Penarrieta, J.M., Salluca, T., Tejeda, L., Alvarado, J.A., Bergenstahl, B. J. Food Compos. Anal. 2011, 24, 580.
[2] (a) Behera, B.C., Verma, N., Sonone, A., Makhija, U. J. Food Sci. Technol. 2006, 39, 80; (b) Gerber, M., BoutronRuault, M.C., Hercberg, S., Riboli, E., Scalbert, A., Siess, M.H. Bull. Cancer 2002, 89, 293; (c) Serafini, M., Bellocco, R.,
Wolk, A., Ekstrom, A.M. Gastroenterology 2002, 123, 985.
[3] Tripathi, R., Mohan, H., Kamat, J.P. Food Chem. 2007, 100, 81.
[4] Imanshahidi M. et al. The Pharmacological Effects of Salvia species on the Central Nervous System. Phytotherapy
research. 2006. Vol. 20. pág. 427–437.
[5] Ramírez, L., Arrizon, J., Sandova, G., Cardador, A., Bello-Mendoza, R., Lappe, P., Mateos-Díaz, J.C. Appl. Biochem.
Biotechno. 2008, 151, 711.
[6] Gerhardt, U., Schroeter, A. Rosmarinic acid—a naturally occurring antioxidant in spices. Fleischwirtschaft. 1983.
63, 1628–1630.
[7] Chen, J.H., Ho, C.T. Antioxidant activities of caffeic acid and its related hydroxycinnamic acid compounds. J. Agric.
Food Chem. 1997. VOl. 45, pp 2374–2378.
[8] Burda, S, Oleszek, W. J. Agric. Food Chem. 2001, 49, 2
*Corresponding author: jgonzalezm@ipn.mx
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