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CARACTERIZACIÓN DE LA FUNCIÓN DEL GEN prg (piragua) EN EL OJO DE
Drosophila melanogaster
(1)
Tello Sánchez M. A. ; Nazario Yepiz N.O. (2); Riesgo Escovar J. R.(2)
(1)
Facultad de Ciencias Químicas
Universidad Autónoma de Querétaro
(2)
Instituto de Neurobiología
Universidad Nacional Autónoma de México
RESUMEN
El gen piragua (prg) está involucrado en la vía de la cinasa de Jun, la cual juega un papel
importante en el desarrollo de Drosophila melanogaster al dirigir el cambio de forma de las
células epiteliales durante el cerrado dorsal. Las mutantes homocigotas de prg presentan el
fenotipo de apertura dorsal y no llegan al estadio adulto. En este proyecto se buscó anular a prg
únicamente en células del ojo induciendo la recombinación mitótica por medio de la técnica FRTFlipasa en este tejido, utilizando el promotor de eyeless para dirigir la expresión de la Flipasa
(Flp). La línea mutante de prg (el alelo prgE8) que se utilizó contiene la secuencia FRT en la
posición 40 del cromosoma 2, lo cual es importante para generar mosaicos genéticos asociados a
la mutación. Los clones del ojo mostraron el impacto de la mutación de prg a diferentes niveles
del desarrollo de esta estructura. Las células homocigotas mutantes de prg se diferenciaron por la
ausencia de pigmento, utilizando como marcador al gen w+. A los adultos mosaicos se les
realizaron cortes histológicos de ojo para comparar los distintos fenotipos.
INTRODUCCIÓN
Drosophila melanogaster es un modelo muy utilizado en la investigación, ya que es de fácil
manejo, alto nivel de reproducción, ciclo de vida corto y baja demanda de mantenimiento.
Además presenta la ventaja de tener un bajo número de cromosomas, lo que permitió secuenciar
su genoma y por lo tanto, mapear las mutaciones en un corto tiempo.
prg está involucrado en la vía de la cinasa de Jun (JNK), la cual juega un papel importante en el
desarrollo de Drosophila pues dirige el cambio de forma de las células epiteliales durante el
cerrado dorsal.[1] Debido a que las mutantes homocigotas de prgE8 sufren de apertura dorsal, no
sobreviven más allá del estadio embrionario.[2] Para este proyecto se utilizó una técnica que
permitió anular el gen únicamente en células de ojo durante el desarrollo del organismo adulto.
En esta técnica se utilizaron moscas transgénicas que expresan la enzima Flipasa (Flp), cuya
función es la de inducir recombinación durante la mitosis cuando se encuentran 2 cromosomas
homólogos con secuencias FRT. Cuando se utiliza con un promotor de un gen acoplado a la
enzima en un tejido particular, se puede dirigir la generación de mosaicos genéticos en un tejido
específico [3]. El promotor eyeless (ey) es muy utilizado para esta técnica, ya que se expresa en
las células del ojo, permitiéndonos observar las consecuencias de la mutación en una estructura
muy regular y por lo tanto, es fácil identificar alteraciones a diferentes niveles. Drosophila tiene
ojos compuestos, formados por al menos 800 omatidios de estructura hexagonal con un arreglo
cristalino. Cada omatidio se compone de 20 células, 8 de éstas son las células fotorreceptoras y
cuenta con células accesorias que mantienen su estructura, como células del cono y células
pigmentarias. Los fotorreceptores tiene una especialización de la membrana plasmática
denominada rabdómero y estos forman un arreglo trapezoidal. Cada rabdómero está formado por
aproximadamente 60,000 microvellosidades y en esta parte de la estructura es donde se lleva a
cabo la fototransducción, proceso en el que se convierte la luz en señales eléctricas.[4]
1
METODOLOGIA
Se utilizaron cepas transgénicas de Drosophila con secuencias FRT (FRT40) y el gen marcador
w+. Una de ellas solo contenía el marcador (w+, FRT40) y la otra una sobre expresión del gen
pro-apoptótico hid (w+, GMR-hid, FRT40) en el ojo para favorecer la proliferación de los clones
homocigotos de prg. Se hizo la cruza de estas cepas con la mutante de prg (prgE8, FRT40) cada
línea utilizada se balanceó con CyO (marcado con alas curvas) para evitar la recombinación
meiótica, lo anterior se muestra en la tabla 1.
Tabla 1. Cruzas realizadas.
y -w-; prgE8 FRT40
CyO
y -w-; prgE8 FRT40
CyO
X
X
yw,eyFlp; w+, FRT40
________CyO
y’w*eyFlp; w+, GMR-hid, FRT40
_________CyO
Se mantuvo la cruza en viales con alimento a temperatura constante de 25°C. Se recupero la
descendencia que no contenía el cromosoma balanceador, por tanto se seleccionaron individuos
con alas planas (w+ FRT40/prgE8 FRT40) y por lo tanto, con clones en los ojos. Una vez
seleccionados, se procedió a capturar las fotografías y a realizar la preparación de las cabezas
para los estudios histológicos.
Para los cortes histológicos se anestesiaron las moscas con CO2, y se separaron las cabeza con
pinzas de disección, se cortó cada cabeza por la mitad y se mantuvieron 30 min en una solución
de fijación (H2O estéril, Buffer de Cacodilatos 2x, Glutaraldehido en agua 1:1 y OsO4 2%), al
terminar la media hora se reemplazó la solución por OsO4 2% y se fijaron por 2 horas.
Después se procedió a deshidratar las muestras a temperatura ambiente en un Histoquinet EMPT
de Leica, con un tren de Acetona/H2O (5 min por solución): 30%, 50%, 70%, 90%, 96%, acetona
100% 2 veces (10 min). Luego se cambiaron las muestras a una mezcla de Spurr/Acetona 1:1 y se
dejaron reposar toda la noche. Se sustituyó la mezcla por solución de Spurr y se dejó reposar por
4 horas, para luego introducir cada muestra en un molde para cortes y dejarlas solidificar entre 18
y 70 hrs a 60°C. Una vez sólidas, se procedió a realizar los cortes en un micrótomo RM2256 semi
automático de Leica, para observarlos y fotografiarlos en un microscopio de luz transmitida
Eclipse E600 de Nikon, con un objetivo de 60x. Las imágenes de los cortes se capturaron
digitalmente con una cámara cool SNAPcf de Photometrics. También se capturaron imágenes de
ojos completos y se realizaron reconstrucciones con diferentes planos focales.
RESULTADOS
Figura 1. Resultados de las cruzas.
Se muestran los diferentes genotipos de la descendencia, de los cuales se buscó solo el genotipo encerrado en azul pues contiene
los cromosomas con la secuencia FRT40 y por lo tanto la mutación en prg y el marcador w+, lo cual indica la ausencia del
balanceador y de alas planas. Los individuos con CyO/CyO son homocigotos letales y no sobreviven hasta la etapa adulta.
2
y -w-; prgE8 FRT40
CyO
a)
yw,eyFlp; w+, FRT40
CyO
b)
yw,eyFlp; w+ FRT40
prgE8 FRT40
c)
Figura 2. Defectos en el ojo a causa de la mutación de prgE8 y w+
a)
b)
c)
Ojo control prgE8 y su respectivo corte histológico en la parte inferior
Ojo control w+ con su respectivo corte histológico
Clon de ojo w+/prgE8 y su respectivo corte histológico, la punta de flecha señala un omatidio formado correctamente. La línea
punteada que encierra el área de los clones y sus deficiencias del desarrollo. la línea continua encierra un cuerpo apoptótico.
y -w-; prgE8 FRT40
CyO
a)
yw,eyFlp; w+, GMR-Hid FRT40
CyO
b)
yw,eyFlp; w+, GMR-Hid FRT40
prgE8 FRT40
c)
Figura 3. Defectos en el ojo a causa de la mutación de prgE8 y w+ GMR-Hid
a)
b)
c)
Ojo control prgE8 y su respectivo corte histológico en la parte inferior
Ojo control w+GMR-Hid con su respectivo corte histológico
Clon de ojo w+GMR-Hid/prgE8 y su respectivo corte histológico, la punta de flecha señala las anomalías en las células
pigmentarias y la línea punteada encierra el defecto de ausencia de quetas.
3
DISCUSIONES Y CONCLUSIONES
En la estructura externa de los individuos w+/prgE8 se encontraron omatidios con los tres
genotipos antes mencionados, los clones se pudieron distinguir con la ausencia de pigmento por
el fondo genético de ojos blancos (w-). Se pudo observar una gran cantidad de defectos en la
estructura del ojo de manera externa, presentando un ojo rugo, y se encontraron células
necróticas en varios individuos. Los cambios en la estructura de los ojos también fueron
internos, en los cortes histológicos al microscopio se pudieron identificar defectos en la estructura
y orden de los omatidios, aumento o disminución del número de rabdómeros, ausencia o
anomalías en las células pigmentarias.
En los individuos w+, GMR-hid/prgE8 el fenotipo resulto mucho más drástico mostrando la
mayoría o la totalidad de las células con fenotipo mutante, un alto número de células necróticas,
ausencia de quetas alrededor del ojo y un particular aspecto vidriado. Los cortes histológicos de
estas mutantes, mostraron una alta deficiencia en el desarrollo de las células del ojo, pues el
fenotipo fue extremadamente drástico a comparación de los controles. Fue imposible observar
omatidios bien desarrollados, el arreglo era deficiente y las células pigmentarias no eran
uniformes en el tejido. Lo anterior nos permite concluir que el papel de prg en desarrollo es de
alta importancia ya que de no serlo, no se hubieran encontrado los fenotipos mencionados en los
clones generados.
REFERENCIAS
[1] HARDEN, N. 2002. “Signaling phatways directing the movement and fusion of epithelial
sheets:lesson from dorsal closure in Drosophila”. Differentiation, 70:1-23.
[2] NAZARIO Yepiz N.O. 2006, “Caracterización de un nuevo gen piragua (prg) en Drosophila
melanogaster”, Tesis Doctoral, Instituto de Neurobiología UNAM - Campus Juriquilla, Qro.
[3] PERRIMON Norbert. 1998, “Creating Mosaics in Drosophila”, Department of genetics,
Harvard Medical School, USA. Int. J. Dev. Biol, 42:243-247.
[4] LORANCA C. A., et a. 2005 “Análisis del proceso neurodegenerativo en ojo de Drosophila
melanogaster, asociado a la expresión se una forma mutante del receptor IP3. Instituto de
Neurobiología UNAM – Campus Juriquilla, Qro. Memorias del XIV Congreso de Bioenergética
y Biomembranas. Sociedad Mexicana de Bioquímica A.C
AGRADECIMIENTOS
Comité organizador del X Verano de la Ciencia Región centro. Becario E-UAQ-07
Instituto de Neurobiología UNAM campus Juriquilla
Universidad Autónoma de Querétaro – Departamento de Investigación y Posgrado
Dr. Juan Rafael Riesgo Escovar,
M. en C. Nestor Octavio Nazario Yepiz
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