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ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD DE BACTERIAS DESNITRIFICANTES EN SISTEMAS DE TRATAMIENTO DE EFLUENTES INDUSTRIALES UTILIZANDO EL GEN DE LA NITRITO REDUCTASA Dayana Travers(1), James Tiedje (1) (2), Claudia Etchebehere(1) Facultad de Química y Facultad de Ciencias, Universidad de la República, Montevideo, Uruguay. Ecology, Michigan State University, East- Lansing, MI, USA. e m ail: dtravers@fq.edu.uy; cetchebe@fq.edu.uy (2) Center for Microbial MÉTODOS INTRODUCCIÓN Para eliminar la contaminación nitrogenada de los efluentes industriales se han diseñado sistemas de tratamiento de efluentes biológicos. ¾ Extracción de ADN (MoBio Soil purification kit) ¾ PCR nirS (Primers nirS 1F y nirS 6R)(Bracker et al,1998) Estos sistemas constan de un primer paso de nitrificación y un segundo paso de denitrificación. ¾ Clonado del gen nirS (TOPO-TA amplification kit,Invitrogene) ¾ Secuenciación (GTSF, Michigan State University) ¾ Análisis filogenético (Felsenstein J. PHYLIP; base de datos EMBL) ¾ Restricción in silico de las secuencias obtenidas La diversidad de bacterias desnitrificantes en sistemas de tratamiento de efluentes aún no ha sido muy estudiada. Debido a que las bacterias desnitrificantes comprenden un grupo filogenéticamente diverso, es necesario utilizar genes funcionales para su estudio. T-RFLP (Terminal Restriction Fragment Polymorphism) del gen nirS con ¾ enzimas MspI y HhaI Genes involucrados en el proceso de desnitrificación: Determinación de la identidad a los picos del T-RFLP ¾ MUESTRAS M U ESTR A R EACTO R 3 UASB 4 10 11 UASB UASB UASB F SBR ALIM EN TACIÓ N En este trabajo se utilizó el gen nirS como marcador de la comunidad desnitrificante. OBJETIVO: Estudiar la diversidad de bacterias desnitrificantes en sistemas de tratamiento de efluentes TIEM PO D E O PERACIÓ N (m eses) N º clones analizados B IBLIO TECA nirS 6 33 A 6 12 3 37 25 35 B N L 12 16 F Efluente m altería/ N itrato Acetato/N itrato Acetato/N itrato Lixiviado/N itrato Efluente lechería tratado/ Am onio RESULTADOS Acidovorax sp.(AAL86942) Thauera chlorobenzoica (AAL86932) Clon A63 Thauera aromatica (AAL86927) 69 Clon A62 Clon A19 Thauera terpenica (AAL86936) Thauera selenatis (AAL86933) Tahuera linalootentis (AAL86934) 100 Clon N3 Clon N30 59 73 Clon N23 Clon B23 100 Clon B21 68 Thauera sp. (AAW51449) Clon B18 Clon B22 Clon L27 86 86 Clon A65 60 54 85 100 100 87 85 Hha; 154 MspI Thauera selenatis (AAL86933) 108 HhaI; 169 MspI Uncultured bacterium (AAP91651) 81 100 101-111 HhaI; 173 MspI 100 100 72 98 54 54 83 59 100 70 Hha I 377 Msp I Clon F16 Clon F24 Clon F62 Clon L10 Figura 2: Cromatogramas de T-RFLP del gen nirS con MspI de dos muestras del reactor F. Una especie = 1 fragmento nirS = 1 pico T-RFLP Th. Mechernichensis (NCBI-Blast) Clon A48 Clon L29 89 94 Pseudomonas aeruginosa (NP249210) 236 Hha I Pseudomonas fluorescens (AAG34381) 169 Msp I 73 111 -113–72 HhaI 100 145-103 MspI Clon A66 Ralstonia eutropha (CAA62740) Thauera mechernichensis (AAL86937) Clon A10 Clon L41 Clon L1 112 HhaI Clon L22 145-173 MspI Clon L2 Colwellia psychrerythraea (YP 270870) Colwellia psychrerythraea (AAZ25602) Clon L23 100 100 100 54 Clon B38 Clon B26 Clon N25 No cut Clon F42 Clon F94 Clon F69 109 Hha I Clon F18 Clon F3 169-364 Msp I Clon F88 100 ClonF87 Azoarcus sp. (CAI06598) Uncultured bacterium (AAP91645) 99 Uncultured bacterium (AAL89547) 77 Clon B39 Pseudomonas sp. (CAD29373) 99 Roseobacter denitrificans (CAA12214) 58 Clon B20 87 Paracoccus denitrificans (AAA93118) 101 Hha I Paracoccus pantrophus (CAC03621) 240 Msp I 100 87 Paracoccus denitrificans (AAB17878) Alcaligenes faecalis (CAA12216) Azoarcus toluvorans (AAL86939) Azoarcus evansii (AAL86938) Clon F43 100 100 0.1 Clon F5 240 Hha I Clon F63 102 Msp I 0.1 Figura 1: Árbol filogenético de secuencias nirS de: a) Beta-Proteobacterias (140 aminoácidos) b) Alfa y Gamma-Proteobacterias (175 aminoácidos). B A Los clones de los distintas bibliotecas se señalan en negrita. Clones 23 y 48 pertenecen a beta-Proteobacteria. 171 100% altura de pico normalizada 73 169 143 80% 140 136 60% 111 108 103 40% 101 98 20% 72 0% 1P 2P 3P 4P 5P 6P 7P 8P nume ro de mue stra Figura 3: T-RFLP del gen nirS con enzima MspI de 8 muestras del reactor F tomadas en distintos momentos de operación. Un color = 1 fragmento nirS Barra=diferencia de 10 aminoácidos en 100. Se presentan valores de bootstrap mayores a 50 CONCLUSIÓN Los cinco sistemas de tratamiento analizados presentaron especies dentro de los grupos alfa, beta, y gamma de Proteobacteria. La mayoría de las secuencias están relacionadas con nirS de organismos de los géneros Thauera, Acidovorax, Pseudomonas, Alcaligenes y Paracoccus. Mediante FISH se confirmó la presencia de bacterias del género Thauera. El análisis in silico de las secuencias obtenidas permitió asignar la identidad a los picos del T-RFLP, demostrando que estos organismos predominan en la comunidad desnitrificante. Probablemente, la presión selectiva ejercida en los sistemas de tratamientos de efluentes (como la capacidad de formar flóculos), selecciona determinada flora desnitrificante. Financiado por EOLI (Efficient Operation of Urban Wastewater Treatment Plants) con colaboración del Departamento de Ingeniería de Reactores y el Departamento de Ingeniería Eléctrica de la Facultad de Ingeniería. UDELAR
