Download aislamiento y selección de coliformes fecales resistentes

AISLAMIENTO Y SELECCIÓN DE COLIFORMES FECALES RESISTENTES A
ANTIBIÓTICOS PROVENIENTES DE DOS PLANTAS DE TRATAMIENTO DE
AGUAS RESIDUALES DE LA CIUDAD DE PUEBLA.
Lizeth CASTILLO1, Ricardo A. MARTÍNEZ2, Lucía LÓPEZ3, José A. TICANTE4,
Andrés A. MUÑOZ3
1
Posgrado en Ciencias Ambientales Area : Medio Ambiente y Salud 2 Facultad de
Ingeniería Química. Ciudad Universitaria. Puebla,Pue. 3 CICM-Lab. de
Microbiología de Suelos. ICUAP. Benemérita Universidad Aut. de Puebla. Edif.. 76
3er.Piso. Unidad de Ciencias. Cd. Universitaria. Puebla, Pue. 4 Depto. de
Investigaciones en Ciencias Agrícolas - ICUAP
Correo electrónico: amugar@yahoo.com
Palabras Clave: resistencia, coliformes fecales, antibióticos, aguas residuales.
RESUMEN
Los efectos a largo plazo que los antibióticos y pesticidas tienen en la salud
humana y el ambiente han comenzado a provocar estragos, los antibióticos y sus
metabolitos, pasan directamente al ambiente poniéndose en contacto con las
poblaciones microbianas, generando la resistencia a dichos antibióticos y a
agentes antibacterianos, cuando ésta resistencia es adquirida o desarrollada en
las bacterias patógenas, se vuelve un problema no tan solo de contaminación del
agua, sino de salud ambiental, representando un fuerte impacto en la salud y en
la economía de las poblaciones. Este trabajo tiene como objetivos determinar la
existencia de bacterias multirresistentes a los antibióticos y antimicrobianos en las
aguas de los ríos Alseseca y Atoyac del Municipio de Puebla, así como identificar
las bacterias con esta característica, poniendo un énfasis especial en los
coliformes fecales. La metodología empleada se basó en muestreos realizados en
dos plantas de tratamiento una que recibe descarga de aguas residuales
municipales, y la otra descarga de aguas residuales municipales e industriales.
Utilizando el método de dilución en placa y siembra por estría masiva se realizó el
aislamiento, en 7 medios diferentes (3 de ellos sin antibiótico y 4 con una cantidad
determinada del antibiótico). Los antibióticos probados fueron Kanamicina (Km),
Ampicilina (Ap), Tetraciclina (Tc) y Cloramfenicol (Cm). Posteriormente se
seleccionaron e identificaron las enterobacterias que presentaron resistencia al
mayor número de antibióticos probados. Se concluyó que la multirresistencia es
mas común en bacterias provenientes de aguas residuales municipales e
industriales, siendo el 90% coliformes fecales, comprobando las hipótesis de este
trabajo.
1
INTRODUCCIÓN
Durante los últimos 50 años se han incrementado las publicaciones de los
efectos a largo plazo que los antibióticos y pesticidas tienen en la salud humana y
el ambiente y las aguas de los ríos son los mayores receptores de estos
contaminantes ( Amin et al. 2004, Giger et al. 2003, Guardabassi et al. 1998 y
Juárez-Figueroa et al. 2003).
Este problema comienza a ser alarmante por que los antibióticos, no
metabolizados, pasan directo al ambiente poniéndose en contacto con las
poblaciones microbianas, produciendo la resistencia a dichos antibióticos y a
agentes antibacterianos, pero lo realmente preocupante es cuando ésta
resistencia es adquirida o desarrollada en las bacterias patógenas, volviéndose un
problema no tan solo de contaminación de agua, sino de salud ambiental, porque
afecta directamente la salud de los seres humanos, representando un fuerte
impacto en la salud y en la economía de las poblaciones aunado a esto se tiene
conocimiento de que los mecanismos de resistencia a metales pesados aumentan
la posibilidad de que las bacterias desarrollen la resistencia a los antibióticos (
Kapil et al. 2005, Kûmmerer 2004, Lenski 1998 ).
La resistencia a los antibióticos se define como una propiedad bacteriana que
confiere la capacidad de inactivar o excluir antibióticos de las células, o un
mecanismo que bloquea el efecto letal o inhibitorio de los antibióticos.
Aunque se sabe que algunas especies bacterianas poseen resistencia
intrínseca previa a la introducción de los antibióticos, la emergencia de la
resistencia a los antibióticos en poblaciones previamente susceptibles ha sido
asociada con el mal uso y abuso de los antibióticos (Wilkinson 1999).
En Puebla tenemos este problema, muchos antibióticos son desechados al
caño y se concentran en los ríos que la rodean, donde el agua industrial es vertida
y lleva contaminantes como los metales pesados, es por esta razón que nace la
inquietud de realizar un trabajo de investigación sobre esto ya que se cree que es
de suma importancia saber si este fenómeno también tiene lugar en los ríos que
atraviesan la ciudad de Puebla.
MATERIALES Y MÉTODOS
Los materiales utilizados fueron, agar Mueller Hinton utilizado con 4 diferentes
antibioticos, Kanamicina (Km) (10 ppm), Ampicilina (Ap) (50 ppm), Tetraciclina (Tc)
(10 ppm), Cloramfenicol (Cm) (10 ppm), y sin antibiótico : agar MacConkey, agar
Pseudomonas con cetrimida (100 mg/l), para la selección de las bacterias,
Solucion salina isotónica (0.85%) para el método de dilución en placa, para las
pruebas de multirresistencia se utilizó nuevamente agar Mueller Hinton con los 4
antibióticos antes mencionados pero a concentraciones iguales o mas altas a Km
(10ppm), Ap (100 ppm), Cm (30 ppm), Tc (30 ppm). Para la identificación se
utilizaron galerias API 20 E, así como agares Cromogénicos como lo son agar
2
Salmonella, y agar CPS ID3, se utilizaron pruebas complementarias como son la
prueba de oxidación y fermentación de glucosa, placas para la prueba de oxidasa
y H2O2 para realizar la prueba de catalasa.
Los métodos empleados fueron el muestreo de acuerdo a las normas oficiales
mexicanas, realizándose 2 muestreos en la planta de Alseseca Sur (descargas de
agua residual tanto municipal como industrial) y un muestreo en la planta del
Parque Ecológico (descarga de agua residual municipal), y la siembra fue
efectuada dentro de las 2 horas posteriores al muestreo por el método de dilución
en placa, sembrándose en los 7 medios arriba descritos, e incubándose a 30° por
tres días, realizándose el aislamiento al tercer día del conteo ( Ashbot 2003).
Una vez realizado el aislamiento de las cepas bacterianas, se realizaron pruebas
complementarias, como siembra en agar Mac Conkey, agar Sulfito de Bismuto que
sirve para identificación de Salmonella, agar Cromogénico CPS ID3 agar,
Chromagar Salmonella que da coloraciones malva o azul para posibles
enterobacterias , agar Soya Tripticasa, la prueba de Oxidación y Fermentación de
glucosa (prueba O/F), la prueba de oxidasa y catalasa. Todas estas pruebas
fueron complementarias para la identificación de las cepas.
Antes de realizar la identificación se llevaron a cabo pruebas para comprobar la
multirresistencia en las bacterias aisladas, esto mediante la siembra de las
mismas en 4 medios con antibióticos diferentes Km, Ap, Cm Tc., a las mas
resistentes y que dieron coloraciones azul, rosa, o verde en el agar CPS ID3, et
aloraciones azul o verde en Chromagar Salmonella, así como coloración negra en
agar sulfito de Bismuto, se realizaron las pruebas de identificación utilizando
galerias API 20E, que son galerias con 20 microtubos, cada uno con una prueba
bioquímica diferente, siguiendo las direcciones del fabricante (Biomerieux),
dejándose en incubación por 1 día a 30° y después registrándose las lecturas.
RESULTADOS
Se realizó la identificación de las cepas mas resistentes en los tres muestreos y se
obtuvieron los resultados de la tabla 1:
Tabla 1 Cepas identificadas
COLIFORME
Escherichia coli
Klebsiella oxytoca
Aeromonas
Pantoea
Citrobacter freundii
No. de CEPAS
9
2
3
3
4
Los resultados de la multiresistencia a antibióticos de las cepas identificadas se
indican en la Tabla2
3
Tabla 2 Cepas identificadas y su resistencia a los antibióticos
Cepa
Identificación
14 Ecol
Aeromonas
hydrophila
group 1
Aeromonas
hydrophila
group 1
Aeromonas
hydrophila
group 1
Escherichia
Coli 1
Escherichia
Coli 1
Escherichia
Coli 1
Escherichia
Coli 1
Escherichia
Coli 1
Escherichia
Coli 1
Escherichia
Coli 1
Escherichia
Coli 1
Escherichia
Coli 1
Citrobacter
freundii
Citrobacter
freundii
Citrobacter
freundii
Citrobacter
freundii
Klebsiella
oxytoca
Klebsiella
oxytoca
Pantoea spp 3
Pantoea spp 1
Pantoea spp 1
28 Ecol
40 Als
21 Ecol
49 Als
18 Als
43 a Als
68 Als
50 Als
43 Als
49 a Als
15 Ecol
9 Als
28 Als
12 Ecol
60 Als
44 Als
44 a Als
34 Ecol
19 Ecol
20 Ecol
Crecimiento en medio Mueller Hinton con
Amp
Km
Cm
Tc
100 ppm
10 ppm
30 ppm
30 ppm
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
-
-
+
+
-
+
+
+
d
+
+
d
d
+
+
+
d
+
+
-
-
-
+
+
+
+
+
+
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
d
-
+
d
+
+
+
+
+
d
+
-
-
-
+
+
d
+
+
+
d
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
d
+
-
+: crecimiento abundante de la cepa
d: crecimiento débil de la cepa
-: no hubo crecimiento
Als: bacterias provenientes de la Planta de Tratamiento de Alseseca
Ecol: bacterias provenientes de la Planta de tratamiento del Parque Ecológico.
Se realizaron pruebas de resistencia a antibióticos a 220 cepas provenientes de
las dos plantas de tratamiento de aguas, y los resultados obtenidos sobre la
4
multirresistencia de la planta de tratamiento de Parque Ecológico se muestran en
la tabla 3 y los porcentajes de esta resistencia se reportan en la Figura 1.
Tabla 3 Multirresistencia de las cepas aisladas de la planta de tratamiento del
Parque Ecológico
Planta de tratamiento del Parque
Crecimiento en:
Ecológico
No. de aislamientos
4 antibióticos
10
3 antibióticos
6
2 antibióticos
14
1 antibiótico
2
Fig.1 Procentajes de Mutirresistencia de cepas
provenientes de la Planta Parque Ecológico
6%
31%
4 antibióticos
3 antibióticos
2 antibióticos
44%
1 antibiótico
19%
Los resultados obtenidos sobre la multirresistencia de la planta de tratamiento de
Alseseca están en la tabla 4 y los porcentajes de esta resistencia están en la
Figura 2
5
Tabla 4 Multirresistencia de las cepas aisladas de la planta de tratamiento de
Alseseca
Planta de tratamiento del
río Alseseca
No. de aislamientos
132
38
12
6
Crecimiento en
4 antibióticos
3 antibióticos
2 antibióticos
1 antibiótico
Fig.2 Porcentajes de Multirresistencia de Cepas
provenientes de la Planta Alseseca
6% 3%
4 antibióticos
20%
3 antibióticos
2 antibióticos
1 antibiótico
71%
DISCUSIÓN
Estos resultados concuerdan con reportes hechos por diversos autores, en los que
se menciona el alto índice de resistencia de las bacterias aisladas provenientes de
ríos cercanos a centros de población y a plantas de tratamiento de aguas
presentan un alto grado de resistencia a los antibióticos de uso más común (Lin et
al. 2005, Roe et al. 2003, Sturtevant et al. 1971)
En otro trabajo realizado en EEUU con respecto a las bacterias provenientes de
ríos y sus niveles de resistencia a los antibióticos, encontraron que los géneros
predominantes fueron Acinetobacter, Alcaligenes, Citrobacter, Enterobacter,
Pseudomonas y Serratia., y con menor frecuencia Klebsiella y Proteus. Otro
hallazgo concordante es que la mayoría de los aislados resistentes a ampicilina,
también fueron resistentes a los otros antibióticos que no son β-lactámicos. La
frecuencia con que se encuentran estas bacterias resistentes hace necesaria la
búsqueda de plásmidos R, lo que nos daría mayor información acerca del origen y
destino de los genes de resistencia a los antibióticos en el ambiente. Así como
6
determinar si existen otros factores asociados, como la resistencia a los metales
pesados (Sader et al. 2005).
Se sabe que las bacterias responden al cada vez mayor empleo de los antibióticos
y otros agentes inhibitorios, generando progenies resistentes a estas sustancias
(Salyers et al. 2004). Mientras que algunas cepas bacterianas adquieren estas
características de resistencia de otras bacterias, muchas desarrollan mutaciones
cromosómicas en el sitio blanco del compuesto antibacteriano (Sader et al. 2005).
Otro tipo de mutación las lleva a activar sus llamadas bombas de expulsión (drug
efflux system) que son una respuesta a señales ambientales o a una mutación en
el gen que regula su expresión. Será motivo de un trabajo posterior dilucidar el
papel que cada tipo de estos mecanismos de resistencia juega en los aislados
provenientes de las plantas de tratamiento de aguas de la ciudad de Puebla
(Wiggins et al. 2003).
CONCLUSIONES
Se concluyó que la multirresistencia es mas común en bacterias provenientes de
la planta de Alseseca donde se tratan tanto aguas residuales municipales como
industriales, siendo el 90% de nuestros aislamientos coliformes fecales.
En el caso del Parque Ecológico 44% de las cepas fueron resistentes a dos
antibióticos, 31% a 4 antibióticos, 19% a tres y 6% a un antibiótico probado. Para
las cepas aisladas de la Planta del Río Alseseca se obtuvo lo siguiente: 71%
fueron resistentes a los 4 antibióticos probados, 20% a 3 antibióticos, 6% a 2
antibióticos y el 3% a uno sólo. En orden de mayor incidencia se han identificado:
Escherichia coli > Citrobacter freundii > Pantoea > Aeromonas > Klebsiella
oxytoca.
AGRADECIMIENTOS
A los miembros del Laboratorio de Microbiología de Suelos del Instituto de
Ciencias de la Benemérita Universidad Autónoma de Puebla por permitirnos sus
instalaciones para la realización de este trabajo.
A los maestros del Posgrado de Ciencias Ambientales que nos apoyan con sus
conocimientos y asesoría.
Al Sistema Operador de las Plantas de Tratamiento de Aguas que nos permitió
tomar las muestras.
7
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