Download Influencia de bacterias rizosféricas en la germinación y crecimiento

Revista Cubana de Ciencia Agrícola
ISSN: 0034-7485
rcca@ica.co.cu
Instituto de Ciencia Animal
Cuba
Bécquer, C. J.; Salas, Beatriz; Slaski, J.; Archambault, D.; Anya, A.
Influencia de bacterias rizosféricas en la germinación y crecimiento inicial de Sporobolus cryptandrus
(Torr.) A. Gray
Revista Cubana de Ciencia Agrícola, vol. 47, núm. 4, 2013, pp. 431-436
Instituto de Ciencia Animal
La Habana, Cuba
Disponible en: http://www.redalyc.org/articulo.oa?id=193029815018
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431
Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 47, Número 4, 2013.
Influencia de bacterias rizosféricas en la germinación y crecimiento
inicial de Sporobolus cryptandrus (Torr.) A. Gray
C. J. Bécquer1, Beatriz Salas1, J. Slaski2, D. Archambault2 y A. Anya2
Estación Experimental de Pastos y Forrajes “Sancti Spíritus”, Apartado 2255, C. P. 62200, Sancti Spíritus, Cuba
2
Environmental Technologies Unit, Alberta Research Council, Vegreville, Alberta, Canadá
Correo electrónico: pastossp@enet.cu
1
Para evaluar el efecto de cepas de rizobacterias en semillas de Sporobolus cryptandrus se aplicó una metodología estándar para la
preparación de los inóculos y la inoculación de las semillas, de acuerdo con lo recomendado en la literatura internacional. Se aplicó un diseño
experimental completamente aleatorizado, con diez tratamientos y diez repeticiones. Se evaluó por ciento de germinación, incremento de
la germinación con respecto al testigo, longitud de la radícula y longitud de la plúmula. En la germinación, los tratamientos con las cepas
MSDJ865 (100 %) y ATCC9039 (100 %) presentaron valores superiores al resto, con incremento de 40 % con respecto al testigo. En la
longitud de la plúmula, los tratamientos con ATCC9039 (19.10 mm), ATCC7486 (19.22 mm) y ORS534 (19.11 mm) resultaron superiores
al testigo. En longitud de la radícula, los tratamientos HA1 (46.10 mm), ORS534 (45.33 mm) y ATCC9039 (44.30 mm) fueron superiores al
testigo y a la mayor parte de los tratamientos. Se concluye que las cepas más sobresalientes en las variables estudiadas fueron ATCC9039,
ORS534, MSDJ865 y HA1. La longitud de la radícula fue la variable con mayor contraste de valores estadísticos causados por la inoculación.
Las cepas pertenecientes a Bradyrhizobium sp. mostraron efectos diferentes en las variables evaluadas, a pesar de su origen taxonómico
común. Se recomienda realizar ensayos de invernadero con las cepas ATCC9039, ORS534, MSDJ865 y HA1, así como estudios similares
en otras gramíneas pratenses.
Palabras clave: inoculación, rizobacterias, gramíneas pratenses.
Sporobolus cryptandrus (Torr.) A. Gray es una
especie pratense que pertenece a la familia Gramineae,
subfamilia Chloridoideae, tribu Zoysieae (Anon 2012),
conocida en América del Norte como hierba de las
praderas, entre otros nombres. Es de gran importancia por
su utilización como pasto para el ganado, principalmente
en zonas templadas. Además, constituye un factor de
control de la erosión de los suelos y forma parte también
del hábitat natural de ciertos animales salvajes (Gleason
y Cronquist 1991).
No obstante, el desarrollo de esta especie vegetal,
y de cualquier otra, depende de diversos factores,
entre los que se encuentra el vigor de la semilla
para una germinación eficaz, así como el rápido
establecimiento de la planta (Mia et al. 2012). Una
de las alternativas que se aplican para estimular
el desarrollo vegetal es la inoculación de semillas
con microorganismos, método que se utiliza para
modificar las poblaciones microbianas próximas a las
plantas, y así promover su desarrollo y productividad
(Harper y Lynch 1979). Según Babalola et al. (2007),
la composición de las asociaciones microbianas en la
superficie de la raíz se puede modificar mediante la
introducción de células bacterianas en la superficie
de semillas, raíces y tubérculos. La capacidad de
estos microorganismos para estimular la germinación
y mejorar el desarrollo de las plantas se ha adaptado
desde condiciones in vitro hasta in vivo en plantas
de importancia agrícola y ornamental (Tsavkelova
et al. 2007).
Los microorganismos útiles, entre los que se incluyen
las bacterias rizosféricas, promueven el crecimiento
vegetal, ya que poseen un número determinado de
propiedades fisiológicas que resultan importantes para la
colonización de la superficie radical y el mejoramiento
del crecimiento y la salud de las plantas (Cassán
2009). Entre estas propiedades, la producción de ácido
indolacético se considera el mecanismo principal
relacionado con la promoción del crecimiento vegetal
(Mehnaz et al. 2010).
En Cuba se cuenta con datos experimentales acerca
del efecto de la inoculación bacteriana en la germinación
de semillas. Tang (1995) realizó ensayos en los que
evaluó el efecto de Azotobacter chroococcum en semillas
de leguminosas y gramíneas pratenses de ecosistemas
cubanos.
Este experimento tuvo como objetivo evaluar,
en condiciones controladas, el efecto de diferentes
especies de bacterias rizosféricas promotoras del
crecimiento vegetal en semillas de Sporobolus
cryptandrus, con el propósito de seleccionar las
cepas más sobresalientes para la fase experimental
de invernadero.
Materiales y Métodos
Procedencia de las cepas bacterianas. Se utilizaron
cepas procedentes del cepario de la Estación Experimental
de Pastos y Forrajes de Sancti Spíritus, Cuba. Otras
provenían de Alberta Research Council y de Agriculture
and Agri-Food Canada, Canadá (tabla 1).
Procedencia y viabilidad de las semillas de
Sporobolus cryptandrus. Fueron donadas por el
Departamento de Recursos Fitogenéticos Nativos
del Alberta Research Council, Canadá y presentaron
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Tabla 1: Relación de cepas utilizadas en el experimento y su identificación
Cepas
SP12
TD1
Género y especie
Bradyrhizobium sp.
Bradyrhizobium sp.
Procedencia
Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus, Cuba
Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus, Cuba
HA1
MSDJ865
ORS534
USDA191
ATCC9039
ATCC7486
ATCC29145
Bradyrhizobium sp.
Mesorhizobium loti
Azorhizobium caulinodans
Sinorhizobium fredii
Beijerinckia indica
Azotobacter chroococcum
Azospirillum brasilense
Estación Experimental de Pastos y Forrajes Sancti Spíritus, Cuba
Agriculture and Agri-Food Canada, Québec, Canadá
Alberta Research Council, Alberta, Canadá
Agriculture and Agri-Food Canada, Québec, Canadá
Agriculture and Agri-Food Canada, Québec, Canadá
Agriculture and Agri-Food Canada, Québec, Canadá
Agriculture and Agri-Food Canada, Québec, Canadá
60-70 % de germinación.
Procedimiento experimental. Todas las cepas de
rizobios crecieron en medio sólido levadura-manitol
(Vincent 1970). Se resuspendieron en medio líquido
levadura-manitol hasta lograr concentración de
107-108 UFC/mL. Las cepas de bacterias dinitrofijadoras
de vida libre (Beijerinckia, Azospirillum y Azotobacter)
crecieron en medio libre de nitrógeno (1L de medio
0.4 g KH2PO4, 0.1 g K2HPO4, MgSO4.7H2O 0,2 g;
NaCl: 0,1 g; FeCL 3: 10,00 mg; Na 2MoO 4.2H 2O:
2,00 mg; malato de sodio: 5,00 g; extracto de levadura:
50,00 mg), descrito por Dalton y Postgate (1969), con
cambios en la fuente de carbono para Beijerinckia
(2 % glucosa) y Azotobacter (2 % manitol). El medio se
utilizó sin cambios para Azospirillum.
Desinfección de las semillas. Las semillas se
esterilizaron mediante la aplicación de etanol 95 %
(30 s), hipoclorito de sodio 4-6 % (2-3 min) y enjuagues
sucesivos en agua destilada estéril (Bécquer 2002).
Aplicación de los inóculos en las semillas. Se
colocaron diez semillas de cada tratamiento en bolsas
hechas con gasa estéril. Estas se sumergieron en los
inóculos a temperatura ambiente, en flujo laminar
durante 4 h. Se sembraron inmediatamente después de
este tiempo (Harper y Lynch 1979). Las semillas para el
testigo se sumergieron en agua destilada estéril.
Germinación de las semillas en las placas Petri.
Se sembraron diez semillas en cada placa de Petri
estéril de 15 cm Ø. Como sustrato de crecimiento se
utilizó agua estéril agarizada (15 %). Se colocaron las
placas en la oscuridad, a 20 ºC. A las 72 h se efectuó la
evaluación, según Harper y Lynch (1979). El por ciento
de germinación se determinó según la fórmula descrita
por Mia et al. (2012):
Por ciento de germinación: número de semillas
germinadas / número de semillas sembradas x 100
Diseño experimental y análisis estadístico. En
un diseño completamente aleatorizado con diez
tratamientos y diez repeticiones, se realizó un análisis
de ANOVA de una vía para experimentos de inoculación
(Somasegaran y Hoben 1994). Las diferencias entre
medias se determinaron por Duncan (1955). Los datos
porcentuales de la germinación se transformaron antes
del análisis estadístico mediante la expresión arcsen√P,
donde P es el valor de la proporción (Sigarroa 1985).
Los tratamientos fueron ATCC9039, ATCC7486,
ATCC29145, MSDJ865, USDA191, ORS534, HA1,
TD1, SP12 y testigo (crecimiento en agua agarizada,
sin inocular). Se evaluaron las variables germinación
(%), longitud de la plúmula (mm) y longitud de la
radícula (mm). También se calculó el incremento de
la germinación (%) de los tratamientos inoculados con
respecto al testigo. Los datos se procesaron mediante el
programa estadístico StatGraphics Plus, para Windows
2.0 (1994-1996).
Resultados y Discusión
En la figura 1 se presentan los tratamientos inoculados
con las cepas MSDJ865 (Mesorhizobium loti) (100 %)
y ATCC9039 (Beijerinckia indica) (100 %). Estos
presentaron valores estadísticamente superiores
(P < 0.001) al resto, con incremento de 40 % con respecto
al testigo (figura 2).
Según Mia et al. (2012), B. indica produce AIA, que
es un factor de estimulación de la germinación de las
semillas. Unido a esto, Thruler et al. (2003) constataron
que B. derxii produce sustancias bioactivas, conocidas
como poliaminas (putrescina y espermidina). Walters
(2000) refiere que estas sustancias pueden modular las
funciones de ácidos nucleicos y proteínas, así como
influir en la estabilidad de la membrana, con afectación
de la proliferación celular y la diferenciación en
organismos superiores. Estas características hacen que
Beijerinckia se considere una bacteria factible para lograr
resultados positivos en en este experimento.
Aunque no se encontraron referencias especificas
acerca del efecto producido por M. loti, en las
semillas, se podría referir lo informado por Santillana
et al. (2005) acerca del aumento de la germinación
en, aproximadamente, 20 % en semillas de tomate
inoculadas con Rhizobium sp., género taxonómicamente
cercano a Mesorhizobium (Bécquer 2002).
En orden descendente, le siguieron los tratamientos
inoculados con las cepas HA1 (Bradyrhizobium sp.),
ORS534 (Azorhizobium caulinodans), ATCC7486
(Azotobacter chroococcum) y ATCC29145 (Azospirillum
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Germinación, %
100
90
a
a
b
b
b
c
80
b
c
d
70
e
60
50
40
30
20
10
0
HA1
SP12
TD1
ORS534
USDA 191 MSDJ 865 ATCC 7486
ATCC
29145
ATCC 9039
Testigo
Datos transformados por arcsen√P antes del análisis
E.E.± 0.005
abcd
Letras diferentes difieren estadísticamente (P < 0.001)
Figura 1. Respuesta de Sporobolus cryptandrus en su germinación al ser inoculado con diferentes cepas de bacterias
rizosféricas
Tratamientos
ATCC 9039
ATCC 29145
ATCC 7486
MSDJ 865
USDA 191
ORS534
TD1
SP12
HA1
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
Incremento de la germinación, %
Figura 2. Incremento de la germinación de Sporobolus cryptandrus con respecto al testigo en los tratamientos
inoculados
brasilense) (90 % cada uno). Estos incrementaron su
germinación en 30 % con respecto al testigo. El resto de
los tratamientos presentaron valores inferiores, entre 80
(USDA191-Sinorhizobium fredii y TD1 Bradyrhizobium
sp. y 70 % (SP12-Bradyrhizobium sp.), con ligero
incremento de 20 y 10 %, respectivamente (figura 2).
El tratamiento inoculado con SP12 (70 %) mostró el
valor estadísticamente inferior con respecto a los demás,
aunque superior al testigo (60 %).
En ninguna de las cepas aplicadas, que tuvieron efecto
altamente positivo en la germinación de Sporobolus
cryptandrus, se descarta que la producción de giberelina
sea una de las causas más probables en este resultado.
Cassán et al. (2009) consideraron esta premisa como
típica para explicar el incremento de la germinación de
soya y maíz inoculados con A. brasilense y B. japonicum.
La baja respuesta de las semillas en la germinación
en el resto de los tratamientos inoculados se pudiera
atribuir a la competencia por el oxígeno por parte de las
células bacterianas y las semillas (Harper y Lynch 1979).
Esto puede estar determinado por la concentración
celular que se utilizó. Kurdish et al. (2008) plantearon
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Revista Cubana de Ciencia Agrícola, Tomo 47, Número 4, 2013.
que la respuesta de las semillas a la bacterización con
A. vinelandii depende también de la especie vegetal
utilizada.
Los tratamientos (figura 3) inoculados con las
cepas ATCC9039 (Beijerinckia indica) (19.10 mm),
ATCC7486 (Azotobacter chroococcum) (19.22 mm)
y ORS534 (Azorhizobium caulinodans) (19.11 mm)
resultaron estadísticamente superiores (P < 0.001) al testigo
(16.50 mm) y a SP12 (Bradyrhizobium sp.) (13.62 mm),
aunque compartieron superíndices con USDA191
(Sinorhizobium fredii) (18.50 mm), TD1 (Bradyrhizobium
sp.) (18.46 mm), MSDJ865 (Mesorhizobium loti)
(18.30 mm), ATCC29145 (Azospirillum brasilense)
(18.22 mm) y HA1 (Bradyrhizobium sp.) (18.00 mm).
Las tres primeras cepas mencionadas, pertenecientes
a diferentes géneros de bacterias dinitrofijadoras, se
destacaron por sus altos valores en el crecimiento del
tallo, pero al compartir superíndices con otro grupo
relativamente grande de cepas indicaron la gran
influencia de las bacterias inoculadas en el desarrollo de
esta parte de la planta. Según Davies (1995), la hormona
giberelina (ácido giberélico) es la responsable de la
elongación del tallo en las plantas. Precisamente algunas
de las cepas que se destacaron en su efecto en esta
variable pertenecen al grupo de microorganismos que
la producen, como Azotobacter spp. (Martínez-Toledo
et al. 1988) y A. brasilense (Janzen et al. 1992). Según
Mia et al. (2012), la elongación del tallo en semillas de
arroz, al ser inoculadas con diferentes cepas de rizobios
y bacterias dinitrofijadoras de vida libre, se debe a la
producción de giberelina por parte de las bacterias de
ambos grupos.
En rizobios, Atzorn et al. (1988) observaron que
Rhizobium leguminosarum también produce esta
hormona, por lo que no se descarta que las cepas de A.
caulinodans, S. fredii, M. loti y Bradyrhizobium sp.,
aplicadas en el experimento, con valores superiores en
la elongación de la plúmula, sean potencialmente altas
productoras de este compuesto.
Con respecto a la longitud de la radícula (figura
4), se observaron valores estadísticamente superiores
(P < 0.001) en los tratamientos inoculados con
las cepas HA1 (Bradyrhizobium sp.) (46.10 mm),
ORS534 (Azorhizobium caulinodans) (45.33 mm) y
ATCC9039 (Beijerinckia indica) (44.30 mm). Estos,
aunque presentaron superíndices comunes con el
tratamiento inoculado con SP12 (Bradyrhizobium sp.)
(41.25 mm), fueron, a su vez, estadísticamente superiores
(P < 0.001) a ATCC29145 (Azospirillum brasilense)
(38.56 mm), USDA191 (Sinorhizobium fredii)
(35.62 mm), testigo (34,32 mm), MSDJ865
(Mesorhizobium loti) (32.40 mm), TD1 (Bradyrhizobium
sp.) (30.50 mm) y ATCC7486 (Azotobacter chroococcum)
(16. 78 mm).
Al igual que en la variable anterior, la influencia
de hormonas específicas que se producen por las
bacterias inoculadas puede ser el mecanismo principal
de estimulación radicular, y no la fijación del nitrógeno
atmosférico. Bashan et al. (2004) consideraron que el
efecto de la fijación de nitrógeno de Azospirillum en
la planta se realiza solo cuando esta alcanza estadios
fenológicos más avanzados. García de Salomone
et al. (2010) aseveraron que el efecto hormonal de
Azospirillum, y no el nitrógeno fijado mejoró la
eficiencia de absorción de N en arroz.
Cassán et al. (2009) aseguraron que el AIA penetra
la corteza seminal y acelera el desarrollo radicular,
con el consiguiente incremento de la absorción de
mm
ab
ab
a
ab
ab
a
ab
a
b
c
E. E.± 0.75
abc
Letras diferentes difieren estadísticamente (P < 0.001)
Figura 3. Respuesta de Sporobolus cryptandrus, longitud de la plúmula al ser inoculado con diferentes cepas de bacterias
rizosféricas
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a
a
a
ab
bc
cd
e
cde
de
f
E.E.± 1.64
abcdef
Letras diferentes difieren estadísticamente (P < 0.001)
Figura 4. Respuesta de Sporobolus cryptandrus, longitud de la radícula al ser inoculado con diferentes cepas de bacterias
rizosféricas
agua y minerales para la planta. La alta capacidad de
Azospirillum de producir AIA ha sido informada también
por Reis Junior et al. (2004).
Los valores inferiores del tratamiento inoculado con
A. chroococcum fueron inferiores al de otros tratamientos
inoculados, como del testigo. Tang (1995), en un
experimento con A. chroococcum inoculado en semillas
de Panicum maximum y Cenchrus ciliaris, determinó
que la germinación y altura de las plántulas decrecieron
con la aplicación de esta bacteria. Este resultado
pudiera indicar una deficiente producción de hormonas
estimuladoras por parte de la bacteria. También se
pudiera atribuir a la regulación de la morfogénesis
radicular por el AIA bacteriano (Dobbelaere et al. 1999).
Los mayores incrementos en la germinación de
las semillas se obtuvieron con la aplicación de las
cepas MSDJ865 (Mesorhizobium loti) y ATCC9039
(Beijerinckia indica), mientras que el mayor efecto
positivo en longitud de la plúmula se obtuvo con
la aplicación de las cepas ORS534 (Azorhizobium
caulinodans), ATCC7486 (Azotobacter chroococcum),
ATCC9039 (B. indica), HA1 (Bradyrhizobium sp.), TD1
(Bradyrhizobium sp.), USDA191 (Sinorhizobium fredii)
y ATCC29145 (Azospirillum brasilense). En longitud
de la radícula, el mejor efecto se logró con ORS534,
ATCC9039, así como con HA1 y SP12. Es obvio que la
cepa ATCC9039 estuvo presente en las cuatro variables,
así como ORS534, MSDJ865 y HA, cada una coincidió
en dos variables con valores estadísticamente superiores.
En la cepa ATCC9039 (B. indica), los altos valores
obtenidos en los tratamientos inoculados con esta cepa
en las variables longitud de la radícula y longitud de la
plúmula se pudieran deber, no solo a las hormonas que
también produce esta especie, sino a la alta producción
de aminoácidos, como glutamina y alanina (Thuler et al.
2003). Estos compuestos, además de mantener bajos los
niveles de N intracelular en la bacteria para una mejor
fijación del N2, quedan a disposición de la planta para
su desarrollo vegetativo.
Las cepas de Bradyrhizobium sp., a pesar de su
ubicación taxonómica común, mostraron disparidad
en su efecto en las variables evaluadas. Esto se explica
por su disímil procedencia territorial, factor que
indudablemente influye de forma diferente en el genotipo
y en la fisiología de cada una de ellas (Bécquer 2002).
Se concluye que las cepas más sobresalientes en
las variables estudiadas fueron ATCC9039, ORS534,
MSDJ865, así como HA1. Es de destacar que la longitud
de la radícula fue la variable con mayor contraste de
valores estadísticos causados por la inoculación. Las
cepas pertenecientes a Bradyrhizobium sp. mostraron
efectos diferentes en todas las variables evaluadas, a
pesar de su origen taxonómico común.
Se recomienda realizar ensayos de invernadero con
las cepas ATCC9039, ORS534, MSDJ865 y HA1, así
como estudios similares de inoculación en otras especies
de gramíneas pratenses.
Referencias
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Recibido: 22 de febrero de 2013