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UNIVERSIDAD NACIONAL DE MISIONES
Facultad de Ciencias Exactas Químicas y Naturales
“2015 - Año del Bicentenario del Congreso de los Pueblos Libres”
TRABAJO PRÁCTICO Nº5
ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (ER)
Objetivo
Con el presente trabajo práctico se pretende
que los alumnos conozcan los principios de
acción de las ER y efectúen la digestión del
ADN genómico total extraído a partir de las
distintas muestras manejadas en prácticos
anteriores.
Introducción
Las primeras herramientas utilizadas por los
biólogos moleculares para la manipulación de
ADN fueron las enzimas de restricción (ER) y
otras enzimas modificadoras de ADN y ARN. A
través de los años, la utilidad de éstas y la
comprensión de los detalles de las reacciones
enzimáticas fueron incrementándose a medida
que se descubrieron nuevas enzimas.
Actualmente existen numerosas enzimas
disponibles comercialmente. Estos avances,
sumados a otros, permitieron la simplificación
de muchas metodologías y la expansión del
campo de la biología molecular.
Las enzimas de restricción se unen y clivan ADN de doble cadena en un sitio específico, o
en sitios adyacentes a una secuencia particular denominada secuencia de reconocimiento o
secuencia diana. Estas enzimas se han clasificado en tres grupos (Ver Tabla I):
Enzimas Tipo I y Tipo III: la misma proteína posee una actividad modificadora (metilación) y el
clivaje es dependiente de ATP. Las enzimas Tipo III cortan el ADN en el sitio de reconocimiento
y posteriormente se disocian del sustrato, mientras que las Tipo I se unen al sitio de
reconocimiento, pero cortan en sitios al azar cuando el ADN se pliega hacia atrás de la enzima
asociada. Ninguno de estos dos tipos de enzima se utiliza en la metodología de clonado.
Enzima Tipo II sistema restricción/modificación: son sistemas binarios consistentes, por un
lado, en una endonucleasa de restricción que cliva en la secuencia nucleotídica específica, y por
otro, en una metilasa que modifica la misma secuencia de reconocimiento. Se han aislado un
gran número de enzimas de restricción Tipo II, muchas de las cuales son utilizadas
rutinariamente en clonación. La gran mayoría de ellas reconocen secuencias específicas que
tienen una longitud que va desde 4 a 6 nucleótidos y que además poseen simetría doble (en la
Tabla II se detalla una lista parcial de enzimas de restricción ordenadas según el tamaño y la
secuencia de reconocimiento). No obstante, unas pocas enzimas reconocen secuencias más largas
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o secuencias que están "degeneradas". La localización del sitio de corte dentro del eje de simetría
binaria difiere de enzima a enzima: Algunas cortan ambas cadenas de ADN exactamente en el
eje de la simetría generando fragmentos con extremos romos; mientras que otras cortan cada
hebra en posiciones similares pero en sitios opuestos al eje de simetría, creando fragmentos de
ADN que poseen terminaciones de simple cadena protruyentes (extremos cohesivos).
Ej. Eco RI
Sitio de corte
5´- GAATTC - 3´
3´- CTTAAG - 5´
5´- G
3´- CTTAA
Secuencia de reconocimiento
AATTC - 3´
G - 3´
Cada vez que EcoRI encuentra esta secuencia
corta entre las bases G y A originando
extremos cohesivos.
Las enzimas de restricción llevan el nombre del microorganismo, y la cepa donde
fueron identificadas. En el ejemplo anterior EcoRI fue aislada de Escherichia coli, cepa R,
siendo ella la primera enzima obtenida de dicho organismo.
En general, diferentes enzimas reconocen diferentes secuencias, no obstante, existen
numerosos ejemplos de enzimas aisladas de fuentes distintas que clivan dentro de la misma
secuencia diana o "target". Ellas se conocen con el nombre de isoesquisómeros.
Digestiones de ADN con enzimas de Restricción:
Los diferentes proveedores de enzimas de restricción recomiendan condiciones de
digestión diferentes inclusive para la misma enzima. Teniendo en cuenta que muchos de ellos
han optimizado las condiciones de reacción para sus preparaciones particulares, se recomienda
siempre seguir las instrucciones suministradas con los viales de la enzima adquirida
comercialmente. Algunos proveedores comercializan además, los buffers concentrados y con su
eficacia verificada para cada lote de enzima purificada. Siempre que sea posible se recomienda la
utilización en conjunto de esos reactivos.
Los buffers de distintas enzimas difieren mayormente en la concentración de ClNa
que contienen. Cuando un ADN va a ser digerido con dos o más enzimas, las digestiones pueden
llevarse a cabo simultáneamente, si ambas enzimas funcionan bien en el mismo buffer. Si las
enzimas poseen diferentes requerimientos, existen dos alternativas posibles a saber:
 El ADN deberá ser digerido primero con la enzima que funciona mejor en el buffer de
baja fuerza iónica. La cantidad apropiada de ClNa y la segunda enzima pueden agregarse
luego y continuar la incubación.
 Puede utilizarse un único buffer (KGB: potasio, glutamato buffer) en el que virtualmente
todas las enzimas funcionan (Hanish y McClelland 1988; McClelland et al., 1988). En la
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Tabla III se muestran las diluciones de KGB que se utilizan para obtener máxima
actividad enzimática de varias enzimas de restricción.
Nota:
Las enzimas de restricción son caras!!!! Los costos pueden mantenerse al mínimo siguiendo
los consejos que se mencionan abajo:

Muchas de las enzimas de restricción son suministradas por el proveedor en forma
concentrada. A menudo, 1µl de muchas de las preparaciones enzimáticas es suficiente para
digerir 1µg de ADN en una hora. Para remover pequeñas cantidades de enzima del vial,
conviene tocar someramente la superficie del fluido con una pipeta mecánica. De esta
manera, es posible remover apenas 0,1 µl de la enzima.

Las enzimas de restricción son estables cuando se mantienen a -20ºC en buffer que contenga
50% de glicerol. Cuando se pretende llevar a cabo una digestión enzimática, es conveniente
preparar primero la mezcla con todos los reactivos excepto la enzima. Una vez que la "master
mix" está preparada, recién entonces es conveniente sacar la enzima del freezer e
inmediatamente colocarla en un recipiente con granizo, para mantenerla siempre en frío. Se
deberá utilizar una punta nueva y estéril cada vez que se necesite cargar enzima. La
contaminación del vial con ADN u otra enzima puede ser muy costosa además de consumirle
al operador mucho tiempo. Se debe trabajar rápidamente de forma que la enzima esté fuera
del freezer el menor tiempo posible. Inmediatamente después de ser utilizada, la enzima debe
retornar al freezer.

Es conveniente mantener los volúmenes de reacción al mínimo, reduciendo al máximo
posible la cantidad de agua en la reacción. No obstante, uno debe asegurarse que la enzima
de restricción contribuya a un volumen menor a 0,1 del volumen final de la mezcla de
reacción, de otra forma se correría el riesgo que la enzima sea inactivada por el glicerol.

A menudo, la cantidad de enzima pude reducirse si se incrementa el tiempo de digestión.
Esto puede resultar un ahorro considerable cuando se necesitan cortar grandes cantidades de
ADN. Se pueden tomar pequeñas alícuotas de los tubos de reacción y correr la muestra en
minigeles con el objeto de monitorear el progreso de la digestión.

Cuando se digieren muchas muestras de ADN con la misma enzima, es conveniente calcular
la cantidad total de enzima que será necesaria, más un pequeño exceso para subsanar las
pérdidas involucradas en la transferencia de varias alícuotas. Así se podrá remover la
cantidad calculada de enzima de la solución stock y mezclarla con el volumen apropiado del
buffer 1X de la enzima. Posteriormente se agregan alícuotas de la mezcla buffer-enzima en la
mezcla de reacción.
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Modelo De Protocolo Para Digestión Con Enzimas De Restricción
A continuación el procedimiento que sigue es para una reacción típica que contenga 0,2-1µl
de ADN. Para digestiones de cantidades mayores de ADN, será necesario ajustar
apropiadamente la reacción.
1. Colocar la solución de ADN en un tubo estéril de microcentrífuga y mezclar con suficiente
agua para llegar a un volumen de 18µl.
2. Agregar 2µl del buffer de digestión 10X apropiado. (Puede utilizarse 2X KGB si los
volúmenes de la solución se ajustaron apropiadamente). Mezclar con golpecitos suaves.
2 X KGB
20mM glutamato de potasio
50 mM Tris-acetato (pH 7.5)
20mM de acetato de magnesio
100 ug/ml albúmina sérica bovina (BSA)
1mM b-mercaptoetanol
3. Agregar 1-2 unidades de enzima, y mezclar de la misma forma que en punto 3.
Una unidad (U) de enzima usualmente se define como la
cantidad requerida para digerir completamente 1µg de
ADN en una hora en el buffer recomendado y a la
temperatura recomendada en una reacción de 20µl. En
general las digestiones en períodos mayores de tiempo o
con exceso de enzima no causan problemas a menos que
exista una contaminación con ADNasas o exonucleasas.
Tales contaminaciones son raras en las preparaciones
enzimáticas comerciales.
4. Incubar la mezcla a la temperatura adecuada y por el tiempo requerido.
5. Parar la reacción mediante el agregado de 0,5 M EDTA (pH 8,0) a una concentración final de
10 mM.
6. Si el ADN se analizará directamente en un gel, entonces agregar 2-4 µl de buffer de carga,
mezclar con vórtex, y colocar la digestión en el "slot" o muesca del gel.
Si el volumen de la reacción de digestión es demasiado grande para sembrarlo en la
muesca del gel, el ADN podrá concentrarse de acuerdo a diferentes procedimientos:
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Luego de mantener la reacción mediante la adición de EDTA, agregar un volumen
de 0,6 de acetato de amonio 5 M y 2 volúmenes de etanol. Mantener el tubo en frío por
5 min, y luego centrifugar a 12.000g por 5 min a 4ºC. Descartar el sobrenadante, que
contiene mucha proteína. Dejar secar el pellet a temperatura ambiente. Disolver el ADN en
volumen apropiado de TE (pH 7.6).
Alternativamente se puede reprecipitar el ADN con ClNa 3 M y dos volúmenes de
etanol siguiendo el protocolo utilizado en el práctico de extracción.
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PARTE PRÁCTICA
A) Antes de efectuar una digestión de ADN genómico total es necesario conocer algunas
características de la enzima de restricción a utilizar. Con la ayuda de catálogos identificar
los siguientes aspectos de HaeIII:
Fuente de donde es extraída la enzima
Sitio diana (apunte la secuencia)
Temperatura a la que opera la enzima
Buffer en el que actúa
Costo de la enzima
Detalle:
¿Qué resultados espera obtener luego de la digestión con la ER? ¿Cómo se observaría a
luz UV el ADN digerido luego de una electroforesis en gel de agarosa?
B) A continuación se le presentarán una serie de fotografías que corresponden a fragmentos
de ADN digeridos con: TaqI, HinfI, AluI, MboI, HaeIII y DdeI, con el objeto de
determinar diferencias intra (entre sexos) e interespecíficas. Las corridas fueron
realizadas en geles de agarosa al 2%.
Determinar:
 Buscar en catálogos las características de las diferentes enzimas a utilizar de igual
forma que en el punto A.
 Reconocer, con la ayuda de catálogos, qué marcador de PM se utilizó en las
diferentes corridas electroforéticas. Detallar el tamaño de las diferentes bandas del
mismo.
 Estimar el tamaño de las diferentes bandas producto de la digestión de una enzima
cualquiera.
 Elaborar un mapa de restricción tentativo para las diferentes enzimas utilizadas.
 Determinar si con alguna de las enzimas se detectaron diferencias intra o
interespecíficas.
 Discutir los resultados.
C) Utilizando el siguiente número de acceso M24401.1 del NCBI rescate la secuencia del gen
Zfy-2 de Mardon and Page (1994). Ubique los primers (AK1 y AK2) con la herramienta
del NCBI. Verifique el tamaño del amplicón. Levante la secuencia delimitada por los
primers y traslade al programa NEB CUTTER (www.tools.neb.com). Proceda a efectuar
la digestión con las ER detalladas en el punto B. Determine: (a) cuántos sitios de
reconocimiento para cada ER posee el fragmento amplificado? (b) la posición de los
diferente sitio diana para las diferentes ER. (c) Genere una corrida electroforética
electrónica que le permita discriminar los fragmentos discretos producto de la digestión
con las diferentes enzimas. (d) Compare con los datos de las digestiones realizadas en las
fotografías entregadas.
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