Document related concepts
Transcript
Universidad Nacional del Nordeste Secretaria General de Ciencia y Técnica COMUNICACIONES CIENTÍFICAS Y TECNOLÓGICAS 2008 Aislamiento de una proteasa del veneno de Bothrops alternatus (yarará grande) mediante extracción líquido - líquido Gómez, Gabriela N.(1) - Nerli, Bibiana(2) - Acosta, Ofelia C.(3) - Picó, Guillermo A.(2) - Leiva, Laura C.(1) Identificación del Plan “Aplicación de Sistemas Bifásicos Acuosos (SBA) para el aislamiento de una proteasa del de Trabajo / Proyecto: veneno de Bothrops alternatus (yarará grande)” Facultad / Instituto: (1) Lab Química Biológica - FaCENA - UNNE; (2) FFyB - UNR; (3) FCV - UNNE Domicilio: Av. Libertad 5400 - 3400 - Corrientes - Argentina Teléfono/Fax: 03783 - 457996 int. 112 Palabras Claves: Biotecnología - Extracción - Cromatografía - E-mail: bioq_g@yahoo.com.ar RESUMEN En la actualidad, ha crecido la aplicación farmacológica de ciertos componentes proteicos de venenos ofídicos, como así también su empleo como reactivos analíticos. La metodología vigente para su purificación es la cromatografía en columna. Sin embargo, es de interés disponer de técnicas menos costosas, con mayor capacidad de muestra a procesar. Así, la biotecnología de aislamiento de proteínas, mediante reparto en sistemas bifásicos acuosos resulta una opción con potencial aplicación en venenos ofídicos. El objetivo de este trabajo fue aislar, mediante la extracción liquido-líquido empleando sistemas bifásicos acuosos (SBA), una enzima con actividad proteolítica del veneno de Bothrops alternatus. En una primera instancia se buscaron las condiciones óptimas de extracción de la enzima de interés a partir del veneno entero (peso molecular del polímero, polietilenglicol - PEG, pH, fuerza iónica y temperatura). El SBA definido se preparó por gravimetría (12,3 – 13,7 - 74 % P/P de fosfato, PEG3300 y agua respectivamente) obteniéndose dos fases acuosas, superior rica en polímero e inferior, enriquecida en la sal. La adición del veneno y posterior mezclado a 25ºC, permitió el reparto de sus componentes en ambas fases. Se evaluó la actividad de las distintas enzimas (proteolítica, fosfolipásica y coagulante mediante los tests de azocaseína, hemólisis radial indirecta y tiempo de trombina, respectivamente) en cada fase, en el reparto inicial, y en cada una de las renovaciones de fase superior que se practicaron (tres). La capacidad extractiva del sistema sobre las proteínas fue apropiado para la extracción de la enzima de interés, permaneciendo en la fase inferior sólo cantidades importantes de proteínas de peso 55 kDa compatibles con proteasas y de 16 kDa compatibles con fosfolipasas dadas las actividades enzimáticas detectadas . Si bien estas proteínas también aparecen en las distintas renovaciones de fase superior, exhiben mayor actividad enzimática en la fase inferior. Por cromatografía de filtración molecular se procedió a la separación de estas dos clases de proteínas presentes en la fase inferior, la fosfolipasa y la enzima de interés (proteasa). En la primeras fracciones recolectadas se detectó la proteasa, por medidas de actividad proteolitica sobre azocaseína, y se confirmó su pureza por electroforesis en gel de poliacrilamida, donde se visualizó una banda homogénea de 55kDa. La extracción líquido-líquido resultó apropiada para pre-purificar la enzima a partir de una mezcla compleja como es el veneno crudo. La combinación con una cromatografía de tamiz molecular, optimizó su aislamiento. Se concluye que esta metodología innovadora es potencialmente aplicable para el aislamiento de proteasas presentes en el veneno de B. alternatus. 4, 5 y 6 de Junio de 2008 - Campus Universitario “Deodoro Roca” - Avda. Libertad 5400 - (3400) Corrientes – Argentina.
