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Baeza, R. ; Rossler, C. E. ; Mielnicki, D. M. ; Zamora, M. C. ; Chirife, J. Predicción del crecimiento de Staphylococcus aureus en un alimento cárnico dejado a temperatura ambiente por varias horas : aplicación a varias ciudades argentinas de climas cálidos Documento de Investigación Facultad de Ciencias Agrarias Este documento está disponible en la Biblioteca Digital de la Universidad Católica Argentina, repositorio institucional desarrollado por la Biblioteca Central “San Benito Abad”. Su objetivo es difundir y preservar la producción intelectual de la Institución. La Biblioteca posee la autorización del autor para su divulgación en línea. Cómo citar el documento: Baeza, R., Rossler, C. E., Mielnicki, D. M., Zamora, M. C. y Chirife, J. (2010), Predicción del crecimiento de Staphylococcus aureus en un alimento cárnico dejado a temperatura ambiente por varias horas : aplicación a varias ciudades argentinas de climas cálidos [en línea]. Proyecto de Investigación. Universidad Católica Argentina. Facultad de Ciencias Agrarias. Disponible en: http://bibliotecadigital.uca.edu.ar/repositorio/investigacion/prediccion-crecimiento-de-staphylococcusaureus.pdf [Fecha de consulta: ….........] (Se recomienda indicar fecha de consulta al final de la cita. Ej: [Fecha de consulta: 19 de agosto de 2010]). 1 VII Edición del PREMIO ArgenINTA a la Calidad Agroalimentaria : Categoría 1: Investigación Básica y Aplicada en inocuidad y calidad “Predicción del crecimiento de Staphylococcus aureus en un alimento cárnico cocido dejado a temperatura ambiente por varias horas : aplicación a varias ciudades argentinas de climas cálidos” (*) R. Baeza, C.E. Rossler, D. M. Mielnicki, M.C. Zamora y J. Chirife Facultad de Ciencias Agrarias, Pontificia Universidad Católica Argentina Capitán General Ramón Freire 183, Ciudad de Buenos Aires (*) email : zamoramariacl@gmail.com 1 2 1) RESUMEN EJECUTIVO La intoxicación alimentaria causada por Staphylococcus aureus se debe a la ingestión de alimentos contaminados que contienen las enterotoxinas producidas por algunas cepas de la bacteria. La aparición de los síntomas de esta intoxicación es usualmente rápida y en la mayoría de los casos severa, dependiendo de la susceptibilidad individual a la toxina, de la cantidad de alimentos contaminados ingeridos, de la cantidad de toxinas presentes en los alimentos consumidos y de la salud general del huésped. Los síntomas más comunes son náuseas, vómitos, arcadas, calambres abdominales y postración. La venta callejera de alimentos es una práctica habitual en casi todo el mundo. La Comisión FAO/OMS del Codex Alimentarius define los "alimentos de venta callejera" como alimentos listos para el consumo preparados y/o comercializados por vendedores fijos o ambulantes especialmente en las calles y otros lugares públicos similares. Aunque esos alimentos son una fuente importante de nutrientes de bajo costo, listos para el consumo para la población urbana de pocos recursos, los riesgos sanitarios que conllevan esos alimentos pueden contrarrestar sus beneficios. En el presente trabajo se utilizó un método simplificado para predecir la velocidad de crecimiento de la bacteria S. aureus en un alimento contaminado de carne cocida cuando se deja por varias horas a temperatura ambiente diurna (“abuso” de temperatura). Para la predicción se combinaron datos meteorológicos de la evolución de la temperatura ambiente en un día caluroso de enero, en varias ciudades de la Argentina, con datos experimentales de literatura sobre tiempos de generación y tiempo lag del S. aureus inoculado en un alimento cárnico cocido. Las predicciones se hicieron utilizando perfiles de temperatura ambiente característicos de las ciudades de, Buenos Aires, Córdoba, Formosa, La Rioja, Posadas, Resistencia, San Juan, San Luis y Santiago del Estero. Los resultados permitieron estimar el tiempo necesario para que dicho alimento cárnico contaminado con S. aureus alcance valores compatibles con la producción de enterotoxina, cuando se deja a temperatura ambiente en período diurno en época de verano. Los resultados obtenidos mostraron que para que la predicción sea exacta, se debe utilizar el perfil diario de la temperatura (p.e. mediciones de temperatura cada hora) a lo largo del período diurno considerado, ya que el uso de un valor promedio de la temperatura ambiente diaria sobreestima el tiempo calculado a causa del enfriamiento nocturno. Los resultados son de particular interés en relación a la inocuidad de los alimentos que se comercializan en la venta callejera de alimentos, los cuales se pueden contaminar con S. aureus y generalmente permanecen a temperatura ambiente por varias horas. También permiten estimar y comparar el tiempo para el crecimiento de la bacteria en diferentes ciudades cálidas de la Argentina ; por ejemplo para que el recuento de S. aureus en el alimento considerado se incremente tres ciclos log ( a partir de la terminación del período lag) en un día típico de enero (mes más cálido de la Argentina), es de 3,7 horas en la ciudad de La Rioja y de 5,4 horas en Buenos Aires. 2 3 2) JUSTIFICACION DEL TRABAJO El Staphylococcus aureus es una bacteria capaz de producir una toxina estable al calor que causa enfermedad en los humanos. La intoxicación se produce por ingestión de enterotoxinas producidas en el alimento por S. aureus, usualmente a causa de que el alimento se dejó a temperatura ambiente por períodos considerables (Walls & Scott, 1997). Los alimentos que requieren mucha manipulación durante la preparación y se mantienen a temperatura ambiente son los que usualmente están involucrados en este tipo de intoxicación. El-Sherbeeny et al. (1985) determinaron el perfil microbiológico de alimentos listos para el consumo obtenidos de vendedores callejeros en Egipto a lo largo de 3 años. Las 114 muestras de de alimentos analizados incluían carne, vísceras bovinas, pescado, arroz, y platos preparados conteniendo arroz, vegetales y ensaladas, macarrón, leche, queso, etc. El 41% de las muestras analizadas para Staphylococcus aureus fueron positivas y el 51 % de ellas tenían recuentos igual ó superior a 1.000 ufc/gramo. Muleta y Ashenafi (2001) estudiaron el perfil bacteriológico y la temperatura de almacenamiento de un total de 150 muestras de alimentos de venta callejera en Addis Ababa. Las muestras se almacenaron en el rango de 15.5 a 34.5 °C y de un total de 1542 cepas bacterianas aisladas, Staphylococcus representó el 22.8%. S. aureus puede crecer en un amplio rango de temperaturas (7 a 40°C) con un óptimo de 35 a 37° C, rango que puede ser frecuente en climas cálidos. La toxina producida por esta bacteria es muy estable al calor y no se destruye por los procedimientos culinarios habituales. La venta de alimentos en las calles está muy difundida en varios países de América Latina y aunque satisfaga la obtención de comidas rápidas y de bajo precio, las condiciones higiénicas en la preparación, almacenamiento y venta de estos alimentos, constituyen una amenaza a la inocuidad de los mismos. Aunque los microorganismos patógenos que se han detectado en alimentos vendidos en las calles no difieren de los encontrados en las comidas preparadas y servidas en establecimientos cerrados, los problemas potenciales son mayores y más frecuentes. La World Health Organization (WHO, 1996) realizó una encuesta en más de 100 países para evaluar la situación respecto a la venta callejera de alimentos. La mayoría de los países informaron que la contaminación del alimento y abuso de condiciones de tiempo/ temperatura eran los factores que más contribuían a las enfermedades transmitidas por este tipo de alimentos. Existen además numerosos tipos de alimentos cocidos que se mantienen en vitrinas de restaurants y negocios de comidas preparadas por varios horas sin refrigeración, siendo las carnes cocidas, el jamón, los productos que contienen huevo, pollo, papa, ensaladas de fideos, tartas de vegetales y carnes, buenos sustratos para que S. aureus bacteria crezca y produzca la toxina. En la venta callejera de alimentos, éstos se suelen preparar a menudo en condiciones poco higiénicas y se mantienen por largos períodos a temperatura ambiente, por lo que el tiempo transcurrido entre la preparación y su consumo es un factor importante en relación a la inocuidad de los mismos. Por ejemplo, los vendedores callejeros suelen cocinar el alimento a la mañana y lo mantienen a temperatura ambiente por la mayor parte del día (Mensah et al., 2002). Es importante reconocer que el término “temperatura ambiente” es muy vago e impreciso, dado que la temperatura diaria nunca es constante y los productos alimenticios se ven expuestos a una temperatura que cambia continuamente a lo largo del día. En general los estudios para evaluar el riesgo para este tipo de situación se realizan a una temperatura constante que se identifica con 3 4 alguna temperatura “promedio” del ambiente. Sin embargo, este procedimiento puede no reflejar adecuadamente el perfil real de temperatura a la cual la bacteria es expuesta en un dado período del día (por ej. en períodos diurnos). El propósito del presente trabajo es estimar el grado de crecimiento de S. aureus, en un alimento en base a carne cocida, que se deja varias horas a temperatura ambiente durante el período diurno y en climas cálidos típicos de varias ciudades de la Argentina. En todos los casos se considera el mes de enero que es el más caluroso del año en la Argentina. Además se comparan las predicciones que se obtienen según se utilice el perfil real de temperatura (temperatura/ tiempo) ambiente a la que se ve sometido el alimento, o un valor promedio de la temperatura ambiente diaria. 3) RESULTADOS Análisis de los datos de temperatura ambiente La Tabla 1 muestra la ubicación geográfica de las ciudades argentinas seleccionadas, Buenos Aires, Córdoba, Formosa, La Rioja, Posadas, Resistencia, San Juan, San Luis y Santiago del Estero; la Tabla muestra también la temperatura ambiente media para el mes de enero (mes más caliente del verano) en Argentina para la década 1981-1990. Se puede observar que las temperaturas medias de enero están entre 24 y 27ºC para las diferentes locaciones geográficas seleccionadas. Estos datos se obtuvieron del Servicio Meteorológico Nacional que utiliza estaciones convencionales de medición de temperatura para monitorear la temperatura ambiente. También se obtuvieron registros de la temperatura ambiente horaria (24 medidas por día) para un dado día del mes de enero (9 de enero del 2006) en las ciudades elegidas. La Fig. 1 muestra los perfiles de temperatura en las ciudades mencionadas. A los efectos del presente trabajo consideramos que el alimento de carne cocida se preparó y contaminó temprano en la mañana (8:00 am) y luego se almacenó a temperatura ambiente durante el día hasta que se consumía. Tal como se muestra en la Fig. 1, a las 8:00 am la temperatura en las ciudades seleccionadas estaba en el rango de 25 a 30°C ; luego aumentaban lentamente y permanecían varias horas a 35-40 ºC para luego decrecer al caer la tarde y hacia la noche. Es de hacer notar que el mencionado rango (35-40°C) está muy cercano a la temperatura óptima de crecimiento de S. aureus. Cinética del crecimiento de S. aureus en una tarta cárnica almacenada a temperatura constante La ICMSF (1996) reportó el tiempo de generación (GT) y la duración de la fase lag de S. aureus inoculado (recuento 3 ciclos log/gr) en una tarta cocida elaborada en base a carne de pH 5.8 y actividad de agua 0.98, almacenada a varias temperaturas constantes. La Fig. 2 muestra la correlación de esos parámetros, tiempo lag y GT con la temperatura en el rango de interés de este trabajo. Se puede observar que el tiempo lag (Fig. 2a) decrece rápidamente al aumentar la temperatura acercándose a un valor asintótico por arriba de aproximadamente 25°C. El tiempo de generación también decrece al aumentar la temperatura. (Fig. 2b) estando ambos comportamientos de acuerdo con lo esperado (Zwietering et al., 1994). A los efectos de este trabajo se hicieron estimaciones del crecimiento de S. aureus utilizando un enfoque simplificado. El mismo consiste en el uso de la bien conocida relación entre el número de células bacterianas a un tiempo dado (Nt), el número original 4 5 de células (No), GT, y tiempo (t) Nt = No . 2 t/GT ecuación (1) donde (t) representa en este caso el tiempo transcurrido luego de completada la fase lag. A los efectos de las predicciones de crecimiento en la tarta de carne, (No) se toma como 3 ciclos logarítmicos (valor del inóculo) y el tiempo de duración de la fase lag adquiere el valor de 3 horas ya que ya que por arriba de 25°C el mismo es constante (Fig. 2 a). La aplicación de la ecuación (1) es válida sólo para predicciones en la fase de crecimiento exponencial ; en el presente trabajo el mayor valor predicho de S. aurreus se limita a 106 ufc/gr, el cual se encuentra dentro de la fase de crecimiento exponencial. GT se correlacionó empíricamente con la temperatura (en el rango de 25 a 42 ºC) por la siguiente ecuación obtenida a partir del ajuste de datos que se muestran en la Fig. 2b, GT = -0.0185. T3 + 2.1314. T2 – 82.205 . T + 1083.5 ecuación (2) donde T es temperatura en ºC. Se supone que la tarta cárnica cocida se contaminó a las 8:00 am. , por lo cual se tomó 3 horas como tiempo lag ya que éste valor corresponde al rango de temperatura ambiente en todas las ciudades estudiadas a esa hora de la mañana (Fig.1). El crecimiento de S. aureus expuesto a temperaturas ambientes cambiantes se calculó (ecuación. 1) por medio de la suma acumulada de varios intervalos de una hora dentro del intervalo de tiempo total considerado. GT se evaluó (ecuación. 2) a la temperatura media de cada intervalo de 1 hora. Los cálculos de crecimiento acumulativo se dieron por terminados cuando la población de S aureus (Nt) alcanzaba 106 ufc/gr, el cual es un recuento asociado generalmente con la producción de la enterotoxina. El número exacto de S. aureus que se requiere para producir enfermedad no puede ser predicho con absoluta certeza a causa de que muchas variables pueden afectar la cantidad de enterotoxina producida en un alimento contaminado. Stewart et al. (2003) indicaron que la dosis de enterotoxina para causar enfermedad se alcanza cuando la población de S. aureus es mayor que 105 UFC/gr. Niskanen and Nurmi (1976) reportaron que contaminaciones de S. aureus por encima de 2 .10 6 UFC/ gr estaban asociadas con la producción de enterotoxinas en salchichas semisecas ; Walls and Scot (1997) encontraron que la toxina no se producía en un producto cárnico cocido (pH 5.6 y aw 0.98, incubado a 35°) hasta que el recuento fuera superior a 1.2 . 106 ufc/gr. A los efectos de las predicciones del presente trabajo es entonces razonable tomar como 1. 10 6 ufc/gr la cantidad de células a partir de la cual se puede suponer la presencia de enterotoxina. La microbiología predictiva comprende el uso de modelos matemáticos para predecir el crecimiento, supervivencia e inactivación de los microorganismos a diferentes condiciones de estrés. Por ejemplo, se han usado funciones sigmoideas para predecir con exactitud la típica curva de crecimiento microbiano desde el período lag hasta la fase estacionaria (Baranyi & Roberts, 1995; Gibson et al.,1988; Ratkowsky et al.,1983; Zwietering et al., 1990). Esos modelos fueron generalmente desarrollados bajo “condiciones estáticas” lo cual significa que las velocidades de crecimiento y tiempos lag se midieron a valores constantes de temperatura. Un aspecto de mucha importancia para la microbiología predictiva es estimar el crecimiento bajo condiciones de temperatura cambiante (ICMSF , 1996) como sería el caso en la venta callejera de alimentos. Shaw (1967) y otros autores (Baranyi & Roberts, 5 6 1995; Baranyi et al., 1995; Mitchell et al., 1994) han reportado trabajos sobre el efecto de temperaturas fluctuantes en el crecimiento microbiano. Dependiendo de la magnitud del cambio de temperatura el microorganismo puede modificar su velocidad de crecimiento a otra velocidad a la nueva temperatura, o puede parar de crecer si se introduce una fase lag. Langeveld y Cuperus (1980) encontraron que las bacterias que están dentro de la fase de crecimiento exponencial responden rápidamente a un cambio de la temperatura ambiente. Zwietering et al. (1994) también mostraron que los cambios durante la fase de crecimiento exponencial (en un rango moderado de temperatura) conducen en forma inmediata a una nueva velocidad de crecimiento asociada a la nueva temperatura. Sin embargo, es de hacer notar que cambios hacia o desde temperaturas bajas suelen resultar en un periodo de adaptación de la bacteria. En el presente trabajo se considera que las células de S. aureus expuestas a temperaturas ambientes que cambian continuamente durante períodos diurnos (Fig. 1), se adaptan continuamente a una nueva velocidad de crecimiento característica de la nueva temperatura. Esta suposición se basa en dos hechos importantes : a) los cambios de temperatura ambiente ocurren en un rango que está cercano al óptimo de crecimiento de S. aureus y , b) la velocidad de incremento de la temperatura diurna es bajo ya que está comprendida entre 1 y 2 °C /hora para todas las ciudades argentinas estudiadas en este trabajo, tal como se puede determinar a partir de los datos que se muestran en la Fig. 1. Estos factores indican que se puede descartar la existencia de un shock de temperatura de calor o baja temperatura que pueda afectar a las células bacterianas; por otra parte, los cambios en la temperatura ambiente considerados en este trabajo están muy lejos de la temperatura mínima (7-8°C) para el crecimiento de S. aureus. La Tabla 2 muestra el cálculo del tiempo necesario para que se produzca un incremento de 3 ciclos log (partiendo de una contaminación de 103 ufc/gr) en el recuento de S. aureus en la tarta de carne cocida, utilizando diferentes enfoques para la especificación de la “ temperatura ambiente”. A saber, 1) perfil temperatura/tiempo (temperatura cada hora) dentro de un período diurno para el día 9 de enero del 2006 ; 2) usando la temperatura media del 9 de enero del 2006 ; y 3) utilizando la temperatura media del mes de enero para la década 1981-1990. Se puede apreciar que los tiempos para el incremento de 3 ciclos log (a contar desde un tiempo lag de 3 horas) son considerablemente más cortos cuando se considera el perfil (temperatura/tiempo) de la temperatura ambiente del día especificado (9 de enero del 2006), que cuando se usa simplemente la temperatura media de dicho día, lo cual se debe al enfriamiento nocturno. El uso de la temperatura media del mes de enero para la década 1980-1990 también conduce a una sobreestimación aún mayor de los valores actuales. Es interesante destacar que para que el recuento de S. aureus se incremente tres ciclos log va desde 3,7 horas para La Rioja hasta 5,4 horas en Buenos Aires. El tiempo total para que el recuento de S. aureus alcance 106 ufc/gr se calcula sumando el tiempo lag de 3 horas (que es igual para todas las provincias) al tiempo de crecimiento exponencial. Así resulta que los tiempos totales para que el alimento contaminado con 1000 ufc/gr a las 8:00 am alcance un recuento asociado con la producción de enterotoxina están entre 6.7 horas (La Rioja) a 8.4 horas (Buenos Aires), cuando se consideran los perfiles temperatura/tiempo para el día considerado (9 de enero del 2006). Si hubiéramos tomado la temperatura media del día mencionado el rango predicho estaría entre 8.0 horas (La Rioja) y 10.2 horas (Buenos Aires); es así que la utilización de la temperatura media diaria sobreestima las predicciones de tiempo de crecimiento. La Fig. 3 compara en forma gráfica los tiempos de crecimiento predichos utilizando la temperatura actual diaria (perfil temperatura/tiempo), la temperatura media del día o el promedio de la década para el mes de enero. 6 7 4) CONCLUSIONES Las predicciones realizadas en este trabajo, utilizando datos experimentales de velocidad de crecimiento de S. aureus en una tarta cocida de carne, indican claramente que para estimar el crecimiento de S. aureus en un alimento contaminado dejado a temperatura ambiente en períodos diurnos, no se deben utilizar los valores de temperatura media diaria sino los perfiles temperatura/tiempo a lo largo del período considerado. Esto se debe al enfriamiento nocturno y se verificó con predicciones hechas usando datos de perfiles de temperatura en período diurno ó valores medios para el día, a partir de registros del Servicio Meteorológico Nacional para 9 ciudades argentinas (Buenos Aires, Córdoba, Formosa, La Rioja, Posadas, Resistencia, San Juan, San Luis y Santiago del Estero. Esta conclusión es de mucha importancia a fin de estimar el riesgo microbiológico (pérdida de inocuidad) asociado con la venta callejera de alimentos que una vez preparados se suelen dejar durante varias horas a temperatura ambiente en período diurno antes de que sean consumidos. Agradecimientos Se agradece la colaboración del PEPACG, UCA, CONICET 5) REFERENCIAS Baranyi J, Roberts TA. Mathematics of predictive food microbiology. Int J Food Microbiol 1995; 26: 199-218. Baranyi J, Robinson TP, Kaloti A, Mackey BM. Predicting growth of Brocothrix thermosphacta at changing temperature. Int J Food Microbiol. 1995; 27: 61-75. 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