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2016 Volumen 17 Nº 12 - http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n121216.html
REDVET - Revista electrónica de Veterinaria - ISSN 1695-7504
Inducción de antibiorresistencia en Escherichia coli
enterotoxigénica con cobre - Induction of antibiotic-resistance
in enterotoxigenic Escherichia coli with cooper
Barreto Argilagos, Guillermo (1) Rodríguez Torrens, Herlinda de la
C. (2) Barreto Rodríguez, Herlinda de la C. (3)
(1)
Facultad de Ciencias Aplicadas a la Industria. Universidad de
Camagüey Ignacio Agramonte Loynaz, Camagüey, Cuba.
(2)
Facultad de Ciencias Agropecuarias. Universidad de Camagüey
Ignacio Agramonte Loynaz, Camagüey, Cuba.
(3)
Universidad Médica Carlos J Finlay, Camagüey, Cuba.
Contacto: guillermo.barreto@reduc.edu.cu
Resumen
El sulfato cúprico tiene una gran utilización como promotor de crecimiento en
las producciones porcinas pese a los riesgos ecológicos que presupone. El
trabajo tuvo como objetivo evaluar el efecto in vitro del cobre como inductor
de antibiorresistencia en Escherichia coli enterotoxigénicas; para lo cual las
cepas de referencia A-1 (O149: K91: K88ac) y E68-I (O141: K85: K88ab) se
crecieron en agar Mueller-Hinton acorde a la técnica de gradientes de
concentraciones en rangos que se elevaron semanalmente desde un mínimo
de cinco hasta un máximo de 50 mg/mL de CuSO4. Ambas bacterias se
sometieron a subcultivos, por espacio de tres semanas, en paralelo a
controles sembrados en igual medio pero sin el inductor.
Al finalizar el
experimento se realizaron antibiogramas para evaluar la sensibilidad frente a
los antibióticos: Gentamicina, Kanamicina, Tetraciclina, Cloramfenicol,
Carbenicilina y Ácido Nalidíxico. Solo los efectuados al grupo experimental
brindaron halos compatibles a fenotipos resistentes. Se concluyó que los
resultados evidencian la capacidad del cobre de inducir antibiorresistencia
bacteriana in vitro, lo cual es un elemento más a considerar en las
producciones porcinas que emplean esta sal como promotor de crecimiento.
Palabras claves: antimicrobianos; enteropatógenos; entorno; promotores de
crecimiento; porcino; tolerancia.
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Abstract
Cupric sulfate has been used as growth promoter in swine productions for a
long time instead of the ecological risks involved. The paper had the objective
of evaluating the effect of cooper as inductor of antibiotic-resistance in
enterotoxigenic Escherichia coli.
The reference strains A-1 (O149: K91:
K88ac) and E68-I (O141: K85: K88ab) were cultivated on Mueller-Hinton Agar
plates following the gradient concentration technique with ranges increased
weekly from 5 till 50 mg/mL of CuSO4. Both bacteria were streaked during
three weeks in parallel to controls cultured in pure medium without the
inductor. At the end of the experiment the sensibility of bought groups to
Gentamicin, Kanamycin, Tetracycline, Chloramphenicol, Carbenicilin and
Nalidíx Acid was measured. Only the variants treated with cooper exhibited
halos referred as resistant to the antibiotics evaluated. It was concluded that
he results demonstrated the capability of cooper to develop bacterial
antibiotic-resistance in vitro, another trait to be considered by producers when
salts of this metal are used as growth promoters.
Keywords:
antimicrobials;
promoters; swine; tolerance.
environment;
enteropathogens;
growth
Introducción
El uso de sulfato cúprico como promotor del crecimiento data de mediados del
siglo XX. Su efectividad en gran medida se ha asociado a la acción antagónica
del metal sobre enteropatógenos como Escherichia coli enterotoxigénica
(ECET) y Salmonella, por mencionar dos casos. Pese a ello, desde las
primeras experiencias existió el temor por la toxicidad del catión (Apley et al.,
2012). Más recientemente se comprobó que tenía implicaciones ecológicas ya
que las heces de los animales tratados contenían concentraciones de cobre
14 veces superiores a las de los que no lo consumían y su acumulación ejercía
una acción negativa en los suelos. De mantenerse esta práctica, de acuerdo a
modelos predictivos, en un lapso de 10 a 50 años las concentraciones del
catión en este medio excederá los límites permisibles (Seiler y Berendonk,
2012).
La colibacilosis, es una de las principales causas de mortalidad y pérdidas
económicas en las producciones porcinas (Barreto et al., 2015). E. coli se ha
caracterizado por una sorprendente adaptabilidad a los ambientes más
adversos, incluidos aquellos con elevadas concentraciones de metales pesados
(Barreto y Rodríguez, 2009). Relacionado a este tema, en una antigua
publicación se refiere la alta frecuencia de cepas de Escherichia coli
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enterotoxigénicas polirresistentes aisladas de crías con diarrea en una granja
ubicada en una zona con altos niveles de cobre (Barreto y Karadjov, 1986).
Esta investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto in vitro del cobre como
inductor de antibiorresistencia en Escherichia coli enterotoxigénica.
Materiales y métodos
La investigación de realizó en el laboratorio de Microbiología de la Facultad de
Ciencias Aplicadas a la Industria de la universidad de Camagüey Ignacio
Agramonte Loynaz.
Cepas
Se utilizaron las cepas de referencia Escherichia coli enterotoxigénicas A-1
(O149: K91: K88ac) y E68-I (O141: K85: K88ab) (Colección del Dr. Harley W.
Moon. Animal Disease Center, Agricultural Research Service. U.S. Department
of Agriculture, Ames Iowa 50010. USA). Hasta el momento de su utilización se
conservaron en caldo Mueller-Hinton glicerinado (30 %) a - 8 ºC.
Inducción de antibiorresistencia con CuSO4
Para inducir antibiorresistencia in vitro se prepararon placas de Petri standard
con agar Mueller-Hinton acorde a la variante de gradientes de concentraciones
(Karadjov, 1985) con rangos de 5 – 25; 10 – 30 y 15 - 50 mg/mL de CuSO4 la
primera, segunda y tercera semana, respectivamente. Luego de realizada la
siembra en línea recta (de menor a mayor concentración), se incubó a 37 ºC
hasta obtener crecimientos, a partir de los cuales, tomando con asa de la
zona de mayor concentración en cobre, se efectuaron subcultivos en la forma
descrita. Paralelamente, A-1 y E68-I se sometieron a un número igual de
pases pero en agar Mueller - Hinton sin presencia de la sal de cobre, como
control del experimento. Al finalizar el mismo se hicieron antibiogramas a
ambos grupos según se establece en Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility
Test Protocol (Hudzicki, 2009); esta determinación contó con tres réplicas; el
diámetro notificado para cada halo fue el promedio de las mediciones hechas
en dos sentidos perpendiculares con una regla graduada en milímetros.
Resultados y discusión
Tanto E. coli A-1, como su homóloga E68-I, luego de su caracterización como
cepas de referencia, se han mantenido en ambientes de laboratorio ajenas al
contacto con antimicrobianos de todo tipo, como evidencia su pobre
crecimiento al finalizar la primera semana (Fig.1a). No obstante, con el
transcurso del tiempo, y pese al aumento en los gradientes del metal, ambas
logran una exuberante multiplicación a lo largo de la línea de siembra que
arriba al límite izquierdo de la placa Petri, zona con la máxima concentración
de cobre (Fig. 1 b y c). Aunque en las imágenes se aprecia lo acontecido a
seis ECET, solo se discutirá lo relativo a las de referencia (A-1 y E68-I).
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Se ha publicado que la tolerancia a los metales se incrementa en la medida
que se prolonga el contacto bacteriano con los mismos ya que en el tiempo se
van activando genes de respuesta a estrés y de resistencia (Harrison et al.,
2007). Los mismos pueden estar ubicados en plásmidos o en el nucleoide,
también denominado cromosoma bacteriano; gran parte de las
investigaciones testimonian el predominio de los primeros en cuanto se refiere
a la resistencia frente al Cu, lo cual no obvia la participación de los segundos,
como propone la revisión realizada por Cooksey (2006).
En el caso de A-1, el
incremento
en
la
tolerancia al cobre pudo
estar
asociado
a
la
abundante producción de
biofilm,
aspecto
apreciable
durante
la
tercera
semana
de
exposición a este metal
(Fig. 2). Se trata de un
mecanismo que minimiza
el
acceso
de
estos
cationes al citoplasma
celular, al quedar fijados
en la abundante masa de
mucílagos que rodea a las
bacterias (Harrison et al.,
2007;
Barreto
y
Rodríguez, 2010).
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En los antibiogramas realizados, al finalizar la tercera semana del
experimento, se comprobó que el diámetro de los halos de inhibición de las
cepas de expuestas al cobre era menor a los obtenidos en los controles. Esta
reducción, acorde a lo notificado por Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility
Protocol (Hudzicki, 2009), corresponde a valores propios de resistencia a cada
uno de los antibióticos investigados (Cuadro 1).
Como se ha declarado previamente, E. coli A-1 y E68-I, debido a su
conservación por años en ambientes de laboratorio, resultan sensibles a una
amplia gama de antibióticos, incluso a aquellos con un uso tan extenso como
Tetraciclina y Cloramfenicol, como se aprecia en el diámetro de los halos
exhibidos (Cuadro 1), razón que las ha convertido en idóneas para este tipo
de estudio (Barreto et al., 2006).
Se trata de seis antibióticos, cuatro de los cuales han tenido una extensa
utilización tanto en la terapéutica humana como la veterinaria (Gentamicina,
Kanamicina, Tetraciclina y Cloramfenicol) mientras que la Carbenicilina y el
Ácido Nalidíxico solo se han empleado en los primeros (Formulario Nacional de
Medicamentos, 2006). Sus mecanismos de acción son diferentes, de allí que,
al no ser objeto de esta investigación, se trate de brindar una respuesta a los
resultados en función de las cepas ensayadas, ambas gramnegativas, y lo
referido en la literatura consultada.
Cuadro 1: Efecto del CuSO4 en la sensibilidad de E. coli (A-1 y E68-I) a los
antibióticos evaluados.
Antibióticos (diámetro de los halos de inhibición en mm)
Cepas
Gentamicina Kanamicina Tetraciclina Cloramfenicol Carbenicilina Ac.
Nalidíxico
E68-
18
19
20
20
23
20
11
10
14
12
2
13
A-1
19
18
19
19
23
19
A-1*
10
7
12
10
0
11
I
E68I*
Criterios de sensibilidad a los antibióticos, según Kirby y Bauer (Hudzicki, 2009).
(Diámetro en mm)
R
S
R
S
R
S
R
S
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R
S
R
S
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15
13
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14
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13
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Leyenda: E68= cepa de referencia Escherichia coli E68-I; A-1= cepa de referencia Escherichia
coli A-1; *Cepas tratadas con CuSO4; Ác= ácido; R= resistentes; S=sensibles.
Se ha notificado la capacidad de ciertos metales pesados, como el cobre, para
expandir y mantener el pool de bacterias entéricas grampositivas resistentes
a antibióticos como la tetraciclina (Amachawadi et al., 2013).
Lamentablemente,
no ha existido un interés igual en el caso de las
representantes gramnegativas, a pesar de incluir a enteropatógenos como
ECET y Salmonella, como acredita la investigación realizada por Agga et al.
(2014), quienes concluyen que el papel de la suplementación de cobre a
cerdos destetados y la resistencia al metal, y a los antibióticos analizados, en
el caso de E. coli requiere de otras investigaciones que profundicen al
respecto.
Al tratarse de ECET, el resultado obtenido puede estar asociado a dos
mecanismos: a)
la intensificación del eflujo, ante la exposición a
concentraciones crecientes de cobre, para la extrusión del metal hasta el
entorno circundante, fenómeno que, de forma cruzada, propicia también la
eliminación de los antibióticos ensayados (Seiler y Berendonk, 2012); una
opción muy probable desde el punto de vista teórico, para la que se carece de
las evidencias necesarias. b) Incremento en la producción de biofilm en
respuesta a la acción tóxica en aumento del catión, algo ya discutido
previamente y que, como enfatizan Reis et. al., (2014), favorece en grado
superlativo la resistencia general a los antimicrobianos.
Finalmente, resulta un hecho probado que la presencia de metales pesados en
los medios naturales promueve la co-selección de bacterias resistentes a los
mismos que a la vez resultan tolerantes a determinados antibióticos, aunque
estos últimos no estén presentes (Seiler y Berendonk, 2012).
Los resultados discutidos concuerdan con lo analizado anteriormente y,
además, constituyen un alerta en cuanto a la práctica de incorporar CuSO4
como aditivo en las dietas para porcinos, máxime si se tiene en cuenta que las
proporciones sugeridas a los productores son muy variables (Zhao et al.,
2014). En la propuesta, seis antibióticos, por acción del cobre, disminuyeron
su efectividad frente a E. coli, incluido el Ácido Nalidíxico, uno de los más
utilizado frente a enteropatógenos como ECET y Shigella (Cisneros et al.,
2008).
Conclusión
La exposición in vitro de Escherichia coli a concentraciones crecientes de
CuSO4
induce resistencia en estas bacterias frente a los antibióticos
Gentamicina, Kanamicina, Tetraciclina, Cloramfenicol, Carbenicilina y Ácido
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Nalidíxico, lo cual es un elemento más a considerar en las producciones
porcinas que emplean esta sal como promotor de crecimiento.
Agradecimientos
Los autores desean expresar su agradecimiento al Dr.C. Nelson Izquierdo
Pérez, de la Facultad de Ciencias Agropecuarias, por su auxilio en el escaneo
de las fotografías utilizadas en el artículo.
Referencias
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





AGGA
GE; SCOTT, H.M.;
AMACHAWADI, R.G.; NAGARAJA, T.G.;
VINASCO, J.; BAI, J. et al. 2014. Effects of chlortetracycline and copper
supplementation on antimicrobial resistance of fecal Escherichia coli
from weaned pigs. Preventive Veterinary Medicine; 114, 231–246.
AMACHAWADI RG., SCOTT, H.M., ALVARADO, C.A., MAININI, T.R.,
VINASCO, J.,DROUILLARD, J.S. and NAGARAJA, T.G. 2013. Occurrence
of the transferable copper resistance gene tcrB among fecal enterococci
of U.S. feedlot cattle fed copper-supplemented diets. Appl. Environ.
Microbiol. 79,4369–4375.
APLEY MD., BUSH, E.J., MORRISON, R.B., SINGER, R.S. and SNELSON,
H. 2012. Use estimates of in-feed antimicrobials in swine production in
the United States. Foodborne Pathog. Dis; 9, 272–279.
BARRETO G. and KARADJOV J. 1986. Antibiorresistencia en cepas de E.
coli aisladas de cerdos diarreicos procedentes de zonas contaminadas
con metales pesados y libres de contaminación en la República Popular
de Bulgaria. Rev. Prod. Anim 2 227-230.
BARRETO G., VELÁZQUEZ B., PEÑA Y and RODRÍGUEZ H. 2006.
Evaluación in vitro de extractos de Eucalyptus citriodora Hook y
Eucalyptus saligna Sm. como posibles antisépticos mamarios. Rev. Prod.
Anim, 18 135-140.
BARRETO, G. y RODRÍGUEZ, H. 2009. La cápsula, algo más que una
estructura no esencial (Revisión). Rev. Prod. Anim; 20, 69-80.
BARRETO G. y RODRÍGUEZ H. 2010. Biofilms bacterianos versus
antimicrobianos. Nutracéuticos: una opción promisoria (Artículo de
revisión). Rev. prod. anim, 22, 20-30.
BARRETO G., RODRÍGUEZ H., BERTOT A. and DELGADO R. 2015.
Microorganismos autóctonos multipropósitos (MAM) para el control y
prevención de la colibacilosis neonatal porcina. Rev. Prod. Anim, 27, 1619.
CISNEROS RI., BARRETO G., GUEVARA G. and RODRÍGUEZ, H. (2008).
Presencia de Shigella spp y resistencia al ácido nalidíxico en la provincia
de
Camagüey,
Cuba.
monografías.com
Disponible
en:
http://www.monografias.com/trabajos59/shigellaspp-resistente-acidonalidixico-cuba/shigellaspp-resistente-acido-nalidixico-cuba.shtml.
[Consultado el 15 de marzo de 2015].
Inducción de antibiorresistencia en Escherichia coli enterotoxigénica con cobre
http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n121216/121624.pdf
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







COOKSEY DA. 2006. Copper uptake and resistance in bacteria.
Molecular Microbiology, 7, 1-5.
FORMULARIO NACIONAL DE MEDICAMENTOS. 2006. Editorial Ciencias
Médicas. La Habana: 120, 127, 130, 134 y 306.
HARRISON JJ., CERI H. and TURNER R. J. 2007. Multimetal resistance
and tolerance in microbial biofilms. Nat. Rev. Microbiol, 5, 928–938.
HUDZICKI
J. 2009. Kirby-Bauer Disk Diffusion Susceptibility Test
Protocol, ASM Microbe Library, American Society for Microbiology.
Disponible
en:
http://www.microbelibrary.org/component/
resource/laboratory-test/3189-kirby-bauer-disk-diffusion-susceptibilitytest-protocol. [Consultado el 12 de enero de 2016].
KARADJOV J. 1985. Formation of an exopolysaccharide capsular layer
on the surface of some bacteria under the influence of pesticides and
heavy metals. Cmtes rendus de l’ Académie Bulgare des Sciences, 38,
223 – 225.
REIS AC. M.; SILVA, J. O.; LARANJEIRA, B. J.; PINHEIRO, A. Q. and
CARVALHO, C. B. M. 2014. Virulence factors and biofilm production by
isolates of Bacteroides fragilis recovered from dog intestinal tracts. Braz.
J. Microbiol. 45 (2). Disponible en: http://dx.doi.org/10.1590/S151783822014000200037
SEILER C. and BERENDONK TU. 2012. Heavy metal driven co-selection
of antibiotic resistance in soil and water bodies impacted by agriculture
and aquaculture. Frontiers in Microbiology, 3 (399): Disponible en:
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23248620. [Consultado el 9 de
enero de 2016].
ZHAO J., ALLEE G., GERLEMANN G., MA L., GRACIA M. I., PARKER D.,
VAZQUEZ-ANON M. and HARRELL R. J. 2014. Effects of a Chelated
Copper as Growth Promoter on Performance and Carcass Traits in Pigs.
Asian Australas. J. Anim. Sci, 27, 965-973.
REDVET: 2016, Vol. 17 Nº 12
Este artículo Ref. 121624 (Recibido 04/02/2016 – Revisado 04/03/2016 – Aceptado 03/11/2016 – Publicado 15/12-2016) está
disponible en http://www.veterinaria.org/revistas/redvet/n121216.tml concretamente en
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