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6CFE01-245
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Evidencias de selección local en genes candidatos y caracteres relacionados con la
resistencia a la sequía a lo largo del rango de distribución del pino canario
LÓPEZ, R1., LÓPEZ DE HEREDIA, U.1, COLLADA, C.1, CANO, F.J.1, EMERSON, B.C.2,
COCHARD, H.3 y GIL, L.1
1
Grupo de Investigación de Genética y Fisiología Forestal. ETSI Montes. UPM.
Grupo de Ecología y Evolución en Islas. IPNA-CSIC.
3
Physique et Physiologie Intégratives de l’Arbre Fruitier et Forestier. INRA.
2
Resumen
Los actuales escenarios de calentamiento global indican que las masas forestales de climas
mediterráneos se enfrentan a una creciente presión selectiva para adaptarse a condiciones más
xéricas. En este contexto, la variación genética se presenta como un importante sustrato para
que los procesos selectivos actúen y generen genotipos adaptados a nuevos ambientes. La
adaptación de poblaciones o individuos al ambiente donde habitan puede estimarse a partir de
la asociación entre la variación de parámetros ambientales y los caracteres fenotípicos
obtenidos en ensayos de procedencia, tales como crecimiento o supervivencia, o bien con los
SNPs (mutaciones puntuales) presentes en regiones codificantes o reguladoras de genes cuya
función está potencialmente involucrada en la variación observada para un determinado
carácter. El estudio del análisis de asociación entre SNPs y fenotipos de interés permite
además la identificación de variantes alélicas (Quantitative Trait Nucleotides, QTNs), con la
que se puede establecer una estrategia de selección asistida basada en genes candidatos. Esta
metodología facilita la selección de genotipos de interés en base a su secuencia de ADN
reduciendo el coste de pruebas fenotípicas y posibilitando la selección para caracteres
complejos con alta interacción ambiental.
En este trabajo analizamos los patrones de variación de genes candidatos de poblaciones a lo
largo de todo el rango de distribución de Pinus canariensis. También en parámetros
fisiológicos del xilema implicados en la conducción de agua hasta las hojas y la resistencia a
la cavitación, relacionados los primeros con el crecimiento y los segundos con la
supervivencia. Esta especie habita en un archipiélago donde la migración es limitada y donde
se han sucedido procesos complejos de extinción y recolonización. El análisis de asociación
mostró gradientes clinales ambientales pronunciados para algunos genes candidatos. En
particular, la aridez parece ser el factor ambiental que ha ejercido mayor presión selectiva en
la especie. Estos resultados se vieron reforzados por las diferencias entre poblaciones en lo
referente a la resistencia a la cavitación del xilema y su alta correlación con la supervivencia
en las regiones más áridas.
Palabras clave
Diferenciación genética, variación clinal, test de neutralidad, Fst, Qst, resistencia a la
cavitación, conductividad hidráulica.
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1. Introducción
Aunque la disponibilidad de agua ha sido considerada como uno de los motores de la
distribución de las especies (RAMÍREZ-VALIENTE ET AL., 2009), el aumento actual de las
temperaturas y de los periodos de sequía en un escenario de cambio climático global puede
superar el potencial de las especies longevas para hacer frente a las nuevas condiciones
ambientales (IPCC, 2007). La facilidad de adaptación de estas especies a los cambios en el
entorno es función a corto plazo de la capacidad de cada individuo para alterar su estructura y
función (plasticidad fenotípica), mientras que a medio y largo plazo las migraciones y la
variabilidad genética son más importantes, ya que permiten que los mecanismos de selección
actúen y originen cambios en la estructura poblacional (NICOTRA ET AL., 2010). En este
contexto, la identificación de los mecanismos de resistencia a la sequía y de los genes
implicados permitiría comprender los procesos evolutivos que intervienen en la adaptación de
las plantas al estrés hídrico y seleccionar aquellos genotipos potencialmente adaptados, así
como asegurar la sostenibilidad de los bosques.
Un objetivo importante de la genética de poblaciones es identificar la base genética de
la diferenciación fenotípica adaptativa y la acción de los procesos selectivos en la misma
(GONZÁLEZ-MARTÍNEZ ET AL., 2007). Dos categorías de procesos evolutivos
determinan la diferenciación entre poblaciones. La primera incluye los procesos evolutivos
neutrales (por ejemplo migración o deriva genética). La segunda está relacionada con la
selección natural bajo distintas condiciones ambientales (STILL ET AL., 2005). Un
procedimiento habitual para discernir entre la influencia de ambas categorías en la
diferenciación poblacional consiste en la comparación entre el grado de diferenciación
genética obtenida mediante marcadores neutrales (Fst; Wright, 1951) y la divergencia de
caracteres cuantitativos fenotípicos (Qst; SPITZE, 1993). Cuando la diferencia de caracteres
fenotípicos es mayor que la observada en caracteres moleculares neutrales (Qst > Fst) se
considera como una evidencia de selección natural divergente, es decir que diferentes
genotipos están favorecidos bajo condiciones ambientales diferentes (MERILÄ &
CRNOKRAK, 2001). Los recientes progresos en genómica permiten mejorar los estudios de
adaptación de las especies a diferentes entornos y proporcionan herramientas útiles para
predecir su respuesta ante futuros escenarios ambientales (COCHARD ET AL., 2009;
GRIVET ET AL., 2009). En particular, se pueden comprobar desviaciones de la neutralidad a
través de tests desarrollados recientemente que son independientes de la demografía (LI ET
AL., 2012) y, posteriormente, incorporados en comparaciones de Fst / Qst.
Otra forma de poner de manifiesto la acción de la selección natural es detectar variación
genética clinal a lo largo de gradientes ambientales (GRIVET ET AL., 2011). Para ello se
intentan identificar correlaciones entre los patrones de frecuencias alélicas o regiones
codificantes no neutrales de genes candidatos y las variables ambientales, que pueden actuar
como agentes selectivos que promueven la selección natural (HANCOCK ET AL., 2011). De
manera más intuitiva, podemos encontrar indicios sólidos de adaptación local a partir de la
asociación de las variables ambientales con caracteres fenotípicos obtenidos a partir de
ensayos de procedencia. La evidencia de selección cobra mucha más fuerza si se puede
mostrar también una correlación entre el fenotipo / genotipo de interés (por ejemplo, el
momento de brotación) y una medida de fitness (por ejemplo, el número de supervivientes de
la progenie) (HANCOCK & DIRIENZO, 2008).
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Las Islas Canarias constituyen un archipiélago sometido a vulcanismo activo desde hace
más de 20,6 millones de años (CARRACEDO ET AL., 1998). La intensidad y recurrencia de
los eventos volcánicos varían ampliamente dentro y entre islas (JUAN ET AL., 2000) y, junto
con la heterogeneidad del hábitat y la actividad humana, se cree que son los principales
determinantes de la diversidad genética y la ecología de la biota canaria (EMERSON, 2002;
DE NASCIMENTO ET AL., 2009; LÓPEZ DE HEREDIA ET AL., 2010). Las condiciones
climáticas de las islas son diversas debido a su fisiografía y localización geográfica. Los
vientos Alisios húmedos de dirección noreste y los vientos saharianos secos del este provocan
grandes clinas ambientales que varían conjuntamente con la xericidad y la edad de aparición
de las islas: las islas occidentales (La Palma, El Hierro, Tenerife, La Gomera) son más
húmedas, modernas y geológicamente menos estables que las islas orientales (Fuerteventura,
Lanzarote, Gran Canaria).
El pino canario es el único pino endémico del Archipiélago Canario. La expansión y
diferenciación de sus poblaciones parecen ser resultado de una dinámica de extinciones
locales y recolonización en las que el vulcanismo ha jugado un papel decisivo. En la
actualidad abarca condiciones ambientales muy variadas. Crece espontáneamente desde casi
el nivel del mar hasta cerca de 2.400m y existen masas naturales desde en ambientes
subdesérticos con menos de 300 mm de precipitación anual hasta en bosques mixtos de pinos
y frondosas con más de 1.500 mm.
2. Objetivos
En este trabajo intentamos discernir entre efectos demográficos y procesos selectivos en
la diferenciación genética de las poblaciones de pino canario mediante el análisis de genes
candidatos y de la variación ambiental y fenotípica de caracteres cuantitativos obtenidos en
ensayos de procedencias. Por un lado compararemos la estructura genética espacial del pino
canario obtenida con a partir de los genes estudiados con la diferenciación fenotípica entre
poblaciones obtenida en ensayos de procedencias para detectar procesos selectivos. Por otro,
intentaremos identificar regiones génicas que se desvíen de la neutralidad para estudiar
posteriormente si existe alguna correlación con las condiciones ambientales actuales de las
poblaciones. Por último comprobaremos si existe alguna relación entre los caracteres
fenotípicos y la diversidad genética molecular para identificar posibles genes candidatos, es
decir genes implicados en alguno de los caracteres cuantitativos medidos en campo tales
como la supervivencia, el crecimiento, la eficiencia hidráulica y la vulnerabilidad a la
cavitación.
3. Metodología
3.1. Análisis de genes candidatos
Hemos seleccionado 24 poblaciones naturales de P. canariensis para la secuenciación
de genes candidatos (Figura 1). De cada población recogimos acículas de 24-26 árboles,
excepto de las poblaciones marginales en las que el tamaño muestral se redujo a 3-10 árboles.
Como grupo externo (outgroup) utilizamos 7 muestras de P. pinea, debido a su proximidad
filogenética con P. canariensis (ECKERT y HALL, 2006). Para la extracción de DNA
utilizamos el kit Invitek (Invisorb® Spin Plant Mini Kit). Se secuenciaron amplicones de 8
genes nucleares (Tabla 1) usando cebadores transferidos de P. pinaster (GRIVET ET AL.,
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2011), P. sylvestris (PALMÉ ET AL., 2008), P. taeda (BROWN ET AL., 2004) y varias
especies del subgénero Strobus (TSUTSUI ET AL. 2009).
Tabla 1. Genes nucleares secuenciados, función en la que están potencialmente implicados y tamaño de la secuencia
analizada (en pares de bases).
ID gen
cad
lp3-3
CCoAOMT
gapCp
eph
phy
pal
rps10
Categoría funcional
Biosíntesis de la lignina (fin de la ruta de
biosíntesis del monolignol)
Estrés hídricos (pertenece a la familia de
genes ASR)
Biosíntesis de la lignina (reforzamiento de la
pared celular)
Ciclo de Calvin en la fotosíntesis y glicólisis
citosólica. Tiene un papel en el desarrollo de
la raíz
Respuesta frente a ataques de patógenos
Proteínas azules de cobre involucradas en el
transporte de electrones
Biosíntesis de compuestos fenilpropanos en
el desarrollo de la lignina
Síntesis de proteínas
Total (bp)
Región
codificante
(bp)
Región no
codificante
(bp)
412
301
111
404
237
167
511
264
247
566
197
369
642
332
310
484
223
261
408
283
125
392
298
94
La alineación de las secuencias la realizamos con CLUSTALW en el software
BIOEDIT (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/page2.html). Para estimar dos haplotipos por
individuo en cada locus utilizamos el programa PHASE (STEPHENS ET AL., 2001). En total
obtuvimos entre 6 y 52 secuencias de haplotipos por población. A partir de las mismas
calculamos varios estadísticos de diversidad molecular con el programa DnaSAM 5.1
(ECKERT ET AL., 2009). La diversidad de nucleótidos la estimamos con los parámetros θπ
(Nei, 1987) y θW (WATTERSON, 1975), y para la diversidad haplotípica utilizamos el
estadístico Hd de Nei (1987). Para construir las redes de haplotipos para cada gen seguimos el
método Median Joining Network implementado en el programa SplitsTree 4 (HUSON &
BRYANT, 2006). La distribución de la variabilidad genética individual, poblacional y entre
islas la calculamos a través de un AMOVA para cada locus con el programa Arlequin 3.11
(EXCOFFIER ET AL., 2005). Obtuvimos las matrices de valores Fst considerando el modelo
de sustitución para cada locus obtenido con jModeltest 0.1.1 (POSADA, 2008).
Para detectar desviaciones de la neutralidad de cada gen candidato utilizamos distintos
tests de selección obteniendo que para el pino canario estos genes pueden considerarse
neutrales, es decir, en principio no sometidos a procesos selectivos.
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Figura 1. Izquierda: Median Joining Network de los 22 haplotipos encontrados para P. canariensis y P. pinea. Los
colores representan la frecuencia de cada haplotipo en cada isla (TF=Tenerife; GC=Gran Canaria; LP=La Palma; EH= El
Hierro; LG=La Gomera; PP=Pinus pinea. Derecha: Localización de las poblaciones naturales muestreadas para el análisis
molecular con la distribución de haplotipos del gen GapCP.
3.2. Supervivencia, crecimiento y parámetros hidráulicos de las poblaciones en un
ensayo de procedencias multilocalidad
De las 24 poblaciones utilizadas para el análisis genético, 19 están representadas en un
ensayo de procedencias multilocalidad de pino canario. Para el propósito de este trabajo
utilizamos tres de las parcelas de ensayo: Los Realejos, en el norte de Tenerife, como
representativa de ambiente húmedo influenciado por el mar de nubes, su precipitación media
anual varía entre 700-800 mm más la precipitación horizontal; Fasnia que se encuentra en una
de las zonas más secas de Tenerife, con una valor medio de 460 mm de precipitación anual y
orientación sudeste y Tirajana, en el sur de Gran Canaria, situada en un ambiente casi
desértico con apenas 300 mm de precipitación anual y suelos con muy poca retención de agua
(para una descripción más detallada del los ensayos ver LÓPEZ ET AL., 2007).
Durante los seis primeros años tras el establecimiento de las plantaciones, en 1999,
medimos la supervivencia, altura y diámetro de todos los árboles. En 2010 realizamos las
curvas de vulnerabilidad a la cavitación en ramas de 8 procedencias utilizando la técnica del
Cavitron (COCHARD ET AL., 2005). Utilizamos ramas de 16-28 individuos por procedencia
de los dos sitios de ensayo más extremos, Los Realejos y Tirajana. A partir de las curvas de
vulnerabilidad se estimaron los parámetros P12, P50 y P88 (potencial hídrico al que se produce
el 12%. 50% y 88% de pérdida de conductividad hidráulica, respectivamente). En las mismas
ramas evaluamos la eficiencia hidráulica a través de la conductividad específica, Ks y la
conductividad específica foliar, Kl (más detalles acerca del cálculo de los parámetros
hidráulicos en LÓPEZ ET AL., 2013).
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La proporción de la variación total entre poblaciones de los caracteres fenotípicos se
calculó con el estadístico Qst, dividiendo la varianza genética aditiva total en dos
componentes: interpoblacional (σB) e intrapoblacional (σw):
Qst =
=
donde h2 es la heredabilidad en sentido estricto, y n el número de sitios de ensayo.
Asumimos un valor de h2 = 0.2 basándonos en valores en la bibliografía para otros pinos ya
que no existen datos publicados de pino canario. Estimamos los componentes de la varianza:
varianza de la población (Vα), varianza de la interacción población x sitio de ensayo (Vαβ) y
varianza residual (Vε), utilizado la opción REML del procedimiento VARCOMP en SAS a
partir del modelo:
Yij = µ + αi + βj + αβij + ε
donde Yij es el valor fenotípico de la procedencia i-ésima en el sitio j; µ es la media
poblacional, αi es el efecto de la i-ésima procedencia, βj es el efecto del j-ésimo sitio, αβij es la
interacción entre la i-ésima procedencia en el sitio j, y ε es el error experimental.
La distribución e intervalos de confianza de los Qst los calculamos mediante
bootstrapping. Para detectar diferencias entre los valores medios de los Fst y Qst, se
generaron 1000 bootstrap para ambos estadísticos (WHITLOCK, 2008). Posteriormente
comparamos los intervalos de confianza al 95% de las distribuciones de ambos estadísticos.
3.3. Caracterización ambiental de las poblaciones
Medimos las coordenadas geográficas (X_UTM, Y_UTM y altitud) de cada población
con un GPS. Las variables climáticas las obtuvimos a partir de las bases de datos del
GRAFCAN
(http://www.grafcan.es/)
y
de
la
AEMET
(http://www.aemet.es/es/serviciosclimaticos/datosclimatologicos). Para la caracterización de
las poblaciones seleccionamos: precipitación media anual, precipitación media estacional,
precipitación máxima en 24 horas, temperatura media anual, temperatura mínima anual,
temperatura máxima anual, temperatura media máxima, temperatura media mínima, rango
anual de temperaturas, evapotranspiración potencial total y estacional, radiación solar,
frecuencia de heladas, erosión potencial del suelo y duración del periodo de sequía. Como
muchas de las variables están correlacionadas entre sí, aplicamos un Análisis de Componentes
Principales (PCA) para reducir el número de variables en los análisis de correlaciones con los
parámetros genéticos y variables fenotípicas.
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Estimamos la edad de las poblaciones de pino canario a partir de la edad de las coladas
volcánicas sobre las que se asientan basándonos en la literatura publicada (Tabla 2).
Tabla 2. Localización, características climáticas y edad de las poblaciones de pino canario incluidas en los análisis
moleculares. Se han señalado con un asterisco aquellas poblaciones representadas en los ensayos de procedencias.
LA PALMA
TENERIFE
Isla
Población
X
Y
Altitud
Ta (ºC)
Pa (mm)
Sq (meses)
Edad (Ma)
Anaga
373332
3159843
245
19,4
363
6,5
5,4
Arafo (*)
359227
3137506
940
15,4
658
4,0
1,2
La Esperanza (*)
364449
3144184
1060
13,2
785
13,2
0,69-0
La Guancha (*)
338033
3136348
1060
13,1
573
13,1
0,69-0
Vilaflor Alto (*)
336661
3119757
2145
11,5
372
4,5
0,69-0
Vilaflor Bajo
339148
3116789
1435
15,4
371
4,5
0,69-0
Chío (*)
326893
3130161
1450
13,3
443
3,0
0,69-0
Arico (*)
347929
3123062
1830
13,5
372
4,0
0,69-0
Ifonche
334324
3113839
1040
17,9
364
5,0
1,2
Tagoja (*)
225438
3181505
1650
11,7
528
4,0
0,5
Garafía (*)
219189
3189233
1040
14,7
953
3,5
1,65
El Fayal (*)
210305
3186846
782
16,5
573
4,0
0,531
Taburiente (*)
218606
3180918
845
15,4
705
3,5
0,5
El Paso (*)
222932
3174530
1085
14,20
811
3,5
0,659
Fuencaliente (*)
220535
3163050
1180
13,40
831
3,0
< 0,0001
El Julán (*)
203934
3068731
935
16,4
450
4,5
0.0002
Hoyo Morcillo (*)
199963
3069239
965
16,4
417
4,5
0.0002
Imada
278913
3108478
1080
16,1
484
4,5
8,6-7,8
Tamadaba (*)
431978
3103714
1.190
15,3
575
4,0
3,5
Gáldar
439376
3099201
1700
13,4
826
2,8
0,0029
Mogán (*)
430833
3087207
525
18,3
282
7,0
3,5
Inagua (*)
433324
3089930
995
17,0
382
4,5
3,5
Barranco de Soria (*)
434530
3088373
820
17,9
332
6,0
3,89
Tirajana (*)
441718
3089646
1150
18.,
482
4,0
3,69
Arguineguín
434941
3077536
250
20,7
183
9,5
11,77
HIERRO
GRAN CANARIA
GOMERA
3.4. Variación de la diversidad genética según gradientes geográficos y ambientales
Para identificar indicios de adaptación a ambientes locales, realizamos un análisis de
correlación entre los parámetros de diversidad poblacional (Hd y θπ), las frecuencias
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haplotípicas, las coordenadas geográficas y las tres primeras componentes principales de los
datos climáticos. Se aplicó la corrección de Bonferroni para comparaciones múltiples.
Implementamos test de Mantel en el software PASSaGE2 para examinar si la distancia
geográfica entre las poblaciones estaba asociada con la diversidad poblacional o con las
distancias entre caracteres fenotípicos cuantitativos, así como entre distancias genéticas
moleculares y cuantitativas (significación del test obtenida con 1000 permutaciones). Es decir
si las poblaciones más próximas son más parecidas genética y fenotípicamente entre sí que las
que se encuentran más alejadas geográficamente.
4. Resultados y Discusión
4.1. Diferenciación neutral frente a variación adaptativa
Las poblaciones se comportaron como una metapoblación más o menos panmíctica,
superando los efectos de la deriva genética y con muy poca diferenciación local. Para los diez
genes seleccionados se repitió un patrón con uno o dos haplotipos mayoritarios y un número
variable de haplotipos raros, lo que se tradujo en valores de Fst bajos para todos los genes
secuenciados, con un valor promedio de 0,065 (0,02; p<0,01). Los valores de Qst variaron
entre 0,044 para la altura (0,09; p<0,001) y 0,452 (0,08; p<0001) para el P88 (Tabla 3). Los
valores de Qst de la altura, diámetro y la eficiencia hidráulica no difirieron significativamente
de los valores de Fst. Es decir, las pequeñas diferencias encontradas entre poblaciones en
caracteres cuantitativos podrían ser resultado de la deriva genética u otros procesos de
diferenciación genética neutrales. Sin embargo, en las variables relacionadas con la
resistencia a la cavitación los valores de Qst fueron mayores que el de Fst (Tabla 3) indicando
selección espacial divergente. De hecho el pino canario ha sido la primera conífera en la que
se ha encontrado por una parte que existen diferencias entre poblaciones para los parámetros
de resistencia a la cavitación pero que además, estas diferencias, mucho más acusadas cuando
las plantas crecen en ambientes con un prolongado periodo de sequía, como sucede en el
ensayo de Tirajana, están ligadas al clima de las masas de origen. Es decir las poblaciones de
ambientes más secos son más resistentes a la cavitación que las de ambientes más húmedos
(LÓPEZ ET AL., 2013). La construcción de un xilema más resistente a la cavitación en
ambientes secos se ha visto de manera generalizada cuando se han realizado comparaciones
entre especies (POCKMAN & SPERRY, 2000), por lo que se ha confirmado que es un
carácter estrechamente ligado con la resistencia a la sequía y al crecimiento en lugares con
baja disponibilidad hídrica.
A pesar del elevado flujo genético entre islas (NAVASCUÉS ET AL., 2006) y entre
poblaciones situadas a distintas altitudes en la mismas ladera (NAVASCUÉS ET AL., 2008),
el amplio rango de condiciones ambientales y las frecuentes perturbaciones a las que están
sometidas las masas de pino canario pueden haber ejercido presiones selectivas muy fuertes
en el pasado, favoreciendo por un lado genotipos en general muy plásticos, es decir con gran
capacidad de cambios en el fenotipo según el ambiente en el que crezcan, como ya se ha visto
con anterioridad en otros caracteres como el reparto de biomasa, la capacidad de ajuste
osmótico y la morfología foliar (LÓPEZ ET AL., 2009; 2010) pero que además están
adaptados a las condiciones locales.
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Tabla 3. Porcentaje de la varianza explicada y valores de significación (*P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001) de los
factores procedencia, sitio (localidad de ensayo) y su interacción para los valores de eficiencia hidráulica, resistencia a la
cavitación y crecimiento obtenidos del modelo lineal general y valor de la diferenciación genética poblacional para cada
variable cuantitativa (Qst ± desviación estándar).
Ks: conductividad hidráulica específica; Kl: conductividad hidráulica foliar; P12, P50, P88: potencial hídrico que
causa el 12%, 50% y 88% de pérdida de conductividad hidráulica respectivamente; H: altura a los 6 años del
establecimiento del ensayo; Db: diámetro basal a los 6 años.
Variable
Sitio
Eficiencia hidráulica
Ks
15,33 ***
Kl
10,53 ***
Resistencia a la cavitación
P12
34,35 ***
P50
53,11 ***
P88
42,75 ***
Crecimiento
H
94,12 ***
Db
59.96 ***
Procedencia
Sitio x Proc
Qst
1,45
3,58
1,28
0,076 (0,10)
0,089 (0,11)
0
5,48 ***
9,00 ***
4,96
5,50 *
8,39 **
0,093 (0,08)
0,365 (0,09)
0,452 (0,08)
0,11
2.35
0
0
0,044 (0,09)
0,135 (0,09)
4.2. Relación entre las variables ambientales, la diversidad genética y la diferenciación
fenotípica
La estructura genética de las poblaciones no siguió un patrón de aislamiento por
distancia según los resultados del test de Mantel (p > 0,3). Es decir, las poblaciones más
próximas geográficamente no fueron las más cercanas genéticamente. La mayor parte de las
clinas detectadas en la diversidad genética de 4 de los 8 genes analizados, tanto a nivel de
SNPs como de haplotipos, fueron longitudinales. Las diversidades haplotípica (Hd) y
nucleotídica (θπ) de los genes phy y cad aumentaron hacia el este mientras que la diversidad
de los genes gapCp y eph siguió un patrón opuesto, siendo mucho menor en las poblaciones
de Gran Canaria.
Las tres primeras componentes principales de los datos climáticos (autovalor > 1,0)
explicaron juntas el 84,9% de la varianza total de los datos. La primera componente principal
(PC1; 55,1%) puede asimilarse a un índice de aridez: los climas más húmedos y templados se
sitúan en un extremo (valores negativos), mientras que los más secos y cálidos en el otro
(valores positivos). Este gradiente de aridez está además muy correlacionado con la longitud.
La PC2 (20%) mostró correlaciones positivas con la altitud, temperaturas y precipitaciones
estivales, el rango de temperaturas, las temperaturas máximas y la evotranspiración potencial
en verano y negativamente con la precipitación, las temperaturas mínimas y la
evotranspiración potencial en invierno. Por último la PC3 (12%) estuvo relacionada con la
radiación solar, temperatura media estival y temperaturas máximas anuales.
Las diversidades haplotípicas de tres de los genes candidatos (gapCp, CCoAOMT y pal)
mostraron una fuerte correlación negativa con la PC1 (r = -0,55; -0,51; -0,53; p ≤ 0.02,
respectivamente), sugiriendo la posibilidad de que la selección pueda haber actuado sobre la
diversidad de estos genes (Figura 2). No obstante, ninguno de estos genes mostró evidencias
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de selección para ninguno de los tests realizados. Es decir que, a pesar de que parece que
estos genes presentan una clara variación clinal no podemos descartar que las diferencias
entre las distintas poblaciones se deban a efectos demográficos.
1.0
1.0
a
Hd gapCp
Hd CCoAOMT
b
0.8
0.8
0.6
0.4
0.6
0.4
0.2
0.2
0.0
0.0
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Factor 1 (Aridez)
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Factor 1 (Aridez)
1.0
c
Hd pal
0.8
El Hierro
Gran Canaria
La Palma
Tenerife
0.6
0.4
0.2
0.0
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
Factor 1 (Aridez)
Figura 2. Correlaciones entre el índice de aridez obtenido mediante el análisis de componentes principales de 21
variables climáticas (ver material y métodos) y las diversidad de los genes CCoAOMT (a), gapCp (b) y pal (c).
Cuando las correlaciones se efectuaron entre las variables climáticas y las frecuencias
haplotípicas encontramos que seis de los genes sufrieron cambios direccionales en las
mismas: la frecuencia de los haplotipos rps10_2 y pal_1 disminuyó con el aumento de la
aridez, mientras que la frecuencia de rps10_1 y gapCp_2 se incrementó (p ≤ 0.01; Figura 3).
De hecho, para el gen gapCp el segundo haplotipo está casi fijado en las poblaciones más
xéricas (Figura 1). El haplotipo pal_1 se caracteriza por un SNP en la región codificante que
se traduce en el cambio de un aminoácido entre las poblaciones más xéricas y las más
húmedas. En el caso de los haplotipos gapCp_2, rps10_1 y rps10_2 no se encontraron SNPs
en la región codificante que expliquen las correlaciones con la variación ambiental, por lo que
estas correlaciones podrían estar sesgadas por la historia demográfica de las poblaciones. Sin
embargo, no puede descartarse que los SNPs identificados en la región no codificante de estos
genes estén ligados a otras regiones codificantes que sí estén sometidas a selección.
12/17
0.8
0.8
a
b
0.6
rps10_2
rps10_1
0.6
0.4
0.2
0.4
0.2
0.0
0.0
-6
-4
-2
0
2
4
6
8
10
-6
-4
-2
Factor 1 (Aridez)
2
4
6
8
10
6
8
10
Factor 1 (Aridez)
1.0
0.6
d
c
0.8
GapCp_2
0.4
pal_1
0
0.2
0.6
0.4
0.0
0.2
-6
-4
-2
0
2
4
Factor 1 (Aridez)
6
8
10
-6
-4
-2
0
2
4
Factor 1 (Aridez)
Figura 3. Correlaciones entre el índice de aridez obtenido mediante el análisis de componentes principales de 21
variables climáticas (ver material y métodos) y las frecuencias haplotípicas de 2 haplotipos del gen rps10 (a y b) de un
haplotipo del gen pal (c) y de un haplotipo del gen GapCP (d). Los símbolos representan las distintas islas (ver Figura 2).
La sequía parece haber sido un agente selectivo importante para el pino canario. Si bien,
el gradiente de aridez actual de las islas se superpone con la edad de emergencia de las
mismas y su posterior colonización por el pino canario: las islas orientales son las más
antiguas y también las más áridas. De hecho hay evidencias de la presencia de pino canario en
Fuerteventura y Lanzarote en épocas pasadas (CLIMENT ET AL., 1996). La superposición
de clima y antigüedad de las poblaciones podría ocasionar que parte de las correlaciones
encontradas entre clima y diversidad genética estuvieran sobrestimadas debido a procesos de
diferenciación neutral. Aunque tenemos que tener en cuenta estas posibles correlaciones
espurias, se ha demostrado que los métodos basados en las relaciones entre datos genéticos y
ambientales son prometedores ya que permiten el estudio de las adaptaciones y procesos
específicos de una determinada especie al ambiente en el que habita utilizando las frecuencias
alélicas o la estructura genética de sus poblaciones (JOOST ET AL., 2008). Estos métodos de
correlación son además mucho más atractivos que los métodos basados en la detección de
outliers (como en EVENO ET AL., 2008) ya que evidencian factores de selección
particulares y permiten trabajar con hipótesis más concretas basándose en variables
ambientales determinadas.
13/17
El análisis de correlación entre la localización y las variables ambientales con los
valores fenotípicos medidos en los ensayos de procedencias reveló una fuerte correlación
entre el gradiente de aridez y la supervivencia en los dos ensayos más secos, Fasnia (r= 0.75)
y Tirajana (r = 0.57), así como con la altura y la resistencia a la cavitación en esta última
parcela (r = 0.65) (Figura 4). Las poblaciones que se asientan en terrenos más secos presentan
evidencias de adaptación local y sobreviven y crecen más en estos ambientes que las que
habitan en las laderas de exposición norte de las islas, con condiciones mucho más húmedas y
suelos más desarrollados. Parte de esta adaptación local podría deberse a una mayor
resistencia a la cavitación. Las poblaciones más xéricas soportarían diferencias de potencial
hídrico entre suelo y copa mucho mayores que las húmedas sin perder conductividad
hidráulica, y por tanto podrían seguir realizando fotosíntesis aún en condiciones de cierto
déficit hídrico.
1.0
1.0
b
Supervivencia Fasnia
Supervivencia Tirajana
a
0.8
0.6
0.4
0.8
0.6
0.4
0.2
0.2
-6
-4
-2
0
2
4
-6
6
-4
-2
4
6
1.0
c
d
Supervivencia Tirajana
Altura Tirajana
2
Factor 1 (Aridez)
Factor 1 (Aridez)
80
0
70
60
50
40
0.8
0.6
0.4
0.2
-6
-4
-2
0
2
Factor 1 (Aridez)
4
6
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
CCoAOMT_2
Figura 4. Correlaciones entre el índice de aridez obtenido mediante el análisis de componentes principales de 21
variables climáticas (ver material y métodos), la supervivencia en los dos ensayos de procedencias más secos, Tirajana (a) y
Fasnia (b) y la altura en Tirajana (c). Correlación entre las frecuencias haplotípicas del gen CCoAOMT_2 y la
supervivencia en Tirajana. Los símbolos representan las distintas islas (ver Figura 2).
14/17
4.3. Genes candidatos asociados a la eficiencia hidráulica y la resistencia a la cavitación
Los resultados de los test de Mantel para los genes CCoAOMT y cad revelaron que el
primero está correlacionado con los valores de P 50 (r = 0,587; p<0,05) y diámetro basal (r =
0,509; p<0,05), mientras que el segundo se relaciona con la conductividad específica foliar, Kl
(0,433; p<0,05). Estudios anteriores con los genes CCoAOMT y lp3-3 han indicado que
podrían estar implicados en la resistencia a la sequía en P. pinaster (EVENO ET AL., 2008) y
P. halepensis (GRIVET ET AL., 2011). Nuestros resultados apuntan a la implicación del
primero, descrito en procesos de formación de la pared secundaria celular, en la resistencia a
la cavitación del sistema hidráulico de la planta y en el crecimiento diametral. El gen cad, que
se expresa en tejidos que están llevando a cabo de forma activa procesos de lignificación
(GRIMA-PETTENATI ET AL., 1993) y podría ser un gen candidato relacionado con la
conducción de agua a través de la planta. Tenemos que señalar que los test de neutralidad
realizados, tanto con el CCoAOMT como con el cad, no evidenciaron ninguna desviación de
la misma a pesar de las correlaciones encontradas con procesos fisiológicos. Esto podría
indicar que no son los genes bajo selección pero podrían estar ligados a genes que sí han
sufrido procesos selectivos. El siguiente paso para confirmar el papel de estos genes
candidatos en la resistencia a la sequía, sería el estudio de la expresión de los mismos en
plantas sometidas a déficit hídrico.
5. Conclusiones
Las dos aproximaciones utilizadas en este trabajo para distinguir procesos selectivos
asociados a variables climáticas indican que la sequía parece haber sido un fuerte agente de
selección natural en el pino canario. A pesar del elevado flujo genético entre sus poblaciones,
hemos detectado selección divergente sobre caracteres relacionados con la resistencia a la
cavitación. Se han detectado clinas ambientales en la diversidad de tres genes candidatos y
además dos de ellos CCoAOMT y cad han sido identificados como potenciales genes
candidatos en la resistencia a la cavitación y la eficiencia hidráulica de la planta.
6. Agradecimientos
Nos gustaría agradecer al Gobierno de las Islas Canarias, a los Cabildos de Gran
Canaria y Tenerife y al Parque Nacional de Taburiente por su apoyo y colaboración durante
tantos años de estudio del pino canario. Gracias también a toda la gente involucrada en el
establecimiento, cuidado y mediciones de los ensayos de procedencias, así como a Christian
Bodet y Pierre Conchon por su ayuda con el Cavitron. Este estudio ha sido financiado por el
Ministerio de Ciencia e Innovación a través del proyecto VULCAN (AGL2009-10606).
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