Download Inhibición del crecimiento de Escherichia coli por bacterias ácido

Inhibición del crecimiento de Escherichia coli por
bacterias ácido lácticas: presencia de quórum sensing?
Catalina Aguilar1 y Bernadette Klotz2
Facultad de Ingeniería. Grupo de Investigación: Procesos Agroindustriales.
Campus Puente del Común, Universidad de la Sabana.
Autopista Norte Km 21. Chía, Cundinamarca, Colombia.
Teléfono: 8615555 ext.: 2513/2532.
catalina.aguilar@unisabana.edu.co
bernadette.klotz@unisabana.edu.co
RESUMEN
Estudios preliminares evidenciaron que en cocultivos de Lactobacillus plantarum
WS4174 o de Lactobacillus plantarum LB279 con Escherichia coli iniciados a iguales
concentraciones (2 log10 UC/mL), el crecimiento del patógeno se reducía en 3 ciclos
logarítmicos. Sin embargo, en este trabajo, al iniciarlos a distintas concentraciones, se
obtuvo un comportamiento diferente y las curvas de crecimiento demostraron que la
inhibición de E. coli no estaba directamente correlacionada con falta de nutrientes, bajo
pH o acumulación de tóxicos. Y aunque la acción antagónica de ácido láctico sin disociar
o de bacteriocinas no puede descartarse, una respuesta dependiente de la densidad
poblacional (quórum sensing) parece estar involucrado en el mecanismo de inhibición.
Palabras clave: Lactobacillus plantarum, Escherichia coli, bacterias acidolácticas.
I. INTRODUCCIÓN
Debido a sus características fermentativas y
antagónicas, las bacterias ácido lácticas
(BAL) han adquirido un fuerte interés por
parte de la industria alimentaria, para su
aplicación en procesos de biopreservación,
como cultivos biocontroladores de flora
deteriorativa y patógena. Estas condiciones,
además de incrementar la vida comercial y
la seguridad microbiológica de los
alimentos, traen beneficios para la salud,
por
sus
propiedades
probióticas,
ampliamente reconocidas1. Las BAL
protegen directamente a los alimentos de
microorganismos patógenos y alteradores
produciendo ácido láctico, peróxido de
hidrógeno,
diacetilos2,
compuestos
3,4
antifúngicos , ácido fenilacético5,6 y
bacteriocinas7, entre otros, siendo éstas
últimas potenciales sustitutos naturales de
los preservantes químicos que hoy en día
se usan en alimentos. Sin embargo, existe
evidencia
que
el
comportamiento
microbiano dependiente de la densidad
poblacional conocido
como Quorum
sensing o fenómenos de autoinducción,
también podría estar implicado en dicho
antagonismo.
Diferentes
estudios
han
logrado
comprobar la activación de fenómenos de
quórum sensing en diversos procesos
celulares:
la
bioluminiscencia8,27
la
formación de esporas 9 la movilidad10,11,
competencia microbiana 12, procesos de
conjugación13, síntesis de antibióticos14,15,
virulencia16,17,18,
producción
de
bacteriocinas19 y formación de bio
películas20,. Sin embargo, estos fenómenos
de autoinducción han sido poco estudiados
a nivel alimentario y se han restringido
principalmente a los campos clínicos y
farmacéuticos. Por esta razón y en busca
de aportar nuevas hipótesis al mecanismo
de inactivación de las BAL frente a
patógenos en alimentos, se propone en
este estudio determinar el efecto de la
densidad
poblacional
sobre
el
comportamiento grupal de poblaciones
bacterianas de Escherichia coli que se
encuentran en cultivo mixto con BAL, cuyos
co-cultivos son iniciados a diferentes
concentraciones celulares.
2.2 Generación de curvas de crecimiento
Se construyeron curvas de crecimiento de
34 horas a 37°C en caldo MRS a partir de
los cultivos individuales y mixtos de las tres
cepas estudiadas con al menos 54 datos
experimentales provenientes de tres
experimentos independientes.
Adicionalmente, para cada una de las
curvas desarrolladas, se obtuvo el perfil del
pH a través del tiempo. La media de los
datos de las curvas de crecimiento en cocultivo de E. coli con L. plantarum WS4174
y con L. plantarum LB279 presentaron
desviaciones estándar entre 0.16 y 0.246, y
0.009 y 0.151 respectivamente
2.3 Análisis estadístico.
Los datos experimentales se analizaron
mediante ANOVA (p <0.05) y test de Tukey
(nivel de significancia de 5%) con el
programa estadístico SPSS (versión 13.0,
SSPS Inc, Chicago).
II. MATERIALES Y MÉTODOS
IV. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
2.1 Selección de cepas y estandarización
de inóculos.
Lactobacillus plantarum WS4174, L.
plantarum LB279 y E. coli ECO25 fueron
aisladas de productos lácteos. La actividad
antimicrobiana de las BAL contra la cepa
indicadora fue determinada mediante el
método “spot-on-lawn” 22, 23,24. Los
sobrenadantes de cultivos individuales de L.
plantarum WS4174 presentaron actividad
antimicrobiana frente al patógeno mientras
que L. plantarum LB279 sólo la presentó a
partir de sus sobrenadantes provenientes
de cultivos mixtos con el patógenos. Se
utilizó como inóculo inicial cultivos en fase
estacionaria (24 h) desarrollados en caldo
MRS con concentraciones de 1.0 x 109 a
1.6 x 109 UFC/mL.
Estudios previos establecieron que en
co-cultivos, L. plantarum WS4174 y L.
plantarum LB279 limitaban el crecimiento
de E. coli aproximadamente en 3 ciclos
logarítmicos y que eran las BAL las que
principalmente mediaban el cambio de pH
en el medio, siendo L. plantarum LB279 la
que generó una mayor acidificación.
Ensayos de reto realizados en caldo MRS y
a bajos pH mostraron que la viabilidad de E.
coli disminuía en un 100% a valores de pH
4.0. La Figura 1 muestra la entrada
prematura a fase estacionaria de E. coli in
co-cultivo que no se relaciona con el bajo
pH ni con agotamiento de nutrientes,
sugiriendo que factores como ácido láctico
sin disociar y/o bacteriocinas pueden estar
limitando directamente el crecimiento del
patógeno.
Figura 1. Curvas de crecimiento de E. coli en cultivos individual y mixtos con el perfil
de pH.
10
7
9
6.5
8
6
5.5
6
5
pH
log CFU/mL
7
5
4.5
4
4
3
3.5
2
3
1
0
2.5
0
2
4
6
8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Time (h)
♦ Cultivo individual, ▲ Co-cultivo con L. plantarum WS4174, ▲ Co-cultivo con L. plantarum
LB279, — pH de cultivo individual, --- p<h de co.cultivo con L. plantarum WS4174 ---- pH
de co-cultivo conL. plantarum LB279.
Para determinar la participación del
quórum sensing en el mecanismo de
restricción del crecimiento de E. coli en
presencia de BAL, los co-cultivos fueron
iniciados con diferentes concentraciones
celulares (BAL:E. coli). La figura 2
muestra
que
el
comportamiento
poblacional
no
puede
explicarse
directamente por la acción de factores
producidos por las BAL como ácidos,
decrecimiento del pH y/o producción de
bacteriocinas. El cultivo simultáneo de E.
coli con BAL redujo el crecimiento de la
cepa patógena pero la densidad celular
de las BAL en las curvas no afectó
significativamente
el
patrón
de
crecimiento de E. coli.
Cuando los
cultivos
se
generaron
con
concentraciones iniciales de 2.5 y 4.5
log10 UFC/mL de E. coli, la población
bacteriana creció a una concentración
máxima de 6 log10 UFC/mL con una
tendencia a decrecer después de 15 h de
incubación. Esta fase de muerte estuvo
más marcada cuando los co-cultivos se
iniciaron con concentraciones de 6.5
log10 UFC/mL del patógeno, donde
únicamente se obtuvo una concentración
máxima de 7 log10 UFC/mL después de 5
horas de incubación y se mantuvo con
esa misma densidad poblacional durante
las 34 horas evaluadas.
.Figura 2. Curvas de crecimiento en cultivo mixto de BAL y Escherichia coli
iniciados a diferente concentración celular
1
2
3
A
B
A: Co-cultivos con L. plantarum WS4174 (s.d. 0.016-0.247). B: Co-cultivos con L.
plantarum LB279. (s.d. 0.009-0.151). 1: Concentración inicial (CI) de BAL 2 log10 CFU/mL.
2: CI de BAL 4 log10 CFU/mL. 3: CI de BAL 6 log10 CFU/mL. ♦ : CI de E. coli 2 log10
CFU/mL, ♦ CI de E. coli 4 log10 CFU/mL, ♦CI de E. coli 6 log10 CFU/mL. (s.d.: desviación
estándar).
Los resultados obtenidos muestran (1)
que el crecimiento de E. coli estuvo
restringido directa o indirectamente por
las BAL y (2) que el patógeno parece
tener un propio sistema de respuesta que
se activa bajo la interacción de pequeñas
moléculas difusibles de señalamiento
(autoinductores) que permitieron la
comunicación
intercelular25.
Estos
autoinductores se difunden desde las
células bacterianas y se acumulan en el
ambiente como una función del
crecimiento celular. Y así, cuando
determinada concentración celular es
alcanzada por una población (para este
caso entre 5 y 6 log10 UFC/mL), las
señales comienzan a secretarse y sirven
como inductores para regular la
transcripción de ciertos genes.
La
entrada a fase estacionaria a nivel
bacteriano está regulada en gran parte
por el regulador transcripcional σs, el cual
afecta positiva o negativamente la
expresión de más de 50 genes26. En
este caso, con los resultados obtenidos,
se puede decir que la fase estacionaria
no fue inducida por agotamiento de
nutrientes o factores extrínsecos, pero sí
por factores asociados a la fisiología de
las BAL o de E. coli en co-cultivo que
pueden estar mediados por fenómenos
de quórum sensing.
V. CONCLUSIONES
El mecanismo exacto de la inhibición del
crecimiento del patógeno, así como la
participación de todos los factores
involucrados en estas interacciones no
están completamente elucidados. Y
aunque la producción de ácidos y/o
bacteriocinas por parte de las BAl son
principalmente los factores asociados a
estos fenómenos, otros sistemas como
las señales del quórum sensing también
pueden estar involucrados. Finalmente,
con los resultados obtenidos de este
estudio, se soporta una vez más el uso y
aplicación de BAL en los procesos de
biocontrol para la industria alimentaria.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1- Rabel, L. K. and Hillier, S. L. (2003).
Optimization of Media for Detection
of Hydrogen Peroxide Production by
Lactobacillus Species Journal Of
Clinical Microbiology. 41: 3260-3264.
2- Messens W. and De Vugst L. (2002).
Inhibitory substances produced by
Lactobacilli
isolated
from
sourdoughs, International Journal of
Food Microbiology 72, 31-43.
3- Corsetti A., Gobbetti M. and Smacchi
E. (1996). Antibacterial activity of
sourdough lactic acid bacteria:
isolation
of
a
bacteriocin-like
inihibitory
substance
from
Lactobacillus
sanfrancisco
C57,
Food Microbiology 13 (6), 447-456.
4- Magnusson J., Strom K., Roos S.,
Sjörgren J. and Schnürer J. (2003).
Broad and complex antifungal
activity
among
environmental
isolates of lactic acid bacteria, FEMS
Microbiology Letters, 219 (1), 129135.
.
5-Lavermicocca P., Valeria F., Evidente
A., Lazzaroni S., Corsetti A. and
Gobbetti M. (2000). Purification and
characterization of novel antifunfal
compounds
by
sourdough
Lactobacillus plantarum 21B, Applied
and Environmental Microbiology 66,
4084-4090.
6- Ström K. (2005). Fungal inhibitory
lactic acid bacteria, Doctoral Thesis
Swedish University of Agricultural
Sciences, Uppsala.
7- De Vugst L. and Vandamme E.J.
(1994). Bacteriocins of lactic acid
bacteria, Microbiology, Genetics and
Applications
London:
Blackie
Academic and Professional. ISBND
75140174-9.
8- Lilley B.N. and Bassler B.L. (2000).
Regulation of quorum sensing in
Vibrio harveyi by LuxO and sigma54, Molecular Microbiology, 36, 940954.
9- Li S., Lee B.U. and Shimkets L.J.
(1992). csgA expression entrains
Myxococcus xanthus development,
Genes and Development 6, 401-410.
In: Autoinducer-2(AI-2) mediated
quorum sensing in Escherichia coli,
Wang L. (2004), Doctoral Thesis
University of Maryland.
10-Elvers K.T and Park S.F. (2002)
Quorum sensing in Campylobacter
jejuni: detection of a luxS encoded
signaling molecule, Microbiology,
148, 1475-1481.
11- Giron J.A., Torres A.G., Freer E.
and Kaper J.B. (2002). The flagella
of enteropathogenic Escherichia
coli mediated mediated adherence
to
epithelial
cells.
Molecular
Microbiology, 44, 361-379.
16- Miller M.B., Skorupski K., Lenz
D.H., Taylor R.K. and Bassler B.L.
(2002). Parallel quorum sensing
systems converge to regulate
virulence un Vibrio cholerae, Cell,
110, 303-314.
12- Magnuson R., Solomon J., Roos S.
and
Grossman
A.D.
(1994).
Biochemical
and
genetic
characterization of a competence
pheromone from Bacillus subtilis,
Cell, 77, 207-216.
17- Passador L.J., Cook J.M., Gambello
M.J., Rust L. and Iglewski B.H.
(1993).Expression of Pseudomonas
aeruginosa
virulence
genes
requires cell-to-cell communication,
Science, 260, 1127-1130. In:
Autoinducer-2(AI-2)
mediated
quorum sensing in Escherichia coli,
Wang L. (2004), Doctoral Thesis
University of Maryland.
13- Fuqua W.C and Winans S.C.
(1994). A LuxR-LuxI type regulatory
system activates Agrobacterium Ti
plasmid conjugal transfer in the
presence of a plant tumor
metabolite, Journal of Bacteriology,
176, 2796-2806.
14- Bainton N.J., Bycroft B.W., Chhabra
S.R., Stead P., Gledhill L., Hill P.J.,
Rees C.E., Winson M.K., Salmond
G.P., Stewart G.S. and et al.
(1992). A general role for the lux
autoinducer
in
bacterial
cell
signaling: control of antibiotic
biosynthesis in Erwinia, Gene, 116,
87-91.
In:
Autoinducer-2(AI-2)
mediated quorum sensing in
Escherichia coli, Wang L. (2004),
Doctoral Thesis University of
Maryland.
15- Derzelle S., Duchaud E., Kunst F.,
Danchin A. and Bertin P. (2002).
Identification, characterization, and
regulation of a cluster of genes
involved
in
carbapenem
biosynthesis
in
Photorhabdus
luminescens,
Applied
and
Environmental Microbiology, 68,
3780-3789.
18- Sperandio V., zmellies J.L., Nguyen
W., Shin S. and Kaper J.B. (1999).
Quorum
sensing
controls
expression of the type III secretion
gene transcription and protein
secretion in enterohemorrhagic and
enteropathogenic Escherichia coli,
Proceedings
of
the
National
Academic of Sciences USA 96,
15196-15201.
19-Eijsink V., Axelsson L., Diep, D.,
Havarstein L., Holo H. and Nes I.
(2002). Production of class II
bacteriocins by lactic acid bacteria;
an example of biological warfare
and communication, Antonie van
Leeuwenhoek, 81, 639-654.
20- Davies D.G., Parsek M.R., Pearson
B H., Iglewski B.H, Costerton J.W.
and Greenberg E.P. (1998). The
involvement of cell-to-cell signals in
the development of a bacterial
biofilm, Science, 280, 295-298.
21- Prouty A.M., Schwesinger W.H. and
Gunn J.S. (2002). Biofilm formation
and interaction with the surfaces of
gallstones by Salmonella spp.,
Infection and Immunity, 70, 26402649.
22-Cintas L., Casaus P., Fernandez F.
and Hernandez P.E. (1998).
Comparative antimicrobial activity of
enterocin L50, pediocin PA-1, nisin
A, and lactocin S against spoilage
and foodborne pathogenic bacteria.
Food Microbiology 15, 289-298.
23- Loessner M., Guenther S., Steffan
S. and Scherer S. (2003). A
pediocin-producing
Lactobacillus
plantarum strain inhibits Listeria
monocytogenes in a multispecies
cheese surface microbial ripening
consortium.
Applied
and
Environmental Microbiology.
69,
1854-1857.
24- Eppert I., Valde´s-Stauber N. and
Scherer
S.
(1997).
Growth
reduction of Listeria spp. caused by
undefined industrial red smear
cheese cultures and bacteriocinproducing Brevibacterium linens as
evaluated in situ on soft cheese.
Applied
and
Environmental
Microbiology 63, 12, 4812-4817.
25- Gray K. M. (1997) Intercellular
communication and group behavior
in bacteria, Trends in Microbiology,
5 (5), 184-188.
.
26- Loewen P.C., Hu B., Strutinsky J.
and Sparling R. (1998). Regulation
in the rpoS regulon of Escherichia
coli.
Canadian
Journal
of
Microbiology, 44, 707-717.
27- Engrebrecht J., Nealson K. and
Silvermann M. (1983). Bacterial
bioluminescence: isolation and
genetic analysis of functions from
Vibrio fischeri, Cell, 32, 4154-4158.
In: Autoinducer-2(AI-2) mediated
quorum sensing in Escherichia coli,
Wang L. (2004), Doctoral Thesis
University of Maryland.
AGRADECIMIENTOS
Los autores agradecen a la Facultad de
Ingeniería de La Universidad de La
Sabana por apoyar y financiar este
trabajo y a la Universidad de Los Andes
por la donación de dos de las cepas
evaluadas.