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Apoptosis En Enfermedades Neurodegenerativas Introducción a La Terapia Génica Curso 2004-2005 Apoptosis En Enfermedades Neurodegenerativas • • • • Apoptosis neuronal. Mecanismos de supervivencia. Enfermedades neurodegenerativas. Aplicación: estudio de la apoptosis neuronal asociada a la enfermedad de scrapie. Apoptosis En Enfermedades Neurodegenerativas • • • • Apoptosis neuronal. Mecanismos de supervivencia. Enfermedades neurodegenerativas. Aplicación: estudio de la apoptosis neuronal asociada a la enfermedad de scrapie. La Neurona • Normalmente sobreviven toda la vida del individuo permitiendo el mantenimiento de los circuitos neuronales. • En el desarrollo muchas neuronas (50%) sufren apoptosis (Sinaptogénesis). • Señales de supervivencia neuronal: – Factores Neurotróficos. – Glutamato (neurotransmisor excitatorio). Inducción De Apoptosis in vitro • Falta de factores neurotróficos: – Desarrollo. – Enfermedades Neurodegenerativas. • Toxicidad del péptido b-amiloide: – Enfermedad de Alzheimer. • Excitotoxicidad. • Falta de K. • Estrés oxidativo: – Infarto. – Envejecimiento. Falta De Factores Neurotróficos • Señales de supervivencia. • Causa de la pérdida masiva de neuronas en el desarrollo. • Modelo in vitro: – NGF: Ns simpáticas y células PC12. – BDNF o CNTF: Ns sensitivas. – Cultivos sin suero. Toxicidad Del Péptido b-amiloide AAP b-amiloide c-jun caspasas Apoptosis: Ns corticales Ns hipocampo Necrosis: Ns corticales Neuroblastomas PC12 • Principal compuesto de las placas seniles. • Péptido de 39 a 42 aa proveniente de la glicolisis de AAP (695770 aa). • Apoptosis o necrosis según el tipo celular o el protocolo experimental. Excitotixicidad • Los aminoácidos excitadores son neurotransmisores (Glutamato). • Implicados en la diferenciación neuronal y en la memorización. • Receptores: – Ionotrópicos glutamatérgicos (NMDA). – Metabotrópicos. • Estímulo excesivo: muerte neuronal. Apoptosis Necrosis Otros Modelos • Falta de K: – La supervivencia y diferenciación neuronales in vitro requiere altas [K]. – Privación de K en el medio apoptosis • Estrés oxidativo: – Agentes oxidantes en el medio (H2O2, peroxinitrito). – Inhibición de la síntesis de antioxidantes intracelulares aumento de radicales libres. Mecanismos Moleculares De La Apoptosis Mecanismos Moleculares (2) Pro-apoptóticas Caspasas Digestión de sustratos específicos. Bax, Bad Formación de poros en la Mb. Mit. (salida Cyt-c). Receptores Glutamato Entrada de Ca; activación de quinasas y proteasas. Fas Iniciación de la cascasda de Casp-8. Par-4 Disfunción mitocondrial; supresión de señales de supervivencia (NFkB). P53 Transcripción de genes apoptóticos (Bax). Anti-apoptóticas Bcl-2, Bcl-xL Estabiliza la función mitocondrial; supresión stress oxid. IAPs Inhibición de caspasas. Factores tróficos/citoquinas Expresión de enzimas antioxidantes, prots reguladoras de Ca, IAPs, Bcl-2; fosforilación de AKT y otros. Telomerasa Previene el acortamiento de los telómeros; modular respuestas de daño ADN. Enzimas antioxidantes Suprimen estrés oxidativo. Protein Kinasa Cz Estimula la expresión de (NF-kB) Prots. Unión al Ca Homeostasis del Ca. Mattson, M.P. (2000) Nature reviews 1: 120-9 Receptores De Membrana Fas Apoptosis por falta de factores neurotróficos p75 http://perso.wanadoo.fr/adna/Apoptose.html Los Proto-oncogenes: c-fos y c-jun • Modelos in vitro: – Falta de K o suero, exposición al bamiloide, strés escitotóxico. Factores neurotróficos c-Jun c-Jun • Modelos in vivo: – Axotomía o estrés excitotóxico. JNK JNK Genes Del Ciclo Celular • Ciclinas: – D1: su función en la apoptosis es variable dependiendo del tipo neuronal y del estímulo. – D1 y B1: + individualización de cromosomas en la apoptosis inducida por ácido okadaico en neuroblastomas. • P53: – Participación demostrada in vivo e in vitro. – No participa en el desarrollo cerebral normal. – Convierte a las neuronas más sensibles al estímulo apoptótico. La Familia De Bcl-2 • Sobre-expresión de Bcl-2 in vivo e in vitro inhibe la apoptosis. • Bcl2 : exceso de neuronas en cerebro y médula. • Bcl2 (-/-): desarrollo normal y degeneración importante post-natal. • Bcl-x (-/-): muerte neuronal apoptótica masiva en el desarrollo. • Bax (-/): exceso de neuronas simpáticas y motoneuronas. Resistentes a la privación de NGF in vitro y a la axotomía. Regulación De La Familia Bcl-2 • Transcripcional: – EGL-1, Bim, Hrk. • Post-traducción: – Bax, Bad, Bid. Putcha et al. (2002) • Las proteínas pro-apoptóticas BAX y BAK no presentan redundancia o expresión compensatoria en niveles fisiólogicos. • Bim comparte función con Hrk pero no con Bid o Bad. • Fas-FasL no contribuyen a la apoptosis por TFD. Putcha et al. (2002) • El modelo de apoptosis basado en la privación de factores neurotróficos en cultivos neuronales de SCG y CG depende únicamente de la expresión y traslocación de BAX para la salida de Cyt-c y activación de caspasas. • BIM y HRK están inducidos y requieren de BAX para mediar la muerte celular. • La subfamilia BH3 puede mediar la traslocación de BAX. Putcha et al. (2002) Citoplasma Modelo 1 BH3 Mitocondria BAX BAX Cyt c BCL-2 BCL-w BCL-XL Modelo 2 BAX Modelo 3 BH3 BCL-w BCL-XL BAX BH3 Modelo 4 BAX BH3 BAX BH3 BAX Cyt c Cyt c BCL-2 BCL-W BCL-XL BAX Cyt c Putcha et al. (2002) Citoplasma Modelo 1 BH3 Mitocondria BAX BAX BID BAD BCL-2 BCL-w BCL-XL BIM Modelo 2 BAX Modelo 3 BH3 BCL-w BCL-XL BAX BH3 Modelo 4 Cyt c BAX BH3 BAX BH3 BAX Cyt c Cyt c BCL-2 BCL-W BCL-XL BAX Cyt c Putcha et al. (2002) Mitocondria Citoplasma +NGF BAX BAX (periférico) BAX (integral) Cyt c BCL-2 BCL-XL -NGF multimerización BAX BAX (periférico) BIM Dp5 BAX (integral) BCL-2 BCL-XL Cyt c Caspasas • Casp-8 respuesta a la inducción por Fas y el receptor de la neurotrofina p75. • Casp-3: importante en el desarrollo. • Casp-1: apoptosis de neuronas postmitóticas. • Casp-2: apoptosis por falta de factores neurotróficos. • Responsabilidad diferente según el tipo neuronal, el grado de madurez y el estímulo apoptótico. • Activación de caspasas efectoras: – Activación DNasas. – Poly-ADP-ribosa polimerasa. – Kinasa ATM. – Canales de iones (AMPA). – Proteínas del citoesqueleto. Otros Factores • Par-4: – Prostate apoptosis response-4 protein. – Sobre-expresada en células apoptóticas de tumores de próstata. – Esencial en la apoptosis neuronal (desarrollo y patológica): • Sobreexpresada en respuesta a estímulos apoptóticos. • Interacción con la proteinkinasa Cz y Bcl-2 (dominio Leucine Zipper). Otros Factores • Telomerasa: – Previene el acortamiento de los cromosomas en la mitosis. – Actividad incrementada en la inmortalización y transformación celular y en el desarrollo. – Acción anti-apoptótica en los estadíos tempranos de la muerte neuronal. www.bio.miami.edu/dana/250/telomerase.jpg Radicales Libres • La apoptosis neuronal producida por diversos estímulos (privación de factores neurotróficos, excitotoxididad, falta de K, exposición a b-amiloide, isquemia) se acompaña de la producción de radicales libres de O. • La acción de antioxidantes (SOD) no inhiben la apoptosis por falta de NGF. • NGF previene la muerte celular cuando los radicales libres ya se han producido. • Los radicales libres disminuyen la resistencia de las neuronas a la apoptosis. Apoptosis En Enfermedades Neurodegenerativas • • • • Apoptosis neuronal. Mecanismos de supervivencia. Enfermedades neurodegenerativas. Aplicación: estudio de la apoptosis neuronal asociada a la enfermedad de scrapie. Inducción De Apoptosis • Falta de factores neurotróficos: – Desarrollo. – Enfermedades Neurodegenerativas. • Glutamato (neurotransmisor excitatorio): – Neurodegeneración aguda (infarto). – Enfermedad de Alzheimer. • Estrés oxidativo: – Infarto. – Envejecimiento. • Toxinas ambientales. Mecanismos De Supervivencia • La complejidad funcional y estructural del SN se basa en la no división celular. • La supervivencia neuronal permite mantener funciones continuas a larga distancia y la memoria duradera. Cascadas De Señalización Anti-apoptótica Factor De Trascripción NF-kB Actividad protectora in vitro e in vivo: NF-kB APOPTOSIS Mn SOD Bcl-2 IAP Falta de factores neurotróficos Excitotoxicidad Estrés oxidativo Promueve apoptosis: NF-kB OExcitotoxinas Glutamato Acido kainico N-metil-D-aspartato APOPTOSIS NEURONAL Señalización Intracelular Factores Neurotróficos Bcl-2, Bcl-Xl Ez antioxidantes Heat-shock proteins Caspasas Autocrina o Paracrina Stress Chaperona PKB/AKT Ca/calmodulin dependent Protein kinase Ca2+ Depolimerización actina NMDA Canales De Ca2+ Ca2+ CREB cGMP NF-kB Apoptosis En Enfermedades Neurodegenerativas • • • • Apoptosis neuronal. Mecanismos de supervivencia. Enfermedades neurodegenerativas. Aplicación: estudio de la apoptosis neuronal asociada a la enfermedad de scrapie. Otros Factores Que Modulan La Apoptosis En E.N.D. E.N.D. Genéticos Ambientales Alzheimer APP, mutaciones de la presenilina, ApoE Traumatismo, baja educación, aporte calórico Parkinson A-synuclein, mutaciones parkin Trauma, toxinas, aporte calórico Huntington Expansiones de PolyCAG en Huntingtin ALS Mutaciones Cu/ZnSOD Toxinas, respuesta autoinmune Infarto Mutaciones cadasil Fumar, dieta, grasa. Mattson, M.P. (2000) Nature reviews 1: 120-9 Productos génicos asociados con la neurodegeneración Gene Disease Effect of Mutant on Apoptosis Caspase Substrate? Effect of Caspase Cleavage Androgen receptor Kennedy's Increased Yes Increased apoptosis Huntingtin Huntington's Increased Yes Increased apoptosis Spinocerebellar atrophy-2 (ataxin-2) Spinocerebellar atrophy-2 Increased Yes ? Dentatorubropallidolu ysian atrophy (atrophin-1) Dentatorubropallidoluysian atrophy Increased Yes Increased apoptosis Spinocerebellar atrophy-3 (ataxin-3) Machado-Joseph disease Increased Yes ? Presenilin-1 Alzheimer's Increased Yes ? Presenilin-2 Alzheimer's Increased Yes ? Beta-amyloid precursor protein Alzheimer's Increased Yes Increased apoptosis ApoE Alzheimer's ? ? ? Superoxide dismutase-1 Familial amyotrophic lateral sclerosis Increased No for caspase-3 ? Alpha-synuclein Parkinson’s Increased No for caspase-3 ? http://www.hosppract.com/issues/2001/09/bred.htm Enfermedades Neurodegenerativas • Corteza cerebral: – Enfermedad de Alzheimer (demencia senil). – Enfermedad de pick (demencia). – Enfermedad de Creutzfeld-Jakob. • Ganglios Basales: – Enfermedad de Parkinson. – Corea de Huntington. • Degeneración espino-cerebral: – Ataxia de Fiedreich. – Atrofia olivo-pronto-cerebelar. • Enfermedades de la motoneurona: – Esclerosis Lateral Amiotrófica. – Atrofia olivo-pronto-cerebelar. Alzheimer • Pérdida progresiva del reconocimiento y problemas emocionales. • Degeneración sináptica y muerte de neuonas en las estructuras límbicas (hipocampo, amígdala y septo) y corteza asociada. • Agregados hiperfosforilados de proteína Tau. • Excesiva proteolisis mediada por Ca y estrés oxidativo. • Acumulación de placas de b-amiloide. Muerte Neuronal • TUNEL: – Observada en ausencia de degeneración neurofibrilar. – Se observa también en casos poco severos (poca NDF). – Células TUNEL+, DNF-, Tau patológicas+. – Células gliales TUNEL+. – Células TUNEL+, b-amiloide+ y próximas a placas seniles. • Expresión de genes de apoptosis. Mecanismos Moleculares • Sobre-expresión de Bax: – En las placas seniles. – No en neuronas Tau-PHF+. • Bcl-2: – Resultados inmunohistoquímicos controvertidos. – No cambios en ARNm. • C-fos, c-jun, p53 y Fas: – En neuronas TUNEL+. – No en neuronas Tau-PHF+. • Actividad de caspasas: – Fragmentación de la actina. • Otros: Par-4, represión de NCKAP1. b-amiloide • Inducción de apoptosis. • Aumenta la vulnerabilidad neuronal al estrés oxidativo y la reducción energética. – Peroxidación de lípidos de membrana. – Deterioro de ATPasas de membrana y transportadores de glutamato y clucosa: – – – – Despolarización de membrana. Depleción de ATP. Excesivo influjo de Ca. Disfunción mitocondrial. • Protección: antioxidantes y estabilizadores de la homeostasis del Ca, neurotróficos y citoquinas. b-amiloide b-amiloide Apoptosis APP Casp-3 Ab C31 Factores Genéticos • Mutaciones en APP, presenilinas1 y 2. • Desarrollo temprano y hereditario de la enfermedad. • Mutaciones en presenilinas: – Incremento de la digestión g-secretasa. – Pre-1*: neuronas más susceptible a apoptosis. • Acción Pres-1 anterior a la activación de caspasas. Aumenta la salida de Ca del RE. Parkinson • Disfunción motoral. • Degeneración de las neuronas dopaminérgicas in la substancia nigra. • Neuronas: estrés oxidativo incrememtnado y disfunción mitocondrial. • Déficit del complejo mitocondrial I. • Factores genéticos y ambientales sensibilizan a las neuronas al estrés oxidativo y déficit energético. Mecanismos Moleculares • Incremento de par-4 y p53 en neuronas dopaminérgicas. • Inhibidores de la caspasa-1, drogas que suprimen la síntesis de macromoléculas y facotres neurotróficos protegen a las neuronas in vitro. • Mutaciones en a-synuclein en un pequeño número de casos. Huntington • Movimientos incontrolados. • Enfermedad hereditaria: expansiones de CAG en el gen de hungtintin Incrementos de repeticiones de poliglutamina. • Transtornos de la función mitocondrial y muerte excitotóxica. • El efecto de hungtintin* no se limita a las neuronas. Mecanismos Moleculares • Redistribución de Casp-8 en una fracción insoluble del tejido del striatum. • Huntingtin* Caspasa-8. • Caspasas huntingtin agregación y neurotoxicidad. • Espresión de huntingtin inhibe la apoptosis antes de la lesión mitocondrial. Esclerosis Lateral Amiotrófica • Parálisis progresiva. • Degeneración de las motoneuronas en la médula espinal. • Formas esporádica y genética (mutaciones en la cu/Zn SOD). • SOD* no disminuye su actividad antioxidante pero incrementa su actividad pro-apoptótica. Mecanismos Moleculares • SOD* interacciona con H2O2 o O- daño oxidativo en las membranas y alteraciones en las funciones mitocondriales vulnerables a la apotposis excitotóxica. • Incremento de Bax, no de Bcl-2. • Sobreexpresión de Bcl-2 e inhibidores de caspasas retrasan la degeneración y muerte. Infarto Cerebral • Infarto: – Corazón necrótico. – Penumbra isquémica. • Daño del ADN y activación de PARP. • Expresión genes proapoptóticos y salida de cyt-c. • Hidrólisis de MPL: – ASMasaEsfingomielina ceramida. Apoptosis En Enfermedades Neurodegenerativas • • • • Apoptosis neuronal. Mecanismos de supervivencia. Enfermedades neurodegenerativas. Aplicación: estudio de la apoptosis neuronal asociada a la enfermedad de scrapie.