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Contaje de placa aeróbica,
Tinción Gram y Aislamiento
Laboratorio de Microbiología de
Alimentos
Contaje de placa aeróbica
• Provee un estimado general de bacterias
aeróbicas vivas
• Evalúa calidad
• Predictor de “shelf-life”
• Monitoreo ambiental
• Excluye
– Anaerobos obligados
– Microaerofílicos
Contaje en placas
• Asume
– Cada colonia proviene de una sola célula
bacterial
– Algunas colonias puede ser originadas de una
“agrupamiento”de bacterias
• Se reporta como
- Unidad formadora de colonias (CFU)/gramo
ó ml.
- NO como bacterias totales
Resultados del Contaje de placa
aeróbica
•
•
•
•
Evalúa la sanitación de una producto
Predice la durabilidad (Shelf-life)
Indicador de seguridad (Safety)
Monitorea el ambiente
Limitaciones del contaje de
placa aeróbica
• Sólo se consideran organismos aeróbicos
• No se sabe el tipo de bacteria
• El medio de cultivo permite el crecimiento de
ciertas bacterias
• Limitaciones visuales/Errores humanos
• Difícil de distinguir entre partículas de alimentos
y bacterias
• No se debe utilizar en alimentos fermentados
• Las colonias podrían ser muy pequenas para
verse
Tipos de muestra
• Líquidas
– Líquidos no viscosos se miden con pipetas
– Líquidos viscosos se pesan
• Sólidas
– Pesar asépticamente
• Hisopo
– Tomar muestra pasando un hisopo por un área
definida
• Ambientales y de envases
– Enjuage el interior del envase
– Abra una placa para tomar una muestra del aire
– Placas RODAC
Protocolo para Contaje en Placas
• Prepare un homogenado de la muestra
– Dilución 1:10
– 1 parte de la muestra a 10 partes del volumen
total
• Mezcle en licuadora o “stomacher”por 2
minutos
10 g/ml muestra
90 ml of diluyente
1:10 Dilución – 10-1
Protocolo para contaje en placas
• Prepare diluciones seriadas
– Diluya hasta que obtenga colonias separadas entre 20200 en una placa
– Utilice una pipeta estéril entre cada dilución
– Ponga la pipeta usada en el área designada
• Mezcle cada botella de dilución 25 veces en un
arco de 90 grados por 7 segundos
• Use amortiguador de fosfato o peptona para
diluir
Diluciones
Sample Homogenate Dilution Blanks Containing 90 ml Diluent
10 ml
10-1
(1:10)
10 ml
10 ml
10-2
10-3
(1:100) (1:1000)
10 ml
10-4
(1:10000)
10-5
(1:100000)
Placas
Put 1 ml of Each Dilution into Empty Petri-Dish
10-1
1 ml 1 ml
10-2
1 ml 1 ml
10-3
10-4
10-5
1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml 1 ml
Protocolo Contaje de placas
• Anada 18-20 ml de agar (45-50F), a la placa petri
– El agar no puede estar muy caliente porque mata las
bacterias
• Método estándar ó agar de placa (Plate Count
Agar)
• Mueve 10x en cada dirección
• Deje que solidifique
• Incube las placas invertidas a 35-37 por 48
horas.
Esterilización
• El equipo y el medio de cultivo debe estar estéril
• Esterilización en aire caliente
– 170 C por una hora
• Ponga en horno por 2 horas luego que éste alcance la
temperatura
• Envuelva en papel o papel de aluminio
• Esterilización por vapor
– 121C por 15 min. Debe alcanzar el autoclave 15 psi
de presión
• Equipo y medio líquido
• No ponga las tapas apretadas
Tinción Gram
• Gram positivo ó negativo
• Basado en la estructura de la pared
• Gram positivo
– Pared gruesa por la capa de peptidoglicano
• Gram negativo
– Capa fina con presencia del lipopolisacárido
Obtención de colonias aisladas
• La meta es obtener colonias aisladas del
alimentos y/o cultivo
• Las colonias pueden ser identificadas y
evaluadas
2
1
4
3
•Collect loopful of culture
•Streak in each area starting
with area 1
•Flame Loop in between
areas
Contaje de placas
• Sólo cuente las placas que tengan entre 20
y 200 colonias
• Más de 200
– TNTC
• Menos de 20
– TFTC
Contaje de placas
Plate
1:10
1
TNTC1
2
Average
1
1:10000
1:100000
TNTC TNTC
200
192
TNTC TNTC TNTC
150
10
175
-
-
1:100
-
1:1000
-
Too Numerous to Count
2 Too Few to Count
•Average two countable plates and Multiply by Dilution Factor
•Count is 175 x 104
•Must Convert to TWO Significant Digits
•1.8 x 106 cfu/ml or g
Contaje-Ejemplos
Plate
10-1
10-2
10-3
10-4
1
TNTC
300
150
10
2
TNTC
200
100
20
Average
-
250
125
TFTC
Use ALL FOUR even though 300 is outside range. If ONE
PLATE is in RANGE, use BOTH for Average.
250 x 102 – 2.5 x 104
125 x 103 – 1.3 x 105
AVERAGE – 7.8 x 104 cfu/g or ml
Contaje - Ejemplos
Plate
10-1
10-2
10-3
10-4
1
TNTC
TNTC
TNTC
300
2
TNTC
TNTC
TNTC
400
Average
-
-
-
350
All Dilutions are outside Range so we MUST use counts
Outside range
350 x 104 – 3.5 x 106 cfu/ml or g*
Use an “*” when using dilutions outside countable ranges
This means it is an ESTIMATED count
Contaje- Ejemplos
Plate
10-1
10-2
10-3
1
TNTC
300
10
2
TNTC
400
5
Average
-
250
125
If Both Dilutions are outside Range, use the Higher Dilution
(LOWER COUNTS)
7.5 x 103 cfu/ml or g*
Placas con muchas colonias
• Cuente la dilución mayor y utilice las rejillas en el
contador de colonias
– 1 rejilla = 1 cm2
– Una placa plástica estándar tiene 56 cm2 de área de
superficie
• Si <10 colonias/cm2 cuente 12 cuadrados (6 consecutivos
verticales y 6 consecutivo horizontales)
– Totalice y divida por 12 (promedio). Multiplique por
56 para obtener
– el número total de colonias en la placa. Reporte como
estimado
• Si >10 colonias/ cm2
– Cuente 4 cuadrados, promedie y multiplique por 56
Variaciones al contaje aérobico
• Psicotróficos
– Incube a 5-7 C por 10 días
– Use esparcido
• Termodúricos
– Ponga 5 ml de la muestra o la dilución 1:10 de la
muestra sólida en bano de agua entre 60-80n C por 30
minutos
– Enfríe en hielo por 10 minutos
– Ponga en placa e incube
Primer Período
Esquema
Segundo Período
Petrifilms
Ventajas y desventajas de utilizar
los petrifilms
• Ventajas
Rápido
Menos espacio
Fáciles
No hay que preparar
medio
Distinción entre CFU
vs. Partículas de
alimentos
• Desventajas
Morfología de la
colonia
Costoso
Difícil de leer