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Onda electromagnética =
cambios periódicos de un campo magnético (M) y un
campo eléctrico (E) en el espacio y en el tiempo, que se propagan a la velocidad de la luz.
En cualquier punto, M es perpendicular a E, ambos oscilan en planos perpendiculares a la
dirección de propagación.
Onda EM polarizada en un plano (vertical)
se representa sólo el vector E (en verde)
Onda EM
polarizada
en un plano
(horizontal)
se representa
sólo el vector
E (en rojo)
Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism
2 ondas polarizadas en un plano, en fase
(alcanzan picos y cero al mismo tiempo)
Vector resultante = luz
polarizada en un plano
pero a 45º respecto a los
componentes iniciales
Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism
2 ondas polarizadas en un plano pero desfasadas 90º (o -90º) o sea una
alcanza maximos (o mínimos) cuando la otra pasa por cero
Vector resultante rota en un círculo = luz polarizada circularmente
a derecha
a izquierda
Propagación de
la onda
resultante
en espiral
(no sinusoidal)
Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism
Interacción de luz polarizada con la materia
Luz polarizada en un plano, al interaccionar con medio que absorbe (no birrefringente)
Luz trasmitida polarizada en igual plano, pero de menor intensidad
(menor amplitud, igual frecuencia)
Luz polarizada circularmente al interaccionar con medio que absorbe
(no birrefringente)
Luz trasmitida polarizada también circularmente, pero de menor intensidad
(menor amplitud, igual frecuencia)
2 ondas polarizadas circularmente a derecha e izquierda,
de la misma amplitud
Vector resultante = luz polarizada en un plano
Tomado de http://com,mons.wikimedia.org/wiki/Image:Circular_Dichroism
Luz polarizada circularmente al interaccionar con medio que absorbe
diferencialmente a izquierda y derecha
No absorbe
luz polarizada
circularmente
a izquierda
(rojo)
Absorbe luz
polarizada
circularmente
a derecha
(verde)
Luz trasmitida polarizada elípticamente
CD transforma luz incidente polarizada en un plano en luz polarizada elípticamente
DICROISMO CIRCULAR
Mide la capacidad de moléculas ópticamente activas de absorber
diferencialmente la luz polarizada circularmente a izquierda y a derecha
A = absorbancia a determinada l
ε= coef. Absortividad molar (M-1 cm-1)
C = conc. (en M) de la muestra
l = paso optico
θ = elipticidad (medida en grados, “deg”)
[θ] = elipticidad molar (deg cm2 dmol-1)
Como la elipticidad es un valor pequeño en general, tan θ = θ (radianes)
Como la intensidad de la radicación I es proporcional a E2
Como ΔA<<1, se puede aproximar usando serie de Taylor y convirtiendo radianes a grados:
θ (deg) = 33 DA
[θ] = θ x 100 x MW
c ( mg/mL) x l (cm)
[θ] (deg cm2 dmol-1) = 3300 Dε
θ (deg) = 33 DA
θ(deg) x 100/ l C = 3300 Dε = [θ] molar (deg cm2 dmol-1)
Para una medida θ = 10 mdeg,
DA = 0.0003 !!!
• buena estabilidad del espectropolarímetro
• cuvetas de cuarzo fundido alta transparencia
• temperatura controlada
• en UV lejano molestan algunas sales de buffers, O2 (degasear)
Espectros CD de proteínas
• Región UV lejano, región amida: 170 - 250 nm
Dominada por contribución del enlace peptídico.
Da información sobre estructura secundaria.
Absorción característica:
α-hélice (2 mínimos a 208 y 222 nm y máximo a 190 nm)
β plegada (1 mínimo a 217 nm y 1 máximo a 195 nm)
Información muy confiable para proteínas con fuerte
% α-hélice, comparable a Dif RX o RMN
• Región UV cercano: 250 – 300 nm
Contribución de aminoácidos aromáticos y disulfuros
Da información sobre estructura terciaria
Criterio muy sensible del estado nativo de la proteína
CD lejano
Proteína recombinante vs
proteína natural
CD cercano
= proteína (anticuerpo monoclonal)
de 2 distintos lotes de producción
Variación de la elipticidad (θ a 220 nm)
con la temperatura.
La misma concentración de proteína
pero en buffers a distintos pH:
línea azul pH 6.0, línea verde 7.4,
línea celeste pH 8.5
Dicroismo circular UV lejano de proteínas
Cálculo de cantidad relativa de estructura secundaria
θi (λ) = Espectro CD base para cada estructura secundaria i
(polipéptidos sintéticos o proteínas modelo)
[θ(λ)] = fα [θα (λ)] + f β [θβ (λ)] + f t [θt (λ)] + fR [θR (λ)]
α = α-hélice
β = β plegada
t = giros (turn)
R = ovillo estadístico (Random coil)
Σf i = 1
f i se obtiene resolviendo para un set de λ
Aplicaciones CD-UV de proteínas:
• Estimar % de estructura secundaria
(fracción de la proteína como a-hélice, b plegada, giro b u otra)
• Cambios en estructura secundaria
(con temperatura, agentes desnaturalizantes)
• Verificar si la proteína está en su conformación nativa
(efecto del pH, sales, solventes, temp.)
CD-Visible de proteínas con grupos prostéticos (cuando el metal se
encuentra en ambiente quiral)
Información sobre la interacción metal-proteína. Resuelve bien transiciones electrones d-d
CD de ácidos nucleicos
nativo
desnaturalizado
Espectro CD (arriba) y de
absorción (abajo) de ADN
de E.coli nativo (―),
desnaturalizado (– – –) y
la suma de los
deoxinucléotidos
correspondientes (•••)
CD de ácidos nucleicos
Representación esquemática de los espectros CD-UV de ADN
en varias estructuras secundarias: A, B y C (o Z)
CD de ácidos nucleicos
CD-UV espectro
Polideoxinucléotido GC:
poli d(GC).poli d(GC) en distintas
estructuras secundarias:
A
B-ADN (•••), A-ADN (– – –) y
Z-ADN (―)
B
Z
El espectro CD de ApG, es la suma de los monómeros + término
adicional que considera la interacción base-base:
2[qApG(l)] = [qA(l)] + [qG(l)] + IAG(l)
El espectro CD de ApGpU, es la suma de los monómeros + términos
adicionales que consideran cada interacción base-base:
3[qApGpU(l)] = [qA(l)] + [qG(l)] + [qU(l)] + I'AG(l) + I'GU(l) + I”AU(l)
Aplicaciones CD-UV de ácidos nucleicos:
• Verificar correcto apareamiento de bases (por ej. de una hebra
modificada con su hebra complementaria)
• Cambios en estructura secundaria con temperatura, agentes
desnaturalizantes (por ej. cálculo de Tm)
• Estudiar isomerizaciones conformacionales (helix-coil, B-A, B-Z)