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Identificación y análisis funcional de microRNAs desregulados en cáncer mama Dr. César López Camarillo Laboratorio de Oncogenómica y Proteómica del Cáncer genomicas@yahoo.com.mx POSGRADO EN CIENCIAS GENÓMICAS secuencia del genoma humano se conoce desde Lafebrero de 2001 James Watson 3,200 millones de bases (3200 Mb) Predice unos 20,000 - 25,000 genes (1.5% genoma !) Craig Venter 70% está compuesto por ADN extra-génico no codificante (DNA basura - microRNAs) Examples of People Who Have had Their Genomes Sequenced Jim Watson James Watson Craig Ventor Craig Venter From: www.genciencia.com sciencewithmoxie.blogspot.com.au/2010_11_01_archive.html Ozzy Osbourne El Dogma Central de la Biología Molecular y los “omas” Gen-oma (DNA) ACGTTATGAGACGGATTAGGACAAACTATAA AAATATTAGCCGATGATCACCCAGGATTTTT Transcript-oma (mRNA) MicroRN-oma (miRNAs) Prote-oma (Proteínas) microRNAs: nuevos reguladores de la expresión genética Transcritos RNAs no codificantes RNAm que codifican proteínas RNAs reguladores de la expresión génica siRNAs, lncRNA, microRNAs RNAs de mantenimiento tRNA, rRNA, snRNA snoRNAs MicroRNAs: RNA pequeños (21-25 nt) que regulan negativamente la expresión genética. Descritos en 1993 por Victor Ambros en C. elegans. Un microRNA puede modular hasta mas de 100 transcritos y proteínas diferentes Los microRNAs son reguladores negativos de la expresión génica Existen mas de 1000 miRNAs codificados en el genoma humano. Se desconoce la función de mas del 80% de los miRNAs. Gen miRNA mi MicroRNA Los genes que codifican a los microRNAs (>1000) se localizan dispersos en el genoma. Se unen a la región 3´UTR de los RNAm (transcritos) e inhiben su traducción e inducen su degradación Degradación del RNAm Silenciamiento de la expresion génica OncomiRs: microRNAs que funcionan como oncogenes y supresores de tumor Un microRNA funciona como oncogén cuando inhibe genes que suprimen la proliferación, crecimiento tumoral, metástasis, o que activan apoptosis miR-21 miR-21 PDCD4 PDCD4 Apoptosis Cáncer Los microRNAs modulan los hallmarks del cáncer Autosuficiencia de las señales de crecimiento Evasión de la apoptosis Angiogénesis Insensibilidad a las señales de anti-crecimiento Potencial replicativo ilimitado Invasión de tejidos y metástasis Los microRNAs representan nuevos blancos terapéuticos en cáncer La expresión de los miRNAs se altera frecuentemente y contribuye a la carcinogénesis Cáncer de mama Crecimiento exacerbado de los tejidos de la mama debido al aumento en la proliferación migración e invasión celular, así como la inhibición de la apoptosis . Es la neoplasia con mayor incidencia y mortalidad en las mujeres. Una muerte por cáncer de mama cada 2 h. (10%) (80%) Genómica integrativa (omics) en el descubrimiento de biomarcadores en cáncer Tumour, serum Protemics Protein quantification (2DE) Protein identification (MS/MS) microRNAs profiling miRNAs microarrays qRT-PCR arrays (TLDA) Transcriptomics DNA microarray RNA seq normal Diferentially expressed onco-proteins tumoral Differentially expressed omcogenic mRNA/miRNA Concordant protein/mRNA/miRNA expression (Regulatory networks) normal tumoral Validate proteins, mRNAs Microarray tissues (IEQ) Functional analysis Therapeutic targets Biomarker candidates Validation in patients Prognostic markers Búsqueda de microRNAs desregulados en cáncer de mama Cirugía Sueros Biopsias Congelación en N2 almacenamiento a 80°C Banco de tejidos FUCAM Inmunohistoquímica ER, PR, HER2 Megaplex Primers TaqMan Low Density Arrays (TLDA) 667 microRNAs cuantificados en un solo paso 54 miRNAs modulados (FC ≥2.0 p=0.05) 34 miRNAs reprimidos (63%) 20 miRNAs sobrexpresados (37%) Huella de expresión de 54 miRNAS y validación de TLDAs MicroRNAs seleccionados para análisis funcional miRNA Reportes Función miR-944 ↓ (9/9) Sobre-expresado en Induce migración cáncer de cérvix miR-204 ↓ (9/9) En cancer de mama, cancer endmetrial, glioma Reprime migración y metástasis miR-18b ↑ (9/9) Reprimido en cáncer de prostata. . Regulación negativa del receptor HER2 Procesos y rutas celulares Blancos predichos Vía de señalización WNT APC, AMOT, DLL4, Vía de señalización de TGF-b IGF1R, JAG1, MAPK1, Glioma, Cáncer colorectal NF1, NEXN, PTP4A1, TAC1 THBS1, VEGFA, ARID5B, BTG1, CD2AP, POU3F2, POU4F1, SIX4, MAPK Biosíntesis de glicanos Uniones adherentes Señalización Fc epsilon R1 HIF1A, IGF1, MAP3K1, PARD6B, KIT Análisis funcional del miR-204 en cáncer de mama M. en C. Ali Flores Pérez, UACM La expresión del miR-204 se reprime en tumores y líneas celulares de cáncer de mama ¿Genes regulados por el miR-204? Transfección del precursor miR-204 Transcritos modulados por el miR-204 (DNA microarrays) Supresión de los transcritos blanco de miR-204 DNA microarrays Nimbelgen 12x135 (Roche) miR-944 transfected No transfected control 135,000 probes 3 probes per gene 45,032 genes Oligos 60-mer 549 modulated genes by miR-204(FC≥2.0) 311 suppressed genes 238 upregulated genes Procesos celulares en los que participan los genes modulados por el miR-204 ¿ La restauración de la expresión del miR-204 modula los hallmarks del cáncer ? Transfección del miR-204 Análisis de fenotipos: migración, invasión, proliferación, angiogénesis Supresión de los transcritos blanco de miR-204 El miR-204 inhibe migración de las células tumorales Scratch/wound healing assays Transwell assays Inserto Membrana El miR-204 inhibe la proliferación celular Clonogenic assays El miR-204 reprime genes involucrados en angiogénesis Agentes pro-angiogénicos Agentes anti-angiogénicos VEGFA Angiopoyetina 2 ANGPT1 Trombospondina FGF (α y β) Interleucina 4, 12 y 18 TNF-α, interfereron α,β,γ MMPs (2 y 9) Troponina-1 Angiogenina e Angiostatina IL8 TGFβ/TGFBR El miR-204 inhibe la angiogénesis in vitro Co-culture angiogenesis assays HUVEC/MDA-MB-231 MDA-MB-231 HUVEC/MDA-MB-231-Sc HUVEC HUVEC/MDA-MB-231 miR-204 Human umbilical vein endothelial cells (HUVEC) are cells derived from the endothelium of veins from the umbilical cord. They are used for the study of the function and pathology of endothelial cells and angiogenesis. HUVEC/VEGFA ¿ El miR-204 inhibe la angiogénesis a través de la represión del mRNA de los genes pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2 ? 3´UTR LUC assay 3´UTR of miR-204 target In abscence of miR-204 miR-204 3´UTR ANGPT1 miR-204 El miR-204 se une a la región 3´UTR y reprime la expresión de ANGPT1 y TGFBR2 CONCLUSIONES: Identificamos nuevos microRNAs desregulados en cáncer de mama de pacientes mexicanas El miR-204 inhibe proliferación y la migración de la célula tumoral. El miR-204 inhibe angiogénesis a través de la unión directa y desregulación del mRNA de los factores pro-angiogénicos ANGPT1 y TGFBR2 La restauración del miR-204 en tumores de pacientes podría considerarse como una estrategia útil en la terapia del cáncer de mama Colaboradores Dr. Sergio Rodríguez Cuevas Dra. Verónica Bautista Instituto de Enfermedades de la Mama, FUCAM Dr. Alfredo Hidalgo Miranda Instituto Nacional de Medicina Genómica, INMEGEN Dra. Elena Arechaga Ocampo Dr. José Díaz Chávez Dra. Erika Ruiz Garcia Instituto Nacional de Cancerología, InCan Dra. Laurence Annie Marchat Programa en Biomedicina Molecular, ENMyH-IPN Dra. Ángeles Carlos-Reyes Financiamiento Instituto Nacional de Enfermedades Respiratorias Dr. Patricio Gariglio CINVESTAV-IPN Fonsec Salud 2009-2012 Fonsec Salud 2014-2017 Ciencia Básica 2014-2017 Se aceptan estudiantes de Maestría y Doctorado en Ciencias Genómicas !! genomicas@yahoo.com.mx Gracias por su atención Biomarcadores tumorales en la clasificación y tratamiento del cáncer de mama HER2 ER PR Inmunohistoquímica Variables clínicas pronósticas Tamaño tumor Nódulos Metástasis ER+, PR+, HER2+/- Marcadores tumorales (variables biológicas) Receptor de estrógenos (ER) progesterona (PR) y HER2 ER+, PR+, HER2+++ ER-, PR-, HER2- Luminal A HER2 Triple negativo (50%) (30%) (15-20%) Terapia hormonal Tamoxifeno (anti-ER) Ablación ovárica Anastrozol, Letrozol Quimioterapia Terapia personalizada Trastuzumab (anti-HER2) Tamoxifeno (anti-ER) Quimioterapia Quimioterapia La expresión de 54 miRNAs seen moduló 54 miRNAs se desregularon los significativamente en 9 tumores mamarios ductales tumores mamarios microRNAs reprimidos miR-139-5p miR-508-3p miR-10b* miR-944 miR-486-5p miR-100 miR-424* miR-125b-2* miR-218 miR-541 miR-221* miR-337-3p miR-369-3p miR-1 miR-26b* miR-95 miR-204 miR-216b miR-656 miR-488 miR-139-3p Let-7b miR-543 miR-335 miR-433 miR-489 miR-132* miR-195 miR-376c Let-7c miR-432 miR-132 miR-376a miR-10b microRNAs sobreexpresados miR-155 miR-331-3p Let-7g* miR-188-5p miR-708 miR-301a miR-454* miR-7 miR-130b miR-18b miR-183* miR-181a* miR-21 miR-142-3p miR-592 miR-425* miR-431 miR-142-5p miR-148b* miR-638 Los microRNAs regulan de manera negativa la expresión génica López-Camarillo C., et al 2013