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Impact factor 2010: 31.152
5-Year Impact Factor: 32.628
Issues per year: 26
OBJETIVOS
Demostrar que la replicación del DNA en mamíferos es bidireccional, con la
formación de fragmentos de Okazaki en una de las cadenas (síntesis discontinua).
Los fragmentos de Okazaki cambian de una cadena a otra dentro de un Origen de
Replicación Bidireccional (OBR)
Identificar un OBR cerca del gen de DHFR.
Vaughn et al. (1990) described convincing evidence for the surprising conclusion that the DNA replication
origin located downstream of the dihydrofolate reductase (DHFR) gene in Chinese hamster cells consists of a
broad initiation zone extending over 26 kb. However, the data presented by Burhans et al. (1990) in this
issue suggest the contradictory conclusion that replication forks must emanate bidirectionally from a site
that is no larger than 450 nucleotides.
FIGURE 1: PROTOCOLO EXPERIMENTAL
BrdUTP: 5 - Bromo - 2’ - deoxyuridine 5’ - triphosphate
BrdU = Bromodeoxyuridine
FIGURE 2: MAPPING ORIGINS OF REPLICATION
FIGURE 3: PULSE AND CHASE
Heat denaturation
High MW
DNA
Alkaline denaturation
Características fragmentos de Okazaki:
Longitud en aprox. mamíferos: 25-300
nucleótidos.
Naturaleza transitoria (son rápidamente
unidos a la cadena naciente).
Mayoritariamente
retrasada.
Broad peak of
low MW DNA
(average 105
nt, range 40250 nt)
en
la
cadena
FIGURE 4: HIBRIDACION Y CLONADO EN COSMIDOS
Buscando el origen de replicación…
Hibridación usando como
fragmentos de Okazaki:
sonda
los
FIGURE 5: DOT BLOT
DOT BLOT
FIGURE 6: CUANTIFICACION DEL RESULTADO DE DOT BLOT
FIGURE 7: ACERCANDOSE AL ORIGEN DE REPLICACION, COMPARACION
CON OTROS PAPERS