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INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO
(CROSSLINKING)
Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO
(CROSSLINKING)
Prof. J.M. Sánchez Montero, Grupo de Biotransformaciones, Facultad de Farmacia, UCM
MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
RESIDUOS ÁCIDOS (Glu, Asp)
OH
R N C N R
O
O
O
N
HN
R
R
R NH2
OH
NH R
O
O
OH
R-OH
BF3.OEt
O
O
R
H
N
O
O
SO3
Et
O
N Et
SO3
OH
O
Reactivo K de
Woodward
O
O
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MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
SO3
O2N
ARGININA
NO2
METIONINA
O
LISINA
R
R
NO2
NH2
H
N
O2N
N
O
NH
NO2
NH
TNBS
NH2
R
R
fenilglioxal,
butanodiona
N
S
NH
CH3
[O]
S
O
[O]
[O]
O2N
CISTEÍNA
K
O C N
SH
NH
H
O
HO P O
HO
O
N
NH2
HO
CH3
P O
N
CH3
OH
PLP
O
HISTIDINA
O
Et
NH
CO2H
O2N
O
SH
O
O
O
O
N
CH3
O
CO2H
NO2
CO2H
NO2
S S
Et
N
OR
S
S
H
N
N Et
OH
N
O
O
O
O
SH
O
CH3
O
N Et
O
OH
OR
S
O
NH2
OR
I
O
O
NH2
S
OR
I
CH3
DTNB
S
S
O Et
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MODIFICACIÓN UNIPUNTUAL
TIROSINA
O2N
OH
SERINA
OH
OH
TRIPTÓFANO
NO2
NO2
NO2
H
N
NO2
TNM
[O]
OH
O
F P OR
OR
O
F P R
OR
O
O P OR
OR
H
N
O
[O]
Br
O
O P R
OR
H
N
luz, O2
NBS
dimerizacíon,
ruptura anillo
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Modificaciones unipuntuales de interés
Objetivo: hacer a la enzima insoluble en disoluciones acuosas.
Uno de los métodos más tradicionales:

UNIÓN
COVALENTE
DE
UN
POLÍMERO
ANFIPÁTICO.
El más habitual: monometoxipolietelienglicol (mPEG)
MeO
O
O
OH
O
n
Peso molecular variable. El mas usado: sobre 5 kDa.
Dependiendo del grado de modificación, se consigue la total
insolubilidad en agua.
Este grado debe ser controlado cuidadosamente, pues puede
conducir a la pérdida de actividad.
La unión se suele hacer sobre lisinas.
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Uno de los más empleados.
A través de TCT (cloruro cianúrico)
Debe controlarse bien
Copolímero con anh. succínico
Enlace amida estable
A través de un carbamato
Se sigue fácilmente la activación.
Oxidación del mPEG
Se activa el grupo ácido con
N-hidroxisuccinimda.
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Otra característica interesante de esta metodología:
SE OBTIENEN DERIVADOS SOLUBLES EN
CIERTOS DISOLVENTES ORGÁNICOS:
Benceno, tolueno y clorados (cloroformo,
1,1,1-tricloroetano, tricloroetileno)
LA CATÁLISIS SE HACE HOMOGÉNEA.
Inmovilización en disolventes orgánicos?
Siempre que se pueda recuperar el derivado.
Recuperación:
Añadiendo disolv. muy apolares (hexano,
éter de petróleo) se produce la pptación.
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INMOVILIZACIÓN POR ENTRECRUZAMIENTO
(CROSSLINKING)
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O
O
H
O
O
H
Glutaraldehido
O
C
N
N
C
hexametilenbisisocianato O
O
n
MeO
n
O
I
O
hexametilenbisiodoacetamida
SH
NH2
OH
SO3
F
N N
N N
Cl
NO2
S
O
O3S
I
N
H
O
bisimidatos
NH2
N,N-hexametilen-bismaleimida
SH
H
N
OMe
NH2 NH2
bis-oxiranos
O
O
NH2
NH2
N
N
O
divinilsulfona
NH2
2,2'-disulfonato de bisdiazobencidina
SH
OH
F
N
Cl
NO2
N
N
Cl
NH2
NH2
OH
OH
OH
O
Cl S
O
O
S Cl
O
REACTIVOS ENTRECRUZANTES
DIFUNCIONALES
NH2
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Cross-Linked Enzyme Aggregates
Cross-Linked Enzyme Crystals
Cross-Linked Enzymes
Crosslinked Spray-Dried Enzymes
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Cross Linked Enzymes (CLE)
A comienzos de los años 60 se describe por primera vez que el tratamiento de enzimas con
reactivos difuncionales (fundamentalmente glutaraldehído) originaba derivados insolubles
con retención de actividad (CLEs)
Al mismo tiempo, se aumentaba la termoestabilidad (sobre todo en enzimas multiméricas),
pero se necesitan unas condiciones muy delicadas (cantidad crosslinker, T, pH, fuerza iónica).
El material obtenido era gelatinoso, y se intentó el entrecruzamiento con otras moléculas para
aumentar propiedades mecánicas,
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ENTRECRUZAMIENTO INTRAMOLECULAR
Centro activo
Enzima nativa
Enzima desplegada
(desnaturalizada)
Enzima estabilizada
por un
entrecruzamiento
intramolecular
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Cross Linked Enzyme Crystals (CLECs)
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Proceso de cristalización
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Entrecruzamientos
más habituales
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Ventajas
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Mayor actividad por unidad de volúmen (partículas uniformes, microporosas,
formadas por sólo moléculas de enzima pura, lo que implica la máxima posible
concentración de enzima)
Gran actividad específica
Fácil separación del medio de reacción, lo que facilita su reutilización.
Buenas propiedades mecánicas y termoestabilidad, así como resistencia a
disolventes orgánicos.
No producen contaminación medioambiental.
No requieren soportes muy caros
Resistentes a la proteolisis
Desventajas
1.
2.
3.
Dificultad de cristalización
Problemas de difusión (debe miminizarse el tamaño del cristal)
Alto precio
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CLECS
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CLECS
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Cross Linked Enzyme Agreggates (CLEAs)
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POSIBILIDADES
Crosslinked Enzyme Crystals
CLECs
Crosslinked Enzyme Aggregates
CLEAs
Enzimas puras y cristalinas
Enzimas con trazas de impurezas
Necesidad de enzima pura
Coagregación de enzimas
Estabilización de proteinas
multiméricas
Agregación de enzima y polímero
Estabilización de enzimas
multiméricas
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ESQUEMA DE CLEAs
+
precipitante
PEG
Sales, disolventes
CLEAs
entrecruzante
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ENTRECRUZAMIENTO INTERMOLECULAR
lento
rápido
Enzima multimérica
Enzima disociada
(reversible)
Enzima
desnaturalizada
(irreversible)
Muy lento
Enzima multimérica
entrecruzada
Enzima desnaturalizada
entrecruzada
(irreversible)
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN
Es el método más sencillo y antíguo (células de acetobacter
adsorbidas sobre palos de madera para obtener vinagre por
fermentación-1815)
Se puede emplear tanto para células como para enzimas.
Las fuerzas de unión son débiles:
Van der Waals
Interacciones iónicas
Enlaces de hidrógeno.
Se producen fácilmente desorciones debido a:
variaciones concentración de sustrato.
Cambios de pH
cambios de T
alteración de la fuerza iónica.
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN
Soportes típicos:
carbón activo
sílice, alúmina, titania, ...
Tierra de diatomeas (Celite)
celulosa
resinas sintéticas
CPG (controlled pore glasses).
La mayoría de las enzimas se unen mejor a soportes polares
Las lipasas se unen mejor a superficies hidrofóbicas
MÉTODO MUY RECOMENDADO PARA ENZIMAS EN
DISOLVENTES ORGÁNICOS (NO DESORCIÓN)
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN
Unión iónica es bastante habitual.
Se usan a nivel industrial resinas intercambiadoras :
catiónicas
carboximetilcelulosa
amberlite IRA
aniónicas
dietilaminoetilcelulosa (DEAE-celulosas)
resinas Sephadex
Se precisa un exquisito control del pH de la inmovilización :
Coherencia con la carga neta enzimática como consecuencia del
pKa.
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INMOVILIZACIÓN POR ADSORCIÓN
Metodologías empleadas:
métodos en batch
ayuda de precipitación (ej acetona, isopropanol)
métodos en columna
plug flow
lecho fluidizado
REGLA DEL DIÁMETRO DE GIRO (spin diameter)
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HN
O
O
O
E
HN
(S)
O
HN
O
(R)
O
+
(R)
O
(S)
OH
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