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Explicación de TPs Nº 1 y 2
Herencia y técnicas de biología
molecular utilizadas en el
diagnóstico de enfermedades
hereditarias
Química Biológica Patológica
Bioq. Mariana L. Ferramola
Dogma central de la biología molecular:
El ADN es la molécula responsable de contener
toda la información genética de un ser vivo.
Nomenclatura de los cromosomas:
Genética Mendeliana:
Considerado el padre
de la genética, estudió
el genotipo y el
comportamiento de
los genes en las
distintas generaciones
de guisantes a partir
de su fenotipo.
Fraile Gregor Johann Mendel
1822-1884
Conceptos básicos en genética:
Gen
Alelo
Locus (loci)
mutación
Genotipo
Fenotipo
Cromosómicos.
Desórdenes
genéticos
Monogénicos o
mendelianos.
Multifactoriales.
Formas de herencia de los trastornos
monogénicos:
Un trastorno monogénico es aquel que está determinado
principalmente por los alelos localizados en un único locus.
Autosómica.
El gen afectado se
localiza en un autosoma.
En
general,
estos
trastornos afectan por
igual a hombres y
mujeres.
Ligada al cromosoma X.
El gen afectado se localiza en
el cromosoma X.
La incidencia en hombres y
mujeres
es
diferente,
dependiendo de si es de
herencia
recesiva
o
dominante..
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Patrones de herencia
autosómica recesiva.
Patrones de herencia
autosómica dominante.
Los individuos de ambos sexos tienen Los individuos de ambos sexos tienen
una probabilidad similar de presentar el una probabilidad similar de presentar el
trastorno.
trastorno.
En la mayoría de los casos , los padres Al menos uno de los padres del
de un individuo afectado son portadores individuo afectado debe presentar el
rasgo.
asintomáticos de alelos mutantes.
individuos
fenotípicamente
Un hijo de padres heterocigotas Los
presenta un 25% de probabilidades de normales no transmiten el trastorno a
sus hijos.
presentar el trastorno.
Los padres de personas afectadas suelen Cada hijo con un progenitor afectado
presenta un riesgo del 50% de heredar
presentar consanguinidad.
el trastorno.
Se presenta típicamente alternando Se presenta en todas las generaciones
del árbol genealógico.
generaciones en el árbos genealógico.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Herencia dominante
incompleta:
La existencia de individuos
afectados
por
trastornos
dominantes con genotipo AA es
teórica. Los individuos con dicho
genotipo, en general, no son
viables.
Formas de herencia de los trastornos monogénicos:
Patrones de herencia
dominante ligada al X.
Patrones de herencia
recesiva ligada al X.
En un emparejamiento entre un hombre La incidencia del rasgo es mucho mayor
afectado y una mujer sana, todos los en hombres que en mujeres.
hijos serán sanos y todas las mujeres
Los hombres afectados no transmiten el
afectadas.
gen a sus hijos varones, pero si a todas
Una mujer heterocigota afectada sus hijas mujeres.
transmitirá el rasgo a la mitad de sus
hijos, estando igualmente afectados los Están afectados los varones hemicigotos
y las mujeres homocigotas.
varones y mujeres.
La frecuencia de mujeres afectadas es
aproximadamente el doble de la
correspondiente
a
los
hombres
afectados.
Variación genética:
mutación y
polimorfismo.
Mutaciones:
“Cualquier cambio en la secuencia de un nucleótido
o en la organización del DNA”
Genómicas
Mutaciones
Cromosómicas
Génicas
“No todas las mutaciones tienen consecuencias
clínicas”
Tipos de mutaciones génicas:
Deleciones e
inserciones
Sustituciones
de nucleótidos
Mutaciones
dinámicas
Pequeñas (pueden producir
corrimiento del marco de
lectura).
Grandes (afectan la estructura
génica).
Mutaciones de cambio de sentido
Mutaciones sin sentido
Amplificación de secuencias
repetidas de trinucleótidos
Polimorfismos:
Son aquellas variantes alélicas tan comunes que se
encuentran en una frecuencia mayor al 1% en la
población general.
Aplicaciones:
Forenses
Filiación
Medicina
Tipos de polimorfismos: SNPs
SNPs
Son los más sencillos y frecuentes.
En general existen solo dos alelos en
la población.
El hecho de
que los SNPs
sean
comunes no
implica que
sean
neutrales.
Tipos de polimorfismos: de inserción-deleción
Polimorfismos de
inserción-deleción
Aproximadamente el 50% son
simples (tienen 2 alelos en la
población)
El otro 50% son multialélicos.
Microsatélites (STR)
Clasificación:
Minisatélites (VNTR)
Polimorfismos de inserción-deleción: STRs
Segmentos de DNA que consisten en unidades de 2,
3 o 4 nucleótidos, cuya repetición varía entre una y
unas pocas docenas de veces. Son multialélicos.
Muy usados en la
actualidad para
identificación de
individuos.
Polimorfismos de inserción-deleción: STRs
Amplificación
por PCR
Gel de
poliacrilamida
Polimorfismos de inserción-deleción: VNTRs
Segmentos de DNA que consisten en unidades de 10
a 100 nucleótidos, cuya repetición varía entre unos
cientos y miles de veces. Son multialélicos.
Polimorfismos de inserción-deleción: VNTRs
Detección por
autorradiografía
Separación de
fragmentos en
geles de agarosa
Tipos de polimorfismos: de longitud de los
fragmentos de restricción (RFLP).
Se deben a cambios en la secuencia del DNA que
modifican los patrones de corte de las endonucleasas
de restricción.
Han sido muy
utilizados como
marcadores
genéticos, es decir
para determinar la
presencia/ausencia
de una
enfermedad/alelo
mutado en
individuos .
RFLP: detección mediante Southern Blotting
Utiliza una sonda que hibrida en una región conocida, pero no tiene
relación con la mutación que produce el trastorno.
De gran utilidad cuando no se conoce la mutación que produce el
trastorno.
Permite el seguimiento de alelos mutados dentro de una misma familia.
Para su utilización, el polimorfismo y el gen a estudiar deben estar
ligados (separados por una distancia no mayor a 106 pb)
RFLP: detección mediante Southern Blotting
RFLP: PCR-RFLP
• Más simple y
económico que el
RFLP tradicional.
• Se requiere mayor
información de la
zona donde ocurre la
mutación.
• Generalmente es
la mutación que
genera el trastorno
la que da lugar al
polimorfismo.
RFLP: PCR-RFLP
Métodos de análisis de
los ácidos nucleicos.
Conceptos básicos en biología molecular:
Electroforesis
Hibridación
Sonda
Endonucleasas de
restricción
Ligación
Polimerasas
Cebadores
Transferasas
Endonucleasas de restricción:
Son enzimas que cortan la molécula de DNA doble cadena
(dsDNA) en lugares definidos por la secuencia de nucleótidos,
produciendo fragmentos de DNA definidos.
Endonucleasas de restricción:
Cuando se somete un fragmento de DNA a restricción con una
endonucleasa, esta genera fragmentos definidos, que
dependen del patrón de corte de la enzima.
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Separación de ácidos nucleicos mediante
electroforesis en gel:
Geles de
poliacrilamida
 Alta resolución.
 Separan fragmentos de DNA
<500pb.
Geles de
agarosa
 Baja resolución.
 Separan fragmentos de DNA
de entre 300 a 10000pb.
Sondas de ácidos nucleicos:
Molécula de DNA o RNA marcada, usada para
identificar secuencias complementarias mediante
hibridación.
Marcación de sondas
Radiactiva
Interna
No radiactiva
Externa
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Marcación
interna:
DNA polimerasas
 Desplazamiento de
mella (*dNTP).
 Random primer
extension (*dNTP o
*cebador).
Automatizada
 Sondas de
oligonucleótidos
(*dNTP).
Marcación por desplazamiento de mella:
Nick translation.
Marcación por elongación de cebadores
aleatorios: random priming.
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Marcación
Externa:
Polinucleótido quinasa
Transferasa terminal
 Marcación con 32P
en extremo 5’,utiliza
γ[32P]-ATP.
 Marcación no
radiactiva.
 Marcación con 32P en
extremo 3’, utiliza
α[32P]-ATP.
 Marcación no
radiactiva.
Marcación externa: Polinucleótido quinasa
Marcación externa: Transferasa terminal.
Marcación de sondas de ácidos nucleicos:
Formas de marcación
de sondas de ácidos
nucleicos:
Hibridación de ácidos nucleicos:
Las
hebras
complementarias de
ácidos
nucleicos
pueden
separarse
(desnaturalización) y
dadas las condiciones
adecuadas pueden re
asociarse
(hibridación).
Hibridación de ácidos nucleicos:
Factores que afectan la velocidad y especificidad
de hibridación:
 Longitud del acido nucleico.
 Composición de base.
 Fuerza iónica.
 Viscosidad.
 Temperatura
 Presencia de agentes desnaturalizantes.
 pH
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Las reacciones de hibridación con sondas de DNA son tan
sensibles y selectivas que pueden usarse para detectar
secuencias complementarias cuya concentración sea incluso
de 1 sola molécula por célula.
Rigurosa (bajo condiciones
astringentes).
Hibridación:
Poco rigurosa (bajo condiciones
no astringentes).
Longitud de una
sonda:
Desde 5 hasta miles de
nucleótidos
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Hibridación con sondas de ácidos nucleicos:
Métodos de análisis de ácidos nucleicos
que utilizan sondas.
Transferencia Southern
Análisis de DNA.
Transferencia Northern
Análisis de RNA.
Dot Blot
Revelado mediante
sondas ASO.
Transferencia Southern:
Se utiliza para analizar
fragmentos de DNA
generados por digestión
con enzimas de
restricción.
Transferencia Southern:
Transferencia Southern:
Se utilizan sondas de gran tamaño, con grados de
actividad variable, dependiendo del uso.
Principales usos:
 Detección
de
secuencias
relacionadas ( ej. familias de genes).
 Detección
de
deleciones
e
inserciones grandes causantes de
enfermedades
(ej.
Distrofia
muscular de Duchenne).
 Identificación
de
individuos
mediante VNTR.
 Detección de RFLP.
Transferencia Northern:
Se utiliza para analizar fragmentos de RNA
obtenidos a partir de extracción.
Transferencia Northern:
Transferencia Northern:
Se utilizan sondas de tamaño intermedio. Esta técnica
permite estudiar la expresión génica celular.
Actualmente esta técnica ha caído en
desuso, debido a la utilización de la
reacción en cadena de la polimerasa (PCR).
Comparación entre transferencias
Northern y Southern:
Dot Blot:
Se utiliza para detección de mutaciones puntuales,
principalmente aquellas que no modifican el patrón de
restricción de una secuencia de nucleótidos.
Revelado:
Sondas ASO
Condiciones de hibridación
de elevada astringencia.
Dot Blot:
Dot Blot:
Dot Blot:
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR.
 Es la amplificación enzimática de un fragmento de interés
(DNA) localizado entre dos oligonucleótidos (cebadores).
 Permite generar cantidades ilimitadas de una secuencia de
interés.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR.
94ºC
72ºC
Tm
Primers
Métodos de análisis de ácidos nucleicos: PCR.
Primer Reverse
Primer Forward
Pérdida de eficiencia de PCR: Efecto Pasteur
Factores que llevan a la
pérdida de eficiencia de PCR:
 Disminución de actividad
de la polimerasa.
 Disminución de la
disponibilidad de dNTPs y
cebadores.
 Disminución de la
disponibilidad de Mg2+,
para el funcionamiento de
la enzima.
Clases de PCR.
• PCR-semicuantitativa
• PCR-cuantitativa (PCR-en tiempo
real)
• RT-PCR
• PCR-multiplex.
• PCR-anidada.
• PCR-aleloespecífica.
• PCR-mutagénesis dirigida.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Se lleva a cabo una reacción de amplificación del DNA en
presencia de los cuatro dNTPs y concentraciones mucho
menores de los cuatro análogos ddNTPs, que dan lugar a la
terminación de la síntesis cuando son incorporados.
Resolución de bandas en geles de
poliacrilamida
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación enzimática.
Métodos de análisis de ácidos nucleicos:
Secuenciación automática.