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Propiedades antivirales de las
proteínas y péptidos de la
leche
RAVINDER NAGPAL1, CHAITANYA. S1, MONICA PUNIYA2, AARTI
BHARDWAJ3, SHALINI JAIN4 AND
HARIOM YADAV4*
1Microbiología
láctea, 2Nutrición de ganado de lácteos, 4Bioquímica animal,
Instituto Nacionald e Investigación Láctea, Karnal 132001,
Haryana, Instituto Meerut de Ingeniería y Tecnología, Meerut-250002, U.P., India.
*Email: yadavhariom@gmail.com
Introducción
• Las proteínas y péptidos de la leche poseen
propiedades biológicas más allá de su
significancia nutriológica.
• En 1987, lactoferrina (LF) - Virus asociado a
leucemia (FLV)
• Proteínas y péptidos de la leche modificadas
químicamente.
• Proteínas con actividad
antiviral:
Lactoferrina (LF)
Lactadherina
Glicoproteína
Inmunoglobulina (Ig)
Lactoferrina (LF)
• Hierro multifuncional unido a glicoproteína
• Liberada en el estómago por pepsin cleavage a pH
ácido
• LF - Actividad antiviral para virus DNA y RNA
ACCIÓN DE VIRUS ENVUELTOS POR
LF:
Virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)
Citomegalovirus humano (CMV)
Virus del herpes simplex tipo 1 y 2 (HSV)
Virus de la hepatitis B, C y G
Papilomavirus humano (HPV) y
Alfavirus
- Virus no cubiertos:
Rotavirus
Enterovirus
Poliovirus
Adenovirus y
Calicivirus felinos
Efectos antivirales de las proteínas
Virus
(Cubierto)
Proteína
Comentarios/acción propuesta
HIV
LF
Leche
bLF & hLF bloquea la absorción de HIV-1 por
células objetivos
Inhibe la unión de HIV-1 a receptor en CD4
HSV-1 y 2
LF
bLF y hLF se une a las partículas virales y
efecto sinérgico con acyclovir
HCMV
LF
o Interfiere con virus en células objetivo
o Regulación de células asesinas
o Efecto antiviral sinérgico con cidofovir
HCV
LF
o Une a proteínas de cubierta viral E1 y
E2
o bLF administrado oralmente puede ser
efectivo en combinación con interferón
Alfavirus
LF
hLF inhibe interacción de virus con
receptores sulfato heparan
Hantavirus LF
o Efecto sinérgico con ribavirina sobre la
replicación viral
o bLF administrado oralmente puede ser
efectivo en combinación con interferón
LF
Interfiere con la interiorización del virus
en la células del huésped
HPV
Virus
Proteína
Comentarios/acción
propuesta
Lactoadhesina
Lactoadhesina protege a los
alimentados al seno de la
infección
(No envuelto)
Rotavirus
Glicoproteína
de alto peso
molecular;
leche de vaca
Efectiva in vitro; el modo de
acción no se conoce
Un efecto in vivo; 100 veces
Concentrado más alto que el obtenido con
de Ig
leche humana
PV
LF
Se une a células objetivo
Virus humano
de la influenza
LF
Inhibe la hemoaglutinación
por los virus
FCV
LF
bLF interfiere con la
absorción de virus por las
células objetivo
Adenovirus
LF
bLF y hLF compiten con
virus por receptores
comunes de membrana
Mecanismos antivirales de LF
Mecanismo de acción
• Primero, LF parece interactuar con los
receptores de la superficie celular, tales como
los glicosaminoglicanos los cuales son sitios de
unión para muchos virus.
• Segundo, LF se une directamente a partículas
virales e inhibe la adsorción viral a células
objetivo.
• Efectividad antiviral:
Las diferencias en secuencia de
aminoácidos de región antiviral
Cadenas de Glycan y el número de
puente disulfuro entre hLF y bLF
• HIV, HSV, CMV y adenovirus,
reconocen proteoglicanos de la superficie
celular (heparina y sulfato de heparina)
como receptores.
Entrada de HIV-1 en las
células objetivo
 Mediada por glicoproteina gp-120 y gp-41
 Receptor CD4 y co-receptores CCRS, CXCR4
 Fusión de membranas celulares y virales
Cont…
 Interacción entre el curva V3 y heparan sulfato adhiere
el virus a la superficie celular
 Componentes positivamente cargados (AMD3100 y
ALX40-4C)
bloquean
la
replicación
de
VIH-1,
interactúan con co-receptores cargados negativamente.
Purificación de las proteínas y péptidos de la
leche de vaca
α-S2 Caseína, LFcina-B bovina y k-caseína bovina
Hidrólisis con pepsina
Cromatografía de intercambio de cationes
Fragmentos obtenidos caracterizados por HPLC
y ESI-MS
Cont…
• β-caseína bovina y β lactoglobulina son
modificadas por ácido maleico
(Ikura et al., 1984)
• As2-caseína es modificada con 3-hidroxiftalico
anhídrido
• El grado de modificación checado con ortoftaldialdeído.
(Berkhout et al., 1997)
Métodos para checar
propiedades antivirales
• ELISA
• Ensayo MTT
• Método de radioisótopos
1. ELISA
Adicione proteína de leche(1-10 µM ),antes de
adicionar el virus VIH-1
Supresor T1 del crecimiento de la línea celular en
medio RPMI con 10% FCS a 37 ºC en 5% CO2
Virus sembrado en un pico de producción y
almacenado a - 70 ºc
Cuantificado en antígeno CA-P24 ELISA
2. Ensayo MTT
Línea celular MT2 T infectada con VIH-1 aumentó la concentración de proteínas de la
leche.
Después de 5 días de post-infección
Células vivas convierten el MTT {3-(4,5dimethylethiazole-2-ly)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide)
Producto azul (formazina)
3. Método de radioisótopo
Vaso de cultivo celular (Nunclon de 24 placas)
Inhibidores de proteínas no específicas
Adiciones aupresor de células T1 en un medio
completo (RPMI)
Etiquete radiactivamente con 125 I-bLF e incube
las placas de 4 ºc a 37 ºc por 1 hora
Cantidad de radioactividad recuperada fue
determinada por contador Gamma.
Resistencia a lactoferrina
1. Aislamiento HIV-1 LA1 cultivado en
presencia de 10µM bLF
2. Células libres de virus son pasadas a células
supresoras T1 no infectadas.
3. Observe la formación masiva de sincitio en el
cultivo
4. Muestra del virus es tomada después de
varios días.
Cont…
5. Prueba para infección paralela con y sin LF
6. Células infectadas congeladas a -80 ºc para
análisis subsecuente de DNA
7. PCR amplificada , Gel purificada y clonada en
una vector clonador.
8. Múltiples clones son insertados como
fragmento Bam H1 en el clono moclecular
PLA I
9. Pruebe su capacidad de replicación con y sin
bLF
Proteínas purificadas de la leche y su efecto en la
replicación de VIH-1
Sin actividad antiviral los péptiodos
cargados negativamente
b-caseína 1-28
kcaseína 1-10 y
CMP-A y CMP- B a 10 mM
Inhibición viral completa - proteína de la
leche cargada negativamente modificada
químicamente 3HP-CN
Cont…
 Péptidos cargados positivamente nisina y
lactoferricina
 10 µM - moderadamente inhiben VIH-1
 100 µM - completa inhibición pero se observa
citotoxicidad
 bLF significativamente inhibe a concentración
de 0.1-1.0 µM
 LF humana - proteína nativa y recombinante
moderadamente actúan como inhibidores a
concentración de 3.1 µM
Inhibición de lactoferrina de CXCR4 y CCR5usando virus
 Lactoferrina tiene cargas positivas y negativas
a pH fisiológico
 Eso interfiere con la interacción virus-coreceptor
 Estos VIH-1 usados para infectar línea celular
U87CD4 que fueron transfectadas con
CXCR4/CCR5
Cont…
 bLF es un componente superior anti- VIH-1
comparado con LF humana y LF murina, en
cualquier forma, nativa o recombinante
 bLF es 69% y 64% identica a hLF y mLF
respectivamente
 Plasma bovino y proteínas de la leche están
ampliamente disponibles
 Estas proteínas industriales son producidas a
gran escala, a través de simples modificaciones
químicas
Cont…
 Provee antivirales relativamente baratos para
administración local o sistémica
 Uso sistémico de proteínas de la leche
químicamente modificadas en el humano puede
ocasionar mayor toxicidad y problemas de
inmunogenicidad
 Excepto la suc-HAS & 3HP-LA que muestra
bajo nivel de toxicidad e inmunogenicidad
Propiedades antivirales de otras
proteínas de la leche
 Lactadhesina
Glicoproteina
Inmunoglobulina (Ig)
• Lactoadhesina :
Receptor que se une a virus
Ácido siálico juega un papel importante en
su acción antiviral
Lactoadhesina humana protege a los
lactantes alimentados al seno contra
infección sintomática por rotavirus
• Glicoproteína:
Fracción de alto peso molecular de la
leche de bovinos
Efectiva contra rotavirus humano in
vitro
• Inmunoglobulina láctea:
 Hiperinmunizada con rotavirus humano
durante la gestación de vacas.
100 veces- leche humana
10 veces – IG comercial
Péptidos antivirales
derivados de las
proteínas de la leche
 Lactoferricina
 GMP
 Complejo mucina
Efecto antiviral de péptidos
Virus
Péptido Comentarios/modo de
acción propuesto
HSV-1 y 2
LFcina Un efecto in vitro; más
débil que LF: produce un
efecto sinérgico con
acyclovir
HCMV,
FCV,
Adenovirus
LFcina Un efecto in vitro; más
débil que LF
Virus
(Cubierto)
Péptido
Comentarios
Virus
Epstein–
Barr
GMP
Virus (No
cubierto)
Péptido
Previene cambios
morfológicos en
linfocitos de sangre
periférica
Comentarios
Rotavirus
Complejo
mucina;
leche
humana
Inhibe replicación de
rotavirus in vitro y
previene
gastroenteritis in vivo
Fomento de actividad antiviral
por modificación química
• Modificaciones químicas dan lugar a cambios en
las cargas sobre las proteínas de la leche lo cual
puede fomentar sus propiedades antivirales
(Swart, Harmsen, et al., 1999; Waarts et al., 2005)
• Dos principales formas:
 Acilación para aumentar cargas negativas
 Aminación para aumentar cargas positivas
Cont…
 Succinilación y aconitilación de LF tienen efectos más
fuertes anti- VIH-1 (2-4 veces más activos que la LF
original)
(Swart, Harmsen, et al.,1999)
• Algunas otras proteínas - b-Lg, a-La y HSA, también
han incrementado el efecto contra VIH-1 y VIH-2
(Jiang, Lin, Strick, Li, & Neurath, 1996)
• Cargas negativas adicionales fueron introducidas a
través de modificaciones de residuos de lisina.
Cont…
• b-Lg modificada con ácido 3- hydroxyphthaloyl
(3HP) interfirió con la infección por HIV-1,
HSV-1 y 2, y HCMV
(Berkhout et al., 2002; Swart, Kuipers, et al., 1996)
• También se encontró que 3HP-a-La y 3HP-as2caseína fueron también efectivos contra HIV-1
Cont…
•
3-HP-b-Lg podría ser un agente eficaz para
prevenir transmisión vaginal de infecciones por
el virus herpes virus.
•
Aumento de carga positiva neta sobre LF

Aminación deroga su efecto anti-VIH pero incrementa el efecto
anti-HCMV

Acilación inhibe propiedades anti-HCMV de LF pero es efectiva
contra el virus de la influenza.
Conclusión
• Proteínas de la leche mejoran la salud de
pacientes afectyados por infecciones virales.
• LF bovina mostró considerable acción
inhibitoria contra la mayoría de los virus.
• Resultados de investigación emprendidas a la
fecha, primariamente bajo condiciones in vitro.
• En años recientes, efectos in vivo han sido
reportados en modelos de ratones y ratas.
Cont…
• A corto plazo, para prevención y terapia de
infecciones virales en animales y humanos.
• Beneficios de algunas de las modificaciones
químicas observadas in vitro podrían
explorarse.
• Para aplicaciones específicas en atención en
salud de humanos y animales.