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ANÁLISIS FUNCIONAL DEL OPERÓN virD4 DEL PLÁSMIDO
pUM505 DE Pseudomonas aeruginosa (ARIAL 72)
Eliseo Silva Espino, Facultad de Químico Farmacobiología (UMSNH). enfriafarma@hotmail.com. Asesora Dra. Martha Isela Ramírez Díaz,
Instituto de Investigaciones Químico Biológicas (UMSNH). marthaisela_ramirez@hotmail.com.
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
A
El plásmido conjugativo pUM505 que fue aislado de una cepa clínica
de Pseudomonas aeruginosa de un paciente hospitalizado, posee
una Isla de patogenicidad (PAI) que consiste de 78 genes (Fig. 1) de
los cuales 64 han sido encontrados en las PAIs PAPI-1 y PAPI-2 de P.
aeruginosa PA14 [1], un aislado clínico significativamente más
virulento que la cepa de P. aeruginosa PAO1 [2]. Adicionalmente, la
PAI de pUM505 posee genes homólogos a los genes virB4 y virD4 de
Agrobacterium tumefaciens, que codifican a proteínas que forman
parte de un sistema especializado en la transferencia de genes
oncogénicos a células vegetales, resultando en la formación de
tumores [3]. Los genes virB4 y virD4 no han sido reportados en
genomas de P. aeruginosa, por lo que la presencia de los genes en
pUM505 sugiere que estos puedan participar en la virulencia de P.
aeruginosa. El grado de virulencia puede ser determinado
cuantitativamente con ayuda de modelos patógeno-hospedero, como
el uso del modelo con la amiba Dictyostelium discoideum [2] y el
modelo en hojas de lechuga [4].
B
Figura 1. A) Mapa genético de pUM505. Con flecha o punta de flecha se representan los genes y su
dirección de transcripción. Los colores representan la probable función de las proteínas que codifican
los genes. B) Análisis de secuencia del posible operón con el gen virD4 de pUM505 y PAPI-1. En % se
presenta el grado de identidad, HP corresponde a proteínas hipotéticas.
METODOLOGÍA
RESULTADOS
ENSAYOS DE VIRULENCIA
Control
positivo
.
 Modelo de Dictyostelium discoideum
Pre inocular
bacterias y
esporas
Estandarizar
concentraciones
Sembrar en
medio sólido
SM
Incubar a
22°C de 7-10
días
6° día de incubación
4° día de incubación
Medición de grado
de fagocitosis
diariamente
Figura 2. Virulencia de las cepas de P. aeruginosa PAO1, PAO1-pUM505 y PA14 en modelo de
D. discoideum.
 Modelo de lechuga
Problemas
controles
B
A
Negativo
Positivo
Pre inocular
bacterias
Hacer
diluciones con
MgSO₄
Inocular en
hoja de
lechuga
Incubar a 25 °C
4 días
Medir área de
lesión
Contabilizar
las UFC
Figura 3. A) Virulencia en hojas de lechuga inoculadas con P. aeruginosa (PAO1, PAO1pUM505, PA14) y E. coli (Top10). B) Determinación de las UFC de las células extraídas de la
lesión de la hoja.
AMPLIFICACIÓN Y CLONACIÓN DEL OPERÓN virD4
Figura 4. Amplificación por PCR
del operón virD4. Carriles M,
marcador de 1 kb; 1 y 2 DNA
total de colonia PAO1-pUM505
Subclonación en
vector pUCP20
Amplificar por PCR
CONCLUSIÓN
Digestión con enzimas
de restricción
La cepa de P. aeruginosa PAO1-pUM505 muestra mayor grado de virulencia que la cepa de
PAO1. Esto nos indica que pUM505 contiene genes funcionales involucrados en virulencia.
Clonación en vector
pJET 1.2
Lisis alcalina
P. aeruginosa y E.coli
1.
2.
3.
4.
Ramírez-Díaz y col., 2011. Plasmid 66: 7-18.
Carilla-Latorre y col., 2008. BMC Microbiol. 8:109.
Zechner y col., 2012. Phil. Trans. R. Soc. B. 367: 1073 -1087.
Battle y col., 2008. J. Bacteriol. 190: 7130-7140.
(MÁXIMO CINCO
REFERENCIAS)
Modelos patógeno-hospedero
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a la Dra. Martha Isela Ramírez-Díaz, profesor investigador del IIQB de la UMSNH y al QFB Ernesto Rodríguez Andrade
por las sugerencias que han dado realce al presente trabajo. Este trabajo forma parte del proyecto de investigación 2.35, financiado
por la Coordinación de la Investigación Científica de la UMSNH.