Download estructura del material genetico

GENETICA MOLECULAR 2007
Gen
genmol@gmail.com
(cromatina)
Docentes: Dr. Víctor Romanovski
Dr. Daniel Grasso
Instructores: Dra. Silvina Richard
Dra. Patricia Agostino
Lic. Eugenio Cálcena
Lic. Juan Cruz Casabona
Mol
TEMAS DE LAS CLASES TEORICAS
•Estructura del material genético.
•Replicación del DNA.
•Mutaciones y reparación del daño en el DNA.
1º PARCIAL
•Recombinación.
•Mecanismos de transposición.
•Transcripción.
•Regulación de la expresión génica.
•Traducción.
2º PARCIAL
•Direccionamiento de proteínas.
•Técnicas corrientes en genética molecular.
•DNA recombinante y estudios cromosómicos.
•Organismos transgénicos y terapia génica.
A LO LARGO DEL
CUATRIMESTRE
TRABAJOS PRACTICOS DE LABORATORIO
Gen
Mol
TP 1: Extracción de DNA a partir de muestras de mucosa bucal
Se realizará la técnica de extracción y procesamiento de DNA para su
posterior amplificación utilizando la técnica de PCR (reacción en
cadena de la polimerasa).
Extracción con
cloroformo-isoamílico.
Semi-cuantificación
mediante electroforesis
en geles de agarosa.
TP 2: Caracterización del sexo mediante la amplificación
por PCR del gen de amelogenina.
Gen
Mol
El gen de amelogenina (AMG) codifica para una proteína del esmalte
dental, y se encuentra en ambos cromosomas sexuales. La secuencia
de este gen en el cromosoma Y se diferencia de la del X por una
deleción de aproximadamente 200 pb, por lo que la visualización del
producto de PCR permitirá distinguir las muestras provenientes de
mujeres de aquéllas provenientes de varones.
Amplificación de AMG
por PCR. Resolución
en gel de agarosa 2%
TPs 3 y 4: Detección de RFLPs (Restriction Fragment
Lenght Polymorphisms) mediante la amplificación por
PCR de un fragmento de DNA mitocondrial.
Gen
Mol
A diferencia del DNA nuclear, la herencia del DNA mitocondrial es
exclusivamente materna. Se realizará la amplificación por PCR de una
región del DNA mitocondrial de 312 pb y su posterior digestión
enzimática para poder visualizar el patrón de RFLPs característico de
cada muestra. La visualización de RFLPs se realiza mediante la
técnica de electroforesis en geles de arcrilamida.
Detección de RFLPs. Gel de acrilamida 10%
Gen
118 pb
89 pb
39 pb
35 pb
28 pb
Mol
TP 5: Detección de deleciones en el cromosoma Y
asociadas con infertilidad masculina.
Gen
Mol
Existen grandes regiones en el cromosoma Y asociadas con la
producción de células espermáticas, conocidas como AZF
(azoospermia factor) a, b, d y c (en ese orden de aparición).
Deleciones en algunas de estas regiones se asocian a infertilidad
masculina. A partir de 3 reacciones en multiplex de PCR, se detectará
la presencia o ausencia de fragmentos en 19 loci AZF, los cuales
representan los 4 subintervalos AZF (a-d) previamente mencionados.
FORMA DE EVALUACION
Teoría:
•Dos exámenes parciales y un integrador.
•Se promociona con 7 (siete) o más puntos en los parciales.
Trabajos prácticos:
•80% de asistencia
•Informe de TPs
•Exposición de trabajos
•Examen de TPs
Cronograma (primeras clases)
Fecha
Lun 11/8
Mie 13/8
Estructura del material genético I
Naturaleza del material hereditario. Experiencias de Avery, Griffiths, Hershey & Chase y Messelson & Stahl.
Acido desoxirribonucleico (DNA). Bases, nucleósidos y nucleótidos. Estructuras químicas y estabilidad. DNA
B, A y Z. Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos) y renaturalización. Efecto
hipercrómico. Relación entre la naturaleza de las interacciones no covalentes y la estabilidad del dsDNA. T m
y densidad de flotación en función del % de CG.
Estructura del material genético II
Estabilidad química del DNA (en comparación al RNA). Desnaturalización y renaturalización: termodinámica
y cinética. Cinética de renaturalización y complejidad de genomas. Secuencias repetidas y de copia única.
Estructura y tipos de elementos en genomas procarióticos (“¿un cromosoma?”, megaplásmidos, plásmidos,
episomas). Superenrollamiento. Estructura de los cromosomas eucarióticos. Histonas, nucleosomas. Grados
de compactación: heterocromatina y eucromatina. Bandas en los cromosomas. Centrómeros.
Empaquetamiento del DNA y accesibilidad
Lun 18/8
FERIADO
Mie 20/3
Replicación del DNA I: Replicación semiconservativa (experimento de Meselson y Stahl). Mecanismo
general de replicación: Orígenes de replicación. Esquemas de replicación de DNAs circulares:  (theta) y
círculo rodante (RC, rolling circle). Enzimas involucradas en procariotas y eucariotas. DNA polimerasas,
helicasas. Exonucleasas. Topoisomerasas. Telomerasas.
TP Nº1A: Extracción de DNA
Extracción de DNA a partir de muestras de mucosa bucal de los alumnos
Replicación del DNA II: Discusión del paper:
Identification of an Origin of Bidirectional DNA Replication in Mammalian Chromosomes. W:C:
Burhans, L.T. Vassiliev, M.S. Caddle, N.H. Heintz and M.L. DePamphilis; Cell 62, 955-965 (1990)
TP Nº1B: Extracción (2º parte) y cuantificación de DNA
Replicación del DNA III: Control de la replicación. Ciclo celular. Sistemas de partición de genomas.
Estrategias de conservación de plásmidos (ejemplo de killer-antidote: ccdB-ccdA).
Telomerasa (estructura y función). Replicación de cromosomas lineales.
Replicación del DNA IV: Discusión de los papers
Control of telomere length by the human telomeric protein TRF-1. B. van Steensel and T. de Lange;
Nature 385, 740-743 (1997).
Regulation of telomere length and function by a Myb-domain protein in fission yeast. J. Promisel
Cooper, E.R. Nimmo, R.C. Allshire and T.R. Cech; Nature 385, 744-747 (1997).
Es conveniente leer también el comentario sobre estos dos artículos en la sección News and Views de la
misma revista: Telomeres: Different means to common ends; D. Shore; Nature 385, 676-677 (1997).
Ver sistemas de expresión inducibles por tetraciclina en www.clontech.com (Tet-on & Tet-off).
Mutaciones y reparación del daño en el DNA: Tipos de mutaciones. Cambios numéricos y estructurales
1
2
3
5
4
7
Tema
Lun 25/8
Mierc 27/8
Lun 1/9
Mie 3/9
Lun 8/9
6
Mie 10/9
Gen
Mol
Clase de hoy:
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
RESUMEN DE LA CLASE
Introducción sobre los siguientes temas:
Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos.
Bases, nucleósidos y nucleótidos.
Estructura química y estabilidad. DNA A, B y Z.
Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes caotrópicos)
Efecto hipercrómico.
Tm y densidad de flotación.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Un poco de historia…
1869
Friedrich Miescher
1881
Albrecht Kossel
1905-1939
Estudia células blancas presentes en pus de vendas
de heridas abiertas.
• Obtiene un precipitado de núcleos, del que aisla
una sustancia rica en fósforo que llamó nucleína
• Esta sustancia se aisla de distintos tipos de células
• Está compuesta por H, N, C y O
• La nucleína contiene proteínas y porciones no
proteicas (ácidos nucleicos).
• Los ácidos nucleicos se pueden descomponer en
azúcares y compuestos ricos en nitrógeno (purinas
y pirimidinas).
•Diferencias entre RNA y DNA
•Estructura de los nucleótidos
•Enlaces entre nucleótidos
Phoebus Levene
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Las primeras evidencias
1928: Frederick Griffith
Infección con dos cepas de
Streptococcus peumoniae
Lisas (S): virulentas
(S)
(R)
Rugosas (R): inofensivas
(S) inactivada
(R) + (S) inactivada
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
El experimento de Avery O., McLeod C. y McCarty M.
(1944) fue la primer evidencia directa de que el DNA
es la base de la información genética
Extract from heated smooth (S) bacteria
Extract from heated smooth (S) bacteria
treatment with DNAase (digests DNA)
treatment with protease (digests proteins)
mix with rough (R) bacteria and injected into mice
mix with rough (R) bacteria and injected into mice
mice lived
mice died
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Alfred Hershey y Martha Chase (1952)
Determinaron que el DNA
es el material genético
en el bacteriófago T2
32P
experiment
35S
experiment
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
La naturaleza química de los ácidos nucleicos
Cuando se realiza la hidrólisis
completa de los ácidos nucleicos,
se obtienen tres tipos de
componentes principales:
•Azúcar: una pentosa.
•Ácido fosfórico
•Bases nitrogenadas:
purinas y pirimidinas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Nomenclatura
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Bases inusuales
Además de las bases nitrogenadas anteriormente descritas, se han encontrado
otras bases nitrogenadas en algunos virus o formando parte de algunos tipos
especiales de RNAs.
Ejemplos de algunas de estas bases púricas poco corrientes son:
•Hipoxantina,
•Xantina,
•2-metiladenina,
•7-metilguanina
•6-metil-aminopurina.
Ejemplos de bases pirimidínicas:
•5-metilcitosina (propia del DNA)
•5-hidroximetil citosina (HMC): sustituye a la citosina en los fagos T-pares.
En los RNA de transferencia (tRNA) se encuentran
•Ribotimidina,
•Dihidrouridina,
•Seudouridina
•Inosina (I).
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
La estructura del DNA
REGLAS DE CHARGAFF
Para el DNA doble cadena (dsDNA)
•La composición de bases varía de una especie a otra.
•La composición de bases es la misma en distintos tejidos de una misma
especie.
•La proporción de Adenina (A) es igual a la de Timina (T). %A = %T.
•La proporción de Guanina (G) es igual a la de Citosina (C). %G= %C.
•La proporción de bases púricas (A+G) es igual a la de las bases pirimidínicas
(T+C). (A+G) = (T + C).
•La proporción entre (A+T) y (G+C) es característica de cada organismo,
pudiendo tomar por tanto, diferentes valores según la especie estudiada.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
% de bases en
distintos
organismos
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
La estructura del DNA
PATRON DE DIFRACCION DE RAYOS X
•Patrón helicoidal del DNA.
•Dos periodicidades a los largo del eje, una primaria de 3,4 A y una
secundaria de 34 A.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Estructura del DNA: la doble hélice
• El esqueleto hidrofìlico de grupos fosfato y deoxiribosa
alternantes está expuesto al agua del ambiente
• El anillo de furanosa está en la
conformación C-2´endo
• Las bases están apiladas en el interior de la doble hélice,
con sus planos perpendiculares al eje de la doble hélice
• El apareamiento de las dos cadenas genera un surco mayor y un surco menor en la
superficie de la doble hélice
G
C
A
T
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
La estructura del DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Fuerzas que estabilizan la doble hélice
• Enlaces de hidrógeno (pequeña contribuión)
• Apilamiento de bases e interacción hidrofóbica
• Interacciones iónicas:
- Repulsión entre las cargas negativas de los fosfatos
- Los cationes actúan como contraiones estabilizando el DNA (divalentes
más eficientes que monovalentes; el Mg+2 estabiliza la estructura del RNA)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Comparación de las formas A, B y Z del DNA
La forma B es la más estable en condiciones fisiológicas
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Horquillas
Estructuras inusuales
Palíndromos
Repeticiones en espejo (mirror repeats)
Cruciformes
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Estructuras inusuales: triplex DNAs
Apareamiento tipo Hoogsteen: Bajo ciertas condiciones, los nucleótidos pueden formar
puentes de hidrógeno adicionales dando lugar a tramos de DNA de triple hélice.
H-DNA: "In vitro" es posible obtener tramos de triple hélice intercalando oligonucleótidos
cortos constituidos solamente por pirimidinas (timinas y citosinas) en el surco mayor de una
doble hélice. No se sabe la función biológica del ADN-H aunque se ha detectado en
cromosomas eucarióticos.
Apareamiento tipo Hoogsteen
Estables a pH bajos (citocina protonada, C+)
H-DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Estructuras inusuales: cuadruplex DNA
DNA cuadruplexo: "In vitro" se han obtenido cuartetos de guanina (DNA cuadruplexo) unidas
mediante enlaces tipo Hoogsteen, empleando polinucleótidos que solamente contienen
Guanina (G). Los extremos de los cromosomas eucariotas (telómeros) tienen una estructura
especial con un extremo 3' OH de cadena sencilla (monocatenario) en el que se repite muchas
veces en tandem una secuencia rica en guaninas. Se piensa que el DNA cuadruplexo telomérico
serviría para proteger los extremos cromosómicos de la degradación enzimática.
Ejemplo de secuencia telomérica rica en guaninas (G):
5´P TTGGGTTGGGGTTGGGG...............TTGGGG 3'OH
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Densidad de los ácidos nucleicos
Existe una relación lineal entre el contenido en G+C y la densidad del DNA determinada en un
gradiente de densidad. A mayor contenido en G+C, mayor densidad.
DNA
Densidad (g/cm3)
% (G+C)
Polímero A-T
1.675
0
Diplococcus pneumoniae
1.700
42
Escherichia coli
1.710
51
Serratia marcescens
1.716
55
Mycobacterium phlei
1.732
73
Basándose en múltiples estudios de la densidad de los DNAs de diferentes organismos y de su
composición en bases nitrogenadas, se ha establecido una fórmula empírica que relaciona la
densidad de flotación () con el contenido en G+C expresado en %:
 = 1,660 + 0,00098(G+C)
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Desnaturalización del DNA
Condiciones que favorecen la desnaturalización
•Alta temperatura
•Baja fuerza iónica (repulsión de fosfatos)
•Alto pH (desprotonación de bases)
Monitoreo de la desnaturalización
•Los enlaces conjugados de las bases generan absorción en el UV a 260nm
Nucleótidos libres> ssADN> dsADN
•La temperatura a la cual la A260 alcanza la mitad de su valor máximo
es denominada Tm (temperatura de melting)
•La Tm depende de la concentración salina, pH, composición, longitud
•Oligonucleótidos cortos: Tm (oC) = (A+T)x2 + (C+G)x4
Cálculo de Tm
•Oligonucleótidos largos:
Tm = 81.5 +16.6Log [Na+] + 0.41 (%CG) – (625/N)
(N=longitud del oligo)
DESNATURALIZACION POR CALOR
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Parámetros que intervienenen en la desnaturalización del DNA
Parámetro
Composición de
bases
Efecto sobre Tm
Efecto sobre la velocidad de
renaturalización
Incremento de Tm con el
aumento del %G-C
No ejerce efecto
<150 bp; incremento de
Tm con el incremento de
longitud; >500 bp no hay
efecto
Incrementa la velocidad con la longitud
Fuerza iónica
Incremento de Tm con el
aumento de [Na+]
Optimo a 1.5 M Na+
%bp mismatch
Disminuye Tm con el
aumento de %mismatch
Disminuye la velocidad con el aumento de
%mismatch
Concentración
No ejerce efecto
Aumenta la velocidad con el aumento de [DNA]
disminuye Tm con el
aumento de
[formamide], [urea]
Optimo a 50% formamide
Longitud
Agentes
denaturalizantes
Temperatura
-
Optima a 20°C por debajo de Tm
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Efecto hipercrómico
The purine and pyrimidine bases in DNA absorb UV light maximally at a wavelength of approximately 260
nm. In double-stranded DNA, however, the absorption is decreased due to base-stacking interactions. When
DNA is denatured, these interactions are disrupted and an increase in absorbance is seen. This change is
called the hyperchromic effect. The extent of the effect can be monitored as a function of temperature
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Renaturalización
• La desnaturalización es un proceso reversible
• Reanealling: reasociación de las cadenas de DNA
Algunos usos experimentales
de la hibridación de ácidos
nucleicos:
•PCR
•Southern blot
•Northern blot
•in situ hybridization
•D-loop or R-loop mapping
•Cot curves
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Cinética de renaturalización:
curvas “Cot”
COMPLEJIDAD GENOMICA
AAAAAAAAAAAAAAAA
C= 1; L=16
ATATATATATATATATA
C= 2; L=16
ATCATCATCATCATCA
C= 3; L=16
ATCGCTAGAACGTCTG C= 16; L=16
C=DNA simple cadena
Co=DNA total
The Y-axis is the percent of the DNA that remains single stranded. The X-axis is a log-scale of the
product of the initial concentration of DNA (in moles/liter) multiplied by length of time the reaction
proceeded (in seconds). Reannealing occurs slowing but gradually over a period of time.
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Definición de Cot1/2: función inversa de la constante de velocidad (k)
c
1

c0 1  kC0t
1
1

2 1  kC0t
1
(1  kC0t )  1 (1  kC0t )  2
2
kC0t  2  1  1
C0t1/ 2
1

k
C0t ½ : valor de Cot
cuando se reasoció un 50%
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Las curvas Cot permiten estudiar la
complejidad de los genomas.
The shape of a "Cot" curve for a given species is a function of two factors:
• the size or complexity of the genome
• the amount of repetitive DNA within the genome
If no repeated sequences: C = to genome size (nt-bp)
N (genome size) is determined directly from C0t1/2
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Reasociación para eucariotas
≈ 20-25% altamente repetitivo: 2x106 copias
≈ 25-30% Moderadamente
Repetitivo
350 copias
≈ 45-55%
Copia única
La reasociación de DNA no repetido
se produce en un rango de 2 log
> 2 logs: diferentes poblaciones
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Curvas Cot en procariotas y eucariotas.
En procariotas: a) determinan un único componente
b) el valor de Cot1/2 estima la longitud del
genoma
En eucariotas: a) determinan varios componentes y permiten
calcular la proporción del genoma ocupada por
cada uno de ellos
b) el valor de Cot1/2 de cada componente
estima su complejidad cinética
Species
Bacteria
Sequence Distribution
99.7% Single Copy
Mouse
60% Single Copy
25% Middle Repetitive
10% Highly Repetitive
Human
70% Single Copy
13% Middle Repetitive
8% Highly Repetitive
Cotton
61% Single Copy
27% Middle Repetitive
8% Highly Repetitive
Corn
30% Single Copy
40% Middle Repetitive
20% Highly Repetitive
Wheat
10% Single Copy
83% Middle Repetitive
4% Highly Repetitive
Los componentes del genoma eucariótico se clasifican en función del grado de
repetición de las secuencias que los constituyen: componente único o no repetido
formado por secuencias con valor Cot1/2 >102, componente moderadamente
repetido formado por secuencias con valor Cot1/2 comprendido entre 10-2 y 102 y
componente altamente repetido formado por secuencias con valor Cot1/2 < 10-2
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
Estructura del RNA
El RNA es químicamente más reactivo que el DNA
ESTRUCTURA DEL MATERIAL GENETICO
DNA
Transcripción
BASES
NITROGENADAS
APAREAMIENTO
DE BASES
AZUCAR
BASES
NITROGENADAS
RNA
Acido ribonucleico
DNA
BASES
NITROGENADAS
Acido desoxirribonucleico
RNA
TRANSCRIPCION
Tipos principales de RNA que fabrican las células
Las células
producen varios
tipos de RNA
Tipo de RNA
Función
mRNA
RNA mensajeros, codifican proteínas
rRNA
RNA
ribosómicos,
forman
la
estructura básica de los ribosomas y
catalizan la síntesis de proteínas
tRNA
RNA de transferencia, cruciales en la
síntesis
de
proteínas
como
adaptadores entre el mRNA y los
aminoácidos
snRNA
RNA pequeños nucleares, participan
en
varios
procesos
nucleares,
incluyendo la maduración del premRNA
snoRNA
RNA pequeños nucleolares participan
en el procesamiento y modificación
química de los rRNA
Otros RNA
Participan
en
diversos
tipos
celulares, como la síntesis de los
telómeros,
la inactivación
del
cromosoma X y el transporte de
proteínas
TRANSFERENCIA DE LA INFORMACION GENETICA
DNA
Transcripción
PROCARIOTAS
RNA
Traducción
Proteínas
EUCARIOTAS
En resumen…
Primeras evidencias sobre los ácidos nucleicos.
Naturaleza química de los ácidos nucleicos.
Bases, nucleósidos y nucleótidos.
Estructura química y estabilidad del DNA.
Densidad.
Desnaturalización (térmica, por solventes y agentes
caotrópicos)
Efecto hipercrómico.
Curvas Cot de renaturalización.
Estructura y tipos de RNA.
Bibliografía recomendada
•Biología Molecular de la célula. Alberts B., Johnson A., Lewis
J., Raff M., Roberts K., Walter P. (2002). 4º edición, Garland
Publishing, Inc.
•Biología Celular y Molecular. Lodish H, Baltimore D., Berk A.,
Zipursky S.L., Matsudaira P., Darnel, J. (2002). 4º edición, editorial
Médica Panamericana SA, España (5º edición en inglés).
•Gene VIII. Lewin, B. (2004). Ed. Prentice Hall.
(y ediciones anteriores)
•Lehninger. Biochemistry, Lehninger A.L., Nelson D.L., Cox M.M.
(2005), 4º edición.
(en castellano: 3º edición, 2001, editorial Omega, España)
•Molecular Biology. Weaver, R. (2004). 4º edición, Editorial
McGraw-Hill.
Información actualizada y sitios de interés
www. pubmed.com
www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=Books
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