Download Diapositiva 1 - quimicabiologicaunsl

"Bioquímica del estrés
oxidativo en Vegetales"
Curso Optativo para
Lic. en Bioquímica
Lic. en Biología Molecular
• TEMA 1 ESPECIES REACTIVAS DEL OXIGENO
• TEMA 2: ENZIMAS ANTIOXIDANTES
• TEMA 3:SUSTANCIAS ANTIOXIDANTES
En la naturaleza todo es oxidado por el oxígeno.
La principal fuente de origen de los radicales libres es la
respiración, ya que entre un 1 a 3% del oxígeno consumido se
transforma en radicales libres.
FORMAS QUIMICAS DE LAS ESPECIES REACTIVAS
DEL OXIGENO
O2.RADICAL LIBRE
HO.
ESPECIES REACTIVAS DEL
OXIGENO (EROS)
eDesapareado
O 2-
Reducciones
parciales
NO RADICAL
H2O2
O2
X
eDesapareado
PROPIEDADES GENERALES DE LAS
EROS
HO.
Radical
hidroxilo
O2.Radical
superóxido
ALTAMENTE REACTIVO
10-3 ms
Es la especie más fuertemente oxidante
Afecta al ADN, proteínas, lípidos. Sustrae
protones; Se une a dobles enlaces (por ej. Ac.
Grasos insaturados)
ACTUA COMO OXIDANTE O REDUCTOR
DISMUTA A H2O2
No puede atravesar las membranas
Reduce metales de transición
2-4 ms
O2
-
Transfiere su En de excitación a otras
moléculas o
Forma endoperóxidos ó hidroperóxidos
4 ms en agua
100 ms
Oxígeno
singulete
H2O2
Peróxido de
hidrógeno
ES MODERADAMENTE REACTIVO
En presencia de metales forma el
radical hidroxilo
Oxida grupos tioles de proteínas
1 ms
La alta inestabilidad electrónica de las EAO
les hace colisionar con las biomoléculas, les
sustraen un electrón y las oxidan.
Esto provoca un cambio estructural en la
molécula que la lleva a perder la función
biológica específica que desempeñaba en la
célula.
GENERACIÓN DE RADICAL SUPERÓXIDO (O2.-)
ORIGEN
No enzimático
Metales de transición
Tioles, quinonas, flavinas
Hemo-, mioglobina
Enzimático
Xantina y aldehído oxidasa
Citocromo P-450
NADPH oxidasa
GENERACIÓN DE PERÓXIDO DE HIDRÓGENO
(H2O2)
Origen:
a) Dismutación del superóxido
(espontánea o catalizada por SOD)
2 O2.- + 2 H+
H2O2 + O2
b) Reducción enzimática de O2
O2 + 2 e- + 2 H+
H2O2
GENERACIÓN DE RADICAL HIDROXILO (HO.)
- Reacción de Haber-Weiss
O2.- + H2O2
HO. + HO- + O2
- Reacción de Fenton
Fe2+ + H2O2
Fe3+ + HO. + HO-
Fe3+ + O2.-
Fe2+ + O2
O2
SITIOS DE PRODUCCION DE EROS EN
PLANTAS
 Cloroplastos: A nivel de los fotosistemas I (PSI) y II (PSII)
 Mitocondria: Durante el transporte electrónico
 Microsomas: Complejo citocromo P-450
 Peroxisomas: Oxidación de glicolato en el carbono 2. Oxidación de ácidos
grasos(Flavoproteína-AcilCoA Oxidasa)
 Glioxisomas: oxidación de ácidos grasos. (Flavoproteína-AcilCoA
Oxidasa)
 Membrana: Peroxidación de lípidos y acción de la NADPH oxidasa.
 Pared celular: peroxidasas y oxidasas
 Apoplasto: aminooxidasas participan en la formación de H2O2
 Espacio extracelular: Oxalato oxidasa (H2O2 + CO2)
¿Dónde se producen las EAO?
Sitios de producción de EAO en el sistema de transporte
electrónico del cloroplasto
Sitios de formación de Superóxido en el sistema de
transporte electrónico mitocondrial
Oxidasa alternativa
RETICULO ENDOPLASMICO (Microsomas)
• OXIGENASAS DE FUNCION MIXTA
• NADPH agente reductor
RH + NADPH + H+ + O2
• RH-P450
• R•-P450 + O2
ROH + NADP+ + H2O
R•-P450
P450-RHOO ó P450-ROO•
• P450-ROO•
O2- + RH-P450
• P450-ROO•
P450 + RHOO
DIAMINOOXIDASAS (ROS)
PARED CELULAR
•
•
•
•
NAD/NADP-OXIDASAS (H2O2)
Reacciones dependientes de H2O2
Defensa contra patógenos
Degradación de xenobióticos
Síntesis de lignina
Aminas biógenas
MEMBRANA
NH3 + H2O2 + Aldehídos
NADPH oxidasa
(NOX)
Glioxisomas y peroxisomas
• Los glioxisomas son organelas con una membrana simple
que compartimentalizan enzimas involucradas en la oxidación de ácidos grasos y en el ciclo del ácido
glioxílico.
• En los peroxisomas se encuentran catalasas, peroxidasas,
xantina oxidasa y glicolato oxidasa.
• La glicolato oxidasa produce H2O2 en dos transferencias
de electrones desde el glicolato al oxígeno.
• Xantino oxidasa, urato oxidasa y las NADH oxidasas
generan superóxido como una consecuencia de la
oxidación de sus sustratos.
PRODUCCION DE EROS
• FACTORES ABIOTICOS
Sequía
Altas temperaturas
FACTORES AMBIENTALES
Fuentes de Radiacion
Concentración salina
Condiciones pH extremas
• FACTORES BIOTICOS
Insectos
PATOGENOS
Virus
Bacterias
FUENTES
EXOGENAS
PRODUCCIÓN
DE ROS
FUENTES
ENDOGENAS
BIOTICOS O
ABIOTICOS
METABOLISMO
CELULAR
ESTRÉS OXIDATIVO
EROS
MECANISMOS DE DEFENSA
ENZIMATICOS
• Ascorbato peroxidasa
• Superóxido dismutasa
• Glutatión peroxidasa
• Catalasa
PEROXIDO DE
HIDROGENO
PEROXIDOS
RADICAL
SUPEROXIDO
PEROXIDOS
Ascorbato peroxidasa
EC 1.6.5.4
H2O2
Sustratos
ACIDO ASCORBICO
H2O2 + AsA
H2O + MDHA
MDHA
AsA + DHA
AC. ASCORBICO
DHA reductasa
GSSG
2 GSH
ISOENZIMAS DE APX
•
•
•
•
•
•
Estroma (sAPX)
Tilacoides (tAPX)
Microcuerpos
(mAPX)
Citosol (cAPX)
Mitocondria
(mitAPX)
Cloroplastos
(chlAPX)
TIENEN ALTA ESPECIFICIDAD
POR EL ACIDO ASCORBICO
(-) Cianuro, azida, reactivo con grupos
tioles (p-cloromercuribenzoato)
(-) inhibidores suicidas: hidroxilamina,
p-aminofenol e hidroxiurea.
Son sensibles al estrés fotooxidativo
Regulación de actividad, síntesis y post-transcripcional
Superóxido dismutasa
• Son metaloenzimas que eliminan los
radicales superóxidos (O2.-)
SUSTRATO
2 O2.- + 2 H+
RADICAL SUPEROXIDO
O2 + H2O2
Enz-Cu+2 + O2.-
Enz-Cu+1 + O2
Enz-Cu+1
Enz-Cu+2
+ O2.- + H3O+
+ H2O2
ISOENZIMAS DE LA SOD
• Isoenzima I: FeSOD
Cloroplastos
( - ) H 2O2
homodímero /tetrámero
• Isoenzima II: MnSOD
Mitocondrias y
peroxisomas
homodímero /tetrámero
• Isoenzima III: Cu-Zn SOD Cloroplastos, citosol y
espacio extracelular.
homodímero /tetrámero
Los genes SOD se regulan diferencialmente a través del desarrollo y
en respuesta a varias condiciones de estrés.
Catalasa
•
•
•
•
Es una hemoproteína
Tetrámero con cuatro subunidades idénticas
Se encuentran en peroxisomas y glioxisomas.
No requieren de un sustrato reductor
2 H 2 O2
H2O2
+ Fe (III)-E
H2O2
+ O=Fe(IV)-E
2 H2O + O2
H2O + O=Fe(IV)-E
H2O + O2 +
Fe (III)-E
PAPEL BIFUNCIONAL DE LA CATALASA
• Elimina el peróxido de hidrógeno
Reacción de
dismutación
• Forma peróxidos a partir de una molécula
orgánica
Reacción de
Peroxidación
CLASIFICACION
• Subgrupo I: Catalasa verdadera ó típica.
• Subgrupo II: Catalasa-peroxidasa
(eucariotas de hongos)
• Subgrupo III: Catalasa atípica.
(no hemínica, Mn)
REGULACION DE LA ACTIVIDAD DE CATALASA
• El Acido salicílico o sustancias similares
regulan la actividad de catalasa
Tejidos sanos
Tejidos cercanos a
celulas necróticas
[H2O2]
[H2O2]
En tabaco el óxido nítrico inhibe la enzima
AS
AS
CATALASA
Donor de e-
FUNCION DE LA CATALASA EN EL
ESTRÉS
Nicotiana plumbaginifolia
(C3)
gen Cat1
Sistema fotorespiratorio
gen Cat2
Estrés oxidativo
gen Cat3
-oxidación de los ácidos grasos
en los glioxisomas
Plantas de tabaco
Exposición
luz
lesiones necróticas
CATALASA
en las hojas.
GLUTATION REDUCTASA
G-S-S-G + NADPH + H+
Glutatión
Oxidado
2 GSH + NADP+
Glutatión
reducido
FLAVOPROTEÍNA
HOMODIMÉRICA
ISOENZIMAS DE GLUTATION
REDUCTASA
CLOROPLASTOS
CITOSOL
PRODUCTO DE DIFERENTES GENES
MITOCONDRIA
Secuencias
Regulación
Respuestas a señales ambientales diferentes.
Glutatión peroxidasa
2 GSH + R-OOH
GSSG + H2O + ROH
 No es una enzima constitutiva.
 Inducida en respuesta al estrés.
 Es mas importante en la remoción de peróxidos
de lípidos y alquilos.
MECANISMOS DE DEFENSA NO
ENZIMATICOS
• ACIDO ASCORBICO
• GLUTATION
• TOCOFEROL
• CAROTENOIDES
• FITOQUELATINAS
• POLIAMINAS
• FLAVONOIDES
Propiedades del Acido ascórbico
• Antioxidante (citoplasma, cloroplastos, vacuolas)
• Muy reactivo (recolector de radicales libres: O2.-, H2O2).
• Estabiliza el radical hidroxilo
• Evita la peroxidación lipídica
• Regenera la vitamina E
• Importante para el crecimiento, diferenciación celular y
el metabolismo.
• FUENTES DE ACIDO ASCORBICO: Grosella, pimiento
verde, kiwi, limón, coliflor, naranja, tomate y melón
BIOSINTESIS DE ACIDO ASCORBICO
(CITOSOL)
D-GLUCOSA
D-MANOSA
L.GALACTOSA
D-GALACTOSA
L-GALACTO-1,4-LACTONA
L-galacto-1,4 deshidrogenasa
(EC 1.3.2.3.)
Membrana Interna
Mitocondrial
ACIDO ASCORBICO
•Transportador específico (Km AA 90 uM y Km DHA = 20 uM)
Determinación VIT C (Acido Ascórbico)
1)Por la oxidación de acido ascórbico con el reactivo 2,6diclorofenol indofenol
2) Acido ascórbico: Formación del complejo entre Fe2+ y
bipiridil después de una reducción de Fe3+; l 525 nm.
Acido Ascórbico total: Reducción de ascorbato oxidado,
l 500 nm
ACIDO ASCORBICO
Superóxido
Peróxido de hidrógeno
Reductasa
Radical tocoferilo
MONODEHIDROASCORBATO
GSSG
Reductasa
DEHIDROASCORBATO
Tartrato + oxalato
2GSH
GLUTATION
GLUTATION REDUCIDO
+
NH3
O
O
‫ו‬
‫װ‬
‫װ‬
-OOC-CH-CH2-CH2-C-NH-CH-C-NH-CH2-COO
‫ו‬
CH2
‫ו‬
Glicina
g-Glutamato
SH
Cisteína
GLUTATION Oxidado
Glu-Cys-Gli
│
Glu-Cys-Gli
EL GLUTATION ES EL MAYOR
RESERVORIO DE AZUFRE NO PROTEICO
PROPIEDADES DEL GLUTATION
• Protege las proteínas de la oxidación del grupo tiol.
• Detoxificador por conjugación con algunos
herbicidas.
• Está presente en la mayoría de los células y
compartimentos subcelulares. Mayor nivel en
cloroplastos.
• Reduce el DHA a ascorbato.
• Es recolector de radicales libres.
• Estabiliza las membranas (remueve peróxidos).
TOCOFEROL (Vit E)
• Hidrofóbico (unido a membranas)
• Posee un anillo benzoquinona y una cadena fitilo
• Secuestrante de O2 y peróxidos
• Evita la propagación de las reacciones de
peroxidación
Maíz tolerante al frío: >> tocoferoles y glutatión.
• El Ascorbato regenera tocoferol
MODO DE ACCION DEL a-TOCOFEROL
CAROTENOIDES
• Flia. de Isoprenoides y tetraterpenos (Carotenos y
Xantófilas)
• Unidos a membranas (Oxígeno singulete)
• Cloroplastos (ROS)
• Plastidios (tejidos fotosin. y no fotosintéticos)
• Clorofila Triplete: Caroteno evita formación ´O2
singulete
• Zeaxantina Disipa la energía de la clorofila excitada
En término de sus propiedades antioxidantes, los
carotenoides, pueden proteger los fotosistemas por 4 vías:
- Por reacción con productos de lipoperoxidación al
terminar las reacciones en cadena.
- Por el reclutamiento de oxígeno singulete y disipación de
la energía como calor.
- Por reacción con moléculas de clorofila triplete o excitadas
para prevenir la formación de oxígeno singulete.
- Por la disipación de exceso de energía de excitación a
través del ciclo de las xantofilas.
POLIAMINAS
• Son pequeñas aminas alifáticas y se clasifican como
diaminas y poliaminas propiamente dichas.
• Son moléculas básicas cargadas positivamente al pH
fisiológico.
• Se unen a moléculas con cargas negativas, como por
ejemplo ácidos nucleicos, fosfolípidos y varias proteínas.
• Las poliaminas aparecen en las plantas de manera libre o
conjugada a pequeñas moléculas.
• Están implicadas en la regulación de la senescencia y
morfogénesis y quizás su principal función es responder a
diferentes estreses en plantas.
• La oxidación de las diaminas o poliaminas por las diaminoy poliaminoxidasas respectivamente, producen altos
niveles de H2O2 que causan la muerte de la célula vegetal,
o crean un halo que limita la entrada del hongo o virus y
por otro lado ataca directamente al virus u hongo.