Download nota cientifica - WWW CIM-UH

Rev. Invest. Mar. 29(1):73-77, 2008
NOTA CIENTIFICA
CARACTERIZACIÓN MORFOLÓGICA, FUNCIONAL
Y BIOQUÍMICA DEL ESFÍNTER MARGINAL DE LA ANÉMONA
DE MAR Phymactis clematis (CNIDARIA)
L. Patronelli
1
*, E. González Olivera 2, M. Zamponi
3
y M. Crupkin
4
(1) Lab. Fisiología Animal, Dpto. Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata, Funes
3250– B760 2AYJ – Mar del Plata, Argentina.
(2) Lab. Fisiología Animal, Dpto. Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad Nacional de Mar del Plata, Funes
3250– B760 2AYJ – Mar del Plata, Argentina
(3) Laboratorio de Biología de Cnidarios, Dpto. Ciencias Marinas, CONICET, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales, Universidad
Nacional de Mar del Plata, Funes 3250– B760 2AYJ – Mar del Plata, Argentina.
(4) Centro de Investigaciones de Tecnología Pesquera (CITEP) y Universidad Nacional de Mar del Plata, Argentina
(*) Autor correspondiente: Email: dlpatron@mdp.edu.ar
RESUMEN
La anémona de mar Phymactis clematis posee un esfínter circunscripto de tipo palmado cuya longitud oscila entre
1,06 a 1,67 mm y un ancho entre 0,76 a 1,21 mm. Dicho músculo está constituido por un eje mesogleal y
numerosos subejes mesogleales; tanto el eje como los subejes dan sostén al endodermo constitutivo del músculo
cuyo borde es liso. Para evaluar la fuerza contráctil se estimuló el esfínter con concentraciones crecientes de KCl en
agua de mar en un rango de 20 a 200 mM. Los resultados fueron representados por curvas dosis-respuesta
obteniéndose una curva sigmoidea donde la máxima fuerza desarrollada fue de 2,68 ± 0,20 g, con 200 mM de KCl.
Se purificaron las proteínas contráctiles a partir de un homogenato en alta fuerza iónica. Luego de centrifugaciones
el precipitado obtenido fue resuspendido y una alícuota fue corrida por SDS-PAGE 10%. El análisis de los geles
mostró las bandas características de la cadena pesada de miosina, actina, miosinas livianas y una de PM de 105
kDa, la que probablemente corresponda a paramiosina, proteína característica de los invertebrados. La
caracterización del esfínter marginal nos permitirá comparar este músculo en distintas situaciones de stress y en
diferentes condiciones ambientales y observar las adaptaciones morfológicas, funcionales y bioquímicas que
presenta frente a estas variables.
Palabras clave: morfología; esfínter marginal; anémonas; Phymactis clematis, ASW, Cuba.
ABSTRACT
The sea anemone Phymactis clematis has a circumscript sphincter of palmate type which is between 1,06 to 1,67
mm long and between 0,76 to 1,21 mm wide. This muscle is contituted by a mesogloeal axis and several
mesogloeales subaxis. Both axis and subaxis give a support to the endoderm which border is smooth. To evaluate
contractil force it was stimulated at increasing KCl concentrations ranging from 20 to 200 mM. The results were
analyzed in the form of dose-response curves. Contractility increases in a sigmoid form been the maximal
development 2,68 ± 0,20 g with 200 mM KCl. Biochemical study was carried out from homogenate of high ionic
force to purified contractil proteins. SDS- PAGE of actomyosin was performed in 10% gels and shows the
characteristic polypeptidic band of myosin heavy chain, actin, myosin light chains and one of them of 105 kDa
molecular weigh which belongs to paramyosin. This protein is characteristic of invertebrates. The characterization
of marginal sphincter will allow us to compare this muscle in different stress and environmental conditions and
observe morphological, functional and bichemical adaptations to these variables.
Key words: morphology; marginal sphincter; anemones; Phymactis clematis, ASW, Cuba.
La anémona de mar Phymactis clematis Dana,
1849 (Cnidaria: Actiniaria) se encuentra ampliamente distribuida en el área litoral de la ciudad de
Mar del Plata (Argentina), donde es una de las
especies más conspicuas y con mayor resistencia a
las condiciones imperantes (Fig. 1). Esto permite
tanto su fácil localización en las zonas de
muestreo, como su mantenimiento bajo condiciones de laboratorio. Dichos aspectos han posibilitado el estudio de esta especie bajo diversos
enfoques tales como sistemático (Zamponi, 1977),
bioquímico (Pollero, 1983), ecofisiológico (Patronelli
et al., 1987, 1998) y ecológico (Zamponi, 2003).
_________________________________________
Trabajo presentado en el Congreso MarCuba 2006
73
Patronelli et al.: Caracterización del esfínter marginal de Phymactis clematis (Cnidaria)
En la especie Phymactis clematis el esfínter es
altamente complejo y especializado y es el objetivo
de este estudio caracterizarlo mediante análisis
morfológico, funcional y bioquímico.
Fig. 1. Aspecto general de la especie
Phymactis clematis
El cuerpo de una anémona es cilíndrico y
constituye la columna que en el extremo proximal
forma el disco basal y en el extremo distal se
localiza el disco oral. En el centro de dicho disco se
encuentra la boca que se extiende hacia el interior
en un tubo delgado denominado estomodeo o
actinofaringe. La superficie interna de la actinofaringe forma dos canales cilíndricos llamados
sifonoglifos, cuya función es llevar agua al
celenterón; esta corriente sirve a la respiración y
para aumentar la presión hidrostática del cuerpo.
El celenterón está dividido por una serie de
paredes de tejido en disposición radial que
constituyen los mesenterios, los cuales se adhieren
a la superficie interna de la columna y disco donde
algunos de ellos alcanzan la actinofaringe. La
columna está formada por fibras musculares y por
debajo del margen superior, una capa muscular
circular se concentra para formar el esfínter
marginal (Figs. 2 y 3). La función de este músculo
es la de regular la apertura o cierre del disco oral,
y según la disposición del eje y subejes
mesogleales, puede ser de tipo circunscripto,
circunscripto-difuso o difuso (Manuel, 1981). Estos
tipos morfológicos pueden presentar variaciones
estructurales y fisiológicas, según las especies se
localicen en ambientes intermareales o de
profundidad (Patronelli et al, 2004, 2005).
Fig. 2. Esquema de la sección longitudinal del
cuerpo de una anémona detallando la morfología
interna. s: sifonoglifo. b: boca. ac: acrorhagi. m:
mesenterio. Pn: plexo neural.
En el ecosistema intermareal marplatense, la
especie Phymactis clematis puede localizarse en
áreas protegidas, expuestas y semiprotegidas;
dichas localizaciones hacen que haya una
respuesta del músculo esfínter a las diferentes
condiciones que imperan en esas áreas, tales como
la presión de la columna de agua y el embate de
las olas (Patronelli et al ,1987)
_________________________________________
Trabajo presentado en el Congreso MarCuba 2006
Fig. 3. Sección longitudinal de Phymactis clematis
(x 0.7) detallando la ubicación del esfínter
marginal. e: esfínter. t: tentáculo.
74
Rev. Invest. Mar. 29(1):73-77, 2008
de homogenización. Alícuotas de los extractos
miofibrilares fueron colectadas para cuantificar
proteínas por Lowry y para SDS- PAGE 10%.
MATERIALES Y METODOS
Las anémonas de mar de la especie Phymactis
clematis Dana, 1849, se recolectaron del piso
mediolitoral de la zona rocosa de Punta Cantera,
Mar del Plata, Argentina (38°0.5´ S, 57°32´ W). Los
organismos fueron mantenidos a temperatura
ambiente en un acuario con agua de mar aireada y
decantada y utilizados en el término de una
semana.
RESULTADOS
Estudio morfológico: La especie Phymactis
clematis posee un músculo esfínter circunscripto
de tipo palmado cuya longitud oscila entre 1,06 a
1,67 mm y un ancho entre 0,76 a 1,21 mm. Dicho
músculo está constituido por un eje mesogloeal y
numerosos subejes mesogleales; tanto el eje como
los subejes dan sostén al endodermo constitutivo
del músculo cuyo borde es liso (Fig. 4). El eje
mesogloeal tiene una longitud de 0,30 a 1,06 mm,
mientras que el ancho del mismo oscila entre 0,15
a 0,60 mm. Los subejes mesogleales son
numerosos, llegando a contabilizarse un número
superior a 5 (6 a 8), cuyas dimensiones varían
entre 0,07 a 0,91 mm de largo y 0,07 a 0,30 mm
de ancho.
A los ejemplares colectados se les realizaron los
siguientes estudios:
Estudio morfológico: El análisis del músculo
esfínter se realizó mediante técnicas de disección
siguiendo el plano longitudinal del organismo el
que fue colocado en una cápsula de Petri con
solución fijadora (solución formaldehído neutralizado al 40% o solución alcohólica absolu-ta). Fue
observado bajo microscopio estereoscópico y con
objetivos de diferentes grados de resolución se
tomaron los siguientes datos merísticos: largo y
ancho del esfínter, longitud y ancho del eje
mesogloeal y longitud y ancho de los subejes
mesogloeales. Las medidas fueron expresadas en
mm. n = 10.
Estudio fisiológico: Se disecó el esfínter siguiendo
la técnica de Patronelli et al. (1987) y se lo colocó
en una cámara para órgano aislado (10 ml de
volumen) con agua de mar decantada y filtrada en
la que se hizo burbujear aire. Las variaciones de
tensión producidas por el músculo se midieron
mediante un transductor de fuerza conectado a un
polígrafo. Se realizaron curvas dosis-respuesta
(CDR), a distintas concentraciones de KCl (20; 40;
60; 80; 100; 120, 140, 160, 180 y 200 mM) y
expresadas
en
tensión
(en
gramos)
vs
concentración. Dichas curvas se efectuaron con los
promedios ± el error standard (ES) de los
experimentos.
Estudio bioquímico: Se homogeneizaron en
mortero y en frío, seis esfínteres previamente
congelados en nitrógeno líquido con buffer TrisMaleato 20 mM, conteniendo 0,6M KCl y un coctel
de inhibidores de proteasa: (1 mM EDTA + 1 mM
PMSF + 1 mM ácido iodoacético). El extracto de
proteinas miofibrilares fue centrifugado a 6000 x g
y el precipitado fue descartado. Al sobrenadante se
le agregaron dos volúmenes de agua destilada fría
para precipitar proteínas miofibrilares y luego de
una nueva centrifugación, se colectó el precipitado
el que fue resuspendido en 5 mL del mismo buffer
Fig. 4. Corte histológico del esfínter marginal
mostrando eje mesogloeal (em) y subejes
mesogloeales (sm).
_________________________________________
Trabajo presentado en el Congreso MarCuba 2006
75
Patronelli et al.: Caracterización del esfínter marginal de Phymactis clematis (Cnidaria)
Estudio fisiológico: La fuerza contráctil aumenta
en forma sigmoidea a concentraciones crecientes
de KCl. La fuerza máxima desarrollada obtenida
con 200 mM de KCl fue de 2,68 ± 0,20 g (n= 20)
(Fig. 5).
La caracterización del
esfínter marginal nos
permitirá comparar este músculo en distintas
situaciones de stress y en diferentes condiciones
ambientales
y
observar
las
adaptaciones
morfológicas, funcionales y bioquímicas que
presenta frente a estas variables.
Dado que la especie Phymactis clematis posee un
esfínter de bordes lisos y con subejes mesogleales
superior a 5, nos permite conjeturar que la forma
típica de este músculo circunscripto, presenta
actividad fisiológica constante aún cuando queda
expuesto a fenómenos de exondación. En la misma
área de estudio, los autores hallaron otras especies
como Aulactinia marplatensis, en la cual el esfínter
marginal posee bordes festoneados, haciendo de
éste una estructura más fuerte. Esta adaptación
morfológica está relacionada con la localización de
la especie, ya que la misma se distribuye en las
paredes laterales de las rocas, adhiriéndose en
forma perpendicular a diferencia de P. clematis
cuya distribución es en superficies planas y
oquedades horizontales, donde la presión de la
columna de agua es de menor cuantía.
Luego de una contracción, para restaurar el calcio
expulsado durante la relajación son suficientes
bajas concentraciones de KCl que permiten la
entrada de calcio. Altas concentraciones de KCl
abren un mayor número de canales de calcio y la
alta concentración intracelular de este ion produce
una activación directa del sistema contráctil,
aumentando la fuerza de contracción. Así puede
observarse que la curva dosis-respuesta a
concentraciones crecientes de KCl en agua de mar
es de tipo sigmoidea.
Fig. 5. Curva dosis-respuesta a concentraciones
crecientes de KCl. g: gramos fuerza, n = 20. Barras
representan 2 ES
Estudio bioquímico: Las proteínas extractables
del esfínter con alta fuerza iónica constituyeron el
62,2% y las sarcoplasmáticas un 37.6% del
extracto proteico total.
El análisis de los geles obtenidos mostró las
bandas características de las proteínas contráctiles
presentes en todos los músculos además de una de
peso molecular de 105 kDa, la que muy
probablemente corresponda a paramiosina. Esta
proteína es característica de los filamentos gruesos
de los invertebrados y controla primariamente la
velocidad y duración de las fases contráctiles
(Royuela et al., 1999) Se ha sugerido que esta
proteína
provee
mecánicamente
estabilidad
estructural durante el desarrollo de tensión
(Winkelman, 1976) y puede influenciar la actividad
de ATPasa de las proteínas contráctiles (Sent.Györgyi et al., 1971; Beinbrech et al., 1992).
Los estudios en SDS-PAGE 10% revelaron que la
actina, miosina y un componente de 105 kDa que
probablemente corresponde a paramiosina, fueron
los componentes mayoritarios del extracto de alta
fuerza iónica.
DISCUSIÓN
Este trabajo contribuye al conocimiento hasta
ahora escaso del esfínter marginal de las
anémonas de mar. La integración de estos
resultados permite ahondar en el estudio
sistemático y evolutivo del grupo.
_________________________________________
Trabajo presentado en el Congreso MarCuba 2006
El aporte más relevante de este trabajo será la
obtención de un registro anual de las variaciones
que sufre este músculo en relación con los ciclos
76
Rev. Invest. Mar. 29(1):73-77, 2008
reproductivos ya que pudo observarse una
disminución de la fuerza contráctil cuando estos
organismos desovan (Patronelli et al. 2002).
environment of Mar del Plata (Argentina). Rev. R.
Acad. Galega Cienc. Vol XXIII, pp: 95-104.
Patronelli, D.L., E. González Olivera and M.O.
Zamponi (2005): Influence of the intertidal
environment on muscle activity in different species
of sea anemones (Actiniaria). Animal Biol. 55:101109.
Basado en estos datos se podrán correlacionar la
morfología, la fuerza de contracción y las
variaciones en las propiedades contráctiles de las
proteínas de los miofilamentos en los diferentes
estadios reproductivos: en desove y en reposo
reproductivo.
Pollero, R. (1983): Lipid and fatty acid
characterization and metabolism in the sea
anemone Phymactis clematis . Lipid. 18(1):12-17.
REFERENCIAS
Beinbrech, G., F.T. Ashton y F.A. Pepe (1992): The
invertebrate
myosin
filaments:
subfilament
arrangement of solid filaments of insect flight
muscles. Biophys. J. 61:1495-1512.
Royuela, M., B. Fraile, R. Paniagua and V.B.
Meyer-Rochow
(1999):
Immunocytochemical
observations on muscle cell proteins in the
antarctic mussel shrimp Acetabulostoma sp
(Crustace, Ostracoda). Invertebr. Biol.118:184-189.
Manuel, R.L. (1981): British Anthozoa. Synopses of
British Fauna. London: Academic Press. (D.M.
Kermack and R.S.K. Barnes, eds.), New series 18,
241 pp.
Szent-Györgyi, A.G., C. Cohen and J. KendrickJones (1971): Paramyosin and the filaments of
molluscan “catch” muscles. II Native filaments:
isolation and characterization. J. Mol. Biol. 56:239258.
Patronelli, D.L., M.O. Zamponi, A. Bustos and F.V.
Vega (1987): Morphological and physiological
adaptations in the marginal sphincter of anemone
Phymactis clematis, Dana 1849 from different
environments. Comp. Biochem. Physiol. 88A 2:337340.
Winkelman, L. (1976): Comparative studies of
paramyosins. Comp. Biochem. Physiol. B 55:391397.
Zamponi, M.O. (1977): La anemonofauna de Mar
del Plata y localidades vecinas. I. Las anémonas
Bolloceroidaria
y
Endomyaria
(Coelenterata:
Actiniaria). Neotropica 23(70):137-153.
Patronelli, D.L., G. Petcoff y E. González Olivera
(1998): Estudio histofisiológico comparativo del
esfínter
marginal
de
Phymactis
clematis
(Coelenterata: Actiniaria) de diferentes ambientes.
Biociencias 6: 67-78.
Zamponi, M.O. (2003): La agresividad de las
anémonas de mar (Cnidaria, Anthozoa, Actiniaria)
mediante las estructuras marginales denominadas
acrorhagi. Rev. R. Acad. Galega Cienc. Vol XXII,
pp:71-83.
Patronelli, D. L., P. Méndez and E. González
Olivera (2002): Contribution to the study of
contraction strength of the marginal sphincter of
the sea anemone Phymactis clematis (Actiniaria).
Biociencias 10: 35-42.
Patronelli, D.L., E. González Olivera and M.O.
Zamponi (2004): Contractile response of sea
anemones (Anthozoa: Actiniaria) from subtidal
Aceptado: 23 de octubre del 2007
_________________________________________
Trabajo presentado en el Congreso MarCuba 2006
77