1
Download Segregación de cromosomas homólogos en mutantes meióticos de
Transcript
Alteraciones cromosómicas inducidas por la transformación con T-DNA en Arabidopsis. Implicaciones en el análisis de mutantes Pradillo M, López E, Linacero R, Romero C, Oliver C, Santos JL, Cuñado N Departamento de Genética Facultad de Biología Universidad Complutense de Madrid Arabidopsis thaliana ¾ Planta de pequeño tamaño. Ciclo vital corto (6-8 semanas). Facilidad de cultivo. ¾ Alta producción de semillas. ¾ Genoma de pequeño tamaño (125 Mb) y la práctica totalidad secuenciado. ¾ Bajo contenido en secuencias repetidas. ¾ Mapas físicos y genéticos de todos sus cromosomas. ¾ Gran número de líneas mutantes. ¾ Métodos eficaces de transformación con Agrobacterium tumefaciens. Análisis citogenéticos en Arabidopsis thaliana Dificultados por: ¾Pequeño número de células madre de polen (CMPs) por antera. ¾Tamaño reducido de los cromosomas y de los núcleos. Ws Col Cariotipo mitótico de A. thaliana . Secuencia de la meiosis en CMPs de Arabidopsis Ws 5S 45S Identificación y caracterización de genes implicados en la meiosis de Arabidopsis thaliana ª Genética inversa: determinación de los efectos fenotípicos producidos como consecuencia de la modificación de un gen concreto (líneas SALK). ª Genética directa: búsqueda y análisis de mutantes que presenten alteraciones en distintos estadios de la meiosis (mutagénesis insercional con T-DNA). Mutagénesis insercional con T-DNA Transformación Plásmido Ti T-DNA Planta transformada ª Integración estable y al azar en el genoma. ª Marcadores de selección. ª Posibilidad de aislar el DNA flanqueante al T-DNA. Crecimiento en medio de selección RB TR-DNA pRiA4 GUS uidA KanR nos 3’ ocs 3’ nptII pGKB5 BastaR P nos P35S LB bar 3’g7 TR-DNA pRiA4 Identificación y caracterización de mutantes meióticos T-DNA Línea semiestéril ¿Fenotipo semiestéril? Selección de plantas con fertilidad reducida Columbia Caracterización citogenética Aislamiento e identificación del gen que interviene en el proceso meiótico Caracterización funcional Análisis citogenético de líneas semiestériles. Alteraciones en la meiosis Mutante rad51-2 Mutante ssd1 Mutante meiótico: Aislamiento y secuenciación del DNA genómico flanqueante al T-DNA LB DNA genómico Cebador 2 SphI T-DNA IPCR RB Digestión DNA genómico 2072pb 1500pb Cebador 1 Circularización 600pb PCR DNA genómico Producto PCR ªClonación ªSecuenciación Mutante rad51-2 (Ws) Meiosis en CMPs del mutante rad51-2 Aislamiento y caracterización del gen meiótico responsable del fenotipo mutante de rad51-2 (Ws) DNA genómico T-DNA RB GUS KmR BastaR LB DNA genómico At1g04440 At5g20850(RAD51) At5g20840(fosfatasa) Cromosoma 1 2 3 4 5 Aislamiento y caracterización del gen meiótico responsable del fenotipo mutante de rad51-2 (Ws) Identificación del inserto responsable: Cebadores diseñados a ambos lados de la región donde estaba integrado cada uno de los T-DNA. PCRs con estos cebadores y con un tercer cebador localizado en el borde izquierdo del T-DNA. 1 RB T- DNA 5 1 5 1 5 LB DNA genómico (cromosomas 1 y 5) HM cr.1, WT cr.5 HZ cr.1, HZ cr.5 Fenotipo normal La mutación es recesiva WT cr.1, HM cr.5 Fenotipo estéril Aislamiento y caracterización del gen meiótico responsable del fenotipo mutante de rad51-2 (Ws) RB T-DNA LB At5g20850 RAD51 3´ UTR “Aie insertion element” 2072pb 1500pb 600pb 5´ UTR Col * Ws At5g20840 Columbia (fosfatasa) Tamaño esperado de la banda: 2072 pb (*) Mutante ssd1 (structural spindle disruption 1) (Col) Meiosis en CMPs del mutante ssd1 Caracterización del fenotipo mutante de ssd1 (Col) ssd1 Col A-I A-I Inmunolocalización de α-tubulina Aislamiento y caracterización del gen meiótico responsable del fenotipo mutante de ssd1 (Col) DNA genómico T-DNA RB GUS KmR BastaR LB CR 3 MAA21.110 (quinesina) MAA21.100 (carboxipeptidasa) 1 2 3 4 CR 5 F22D1.120 F22D1.130 F4L23.3 Cromosoma DNA genómico 5 ssd1 Col F1 Fenotipo meiótico normal F2 Sin T-DNA en el cromosoma 2 Fenotipo meiótico normal Fenotipo meiótico mutante Con T-DNA en el cromosoma 2 RB LB T-DNA Promotor Exón Promotor Intrón MAA21.110 (quinesina) MAA21.100 (carboxipeptidasa) LB LB MAA21.110 Cromosoma 5 Cromosoma 3 (quinesina) LB2 FwTn35 Rv3g RvTn35 ~ 393 pb Marcador de peso molecular Col 100 pb 2 kb 1,5 kb ssd1 LB2/ Rv3g Col ssd1 FwTn35/ RvTn35 800 pb 779 pb 600 pb 400 pb ~ 779 pb 393 pb T-DNA Cromosoma 3 Cromosoma 5 En las plantas heterocigóticas de la F1 se detectó la existencia de una translocación recíproca entre los cromosomas 4 y 5 b c d e 5S 45S f I II III IV Translocación recíproca entre los cromosomas 4 y 5 Normal Heterocigota para la translocación Translocación recíproca entre los cromosomas 4 y 5 Heterocigota para la translocación Mutagénesis insercional con T-DNA Inconvenientes y/o Dificultades ª Integración no totalmente al azar con preferencia por zonas transcripcionalmente activas ª Integración de varios insertos en el mismo proceso: - en un solo locus o en varios loci, - en tándem o separados por secuencias de relleno - T-DNA con modificaciones ª La integración del T-DNA no siempre es completamente estable ª La mutación puede no estar siempre asociada con la presencia del T-DNA ª Reorganizaciones del genoma huésped como deleciones, duplicaciones, translocaciones e inversiones
