Download TEMA 9: Galactosemia-Fructosuria

Química Biológica Patológica
GALACTOSEMIA Y
FRUCTOSURIA
Tema:9 (Bolilla 9)
Dra. Silvia Varas
qbpatologica.unsl@gmail.com
TEMA 9:
Galactosemia. Manifestaciones clínicas.
Metabolismo de la galactosa en la
galactosemia. Defectos enzimáticos.
Metabolito tóxico. Diagnóstico. Prevención.
Detección de portadores.
Fructosuria. Metabolismo de la fructosa.
Fructosuria esencial. Intolerancia
hereditaria a la fructosa. Cuadro clínico.
Mecanismo bioquímico. Diagnóstico.
Origen de Galactosa
Leche
<< Ligada con enlaces tipo β en ciertas
legumbres, verduras y frutas.
<< En forma de galactocerebrósidos y
gangliósidos en algunas vísceras de
animales
1
Absorción de Gal
SGLT1
GLUT 2
GLUT 5
Glucosa-6-Fosfatasa
Premio Nobel, 1970
Glucosa-6- Deshidrogenasa
GLUCEMIA
SANGRE
Via de las Pentosas→ → →
D-Ribosa-5-P +NADPH + CO2
Via Glicolitica→ →
→Piruvato →
→→ Acetil CoA
Ciclo Krebs → → CO2+ H2O
2
“por su descubrimiento de los nucleótidos
de azúcar y su rol en la biosíntesis de
carbohidratos”
VIAS DE METABOLIZACION DE GALACTOSA
β-Cetogalactónico
Oxidación
Descarboxilación
D-xilulosa
Gal Deshidrogenasa
Aldosa Reductasa
Metabolismo Normal: Vía Leloir
VIAS DE METABOLIZACION DE GALACTOSA
β-Cetogalactónico
Oxidación
Fosfatasa
D-xilulosa
Gal Deshidrogenasa
Aldosa Reductasa
Fosfatasa
UDP-Gal
Pirofosforilasa
UDP-Glu
Pirofosforilasa
Descarboxilación
UDP-Gal
Pirofosforilasa
UDP-Glu
Pirofosforilasa
3
Cuando hay incapacidad de metabolizar galactosa
por las rutas normales
La “vía de la pirofosforilasa” con UDP
Galactosa Pirofosforilasa y UDP
Glucosa Pirofosforilasa (Reacción 6 y
Reacción 7)
Aldosa Reductasa puede ser reducida a
galactitol (Reacción 4)
Galactosa-Deshidrogenasa a
galactonato (Reacción 5)
Galactoquinasa (GALK)
DESORDENES HEREDITARIOS DEL
METABOLISMO GALACTOSA
Galactoquinasa (GALK)
Galactosa 1- Fosfato Uridil Transferasa
(GALT)
Uridina difosfato galactosa 4- Epimerasa
(GALE)
El gen GALK1 se encuentra en el
brazo largo (q) del cromosoma
17 en la posición 24
La enzima se expresa en hígado,
GR, leucocitos, fibroblastos, placenta
y varios tejidos fetales y
adultos en humanos
El dominio N terminal de la enzima
monomerica se muestra en azul y el dominio
C-terminal en rojo. Se muestra el sitio activo
donde se une galactosa y fosfato inorgánico
4
Galactosa 1- Fosfato Uridil
Transferasa (GALT)
Se expresa en
hígado, ID, ovarios,
cerebro, fibroblastos
y eritrocitos
El gen que codifica GALT esta
localizado en el cromosoma
9p13 y tiene una extensión de
4,3Kb, constituido por 11
exones.
Las dos subunidades del dímero
de la enzima se muestran en
color rojo y azul. Se indica la
posición de los metales en
formas de esferas. En el sitio
activo de la enzima se
encuentra unido UDPglucosa.
Tiene regulación dietaria y
hormonal
Uridina difosfato galactosa 4Epimerasa (GALE)
El gen GALE mapea en el
cromosoma 1p36. El gen
incluye 12 exones que se
extienden alrededor de 4 kb de
ADN genómico
Cada subunidad de la enzima
dimerica se plega en dos
dominios. Los dominios N y C
terminal están en color azul y
rojo, respectivamente. Unido al
sitio activo NADH y UDPglucosa. La enzima se expresa
en hígado, mucosa intestinal,
fibroblastos, eritrocitos.
Etiología
Incidencia global: 1/50.000
Patogenia
La deficiencia de GALK impide la
fosforilación de galactosa a Gal-1-P, lo
que supone un acúmulo de galactosa en
sangre, y la consiguiente producción de
galactonato y galactitol
El acúmulo de galactitol produce edema
de las fibras del cristalino, y una
desnaturalización de las proteínas,
responsable probablemente del desarrollo
de la catarata.
5
Patogenia II
En el déficit GALE se produce un
acúmulo de UDPGal e incluso de
Gal-1-P
Hay un déficit en la síntesis
endógena de galactosa y en la
producción de galactolípidos y
galactoproteínas
Aumento de Galactitol
Catarata nuclear “en gota de aceite” que puede
tener un inicio intrauterino, en casos
excepcionales
Patogenia III
El déficit GALT se produce un
aumento de Gal-1-P eritrocitaria y
de la galactosa plasmática con la
consiguiente galactosuria
La galactosa en exceso en el
plasma es convertida en
galactonato, y en galactitol.
Biología Molecular
Galactoquinasa Al menos 25 mutaciones
diferentes han sido identificados en los lugares
de GALK galactocinasa en pacientes.
La enzima humana incluye 392 aminoácidos con
una masa molecular de 42 kDa
Algunas de las mutaciones son:
1569C→T en el exón 2 (R68C),
7093C→T en el exón 6 (T 288M),
7538G→C en el exón 8 (A384P) y
una deleción de un par de bases en el exón 5
(2833del C).
6
Galactosa-1-Fosfato
Uridil Transferasa
Las 6 mutaciones más comunes
p.Q188R, p.S135L, p.K285N,
p.L195P, p.T138M y p.Y209C son el
80% de los casos de galactosemia
clásica. Una 7ª mutación IVS 2-2
A>G ha sido descrita en la población
hispana.
Mutación N314D: Variantes
La variante Duarte es un alelo polimorfico del
gen GALT que resulta en actividad alterada de
la enzima. Este polimorfismo común en la
población es sin signos clínicos o síntomas
Deficiencia de GALT: Alelos Duarte: La mutación
N314D esta asociada con dos variantes de
galactosemia que tienen actividad de GALT alterada
pero con fenotipos subclínicos diferentes.
Duarte-1 (Los
(Los Angeles)
Angeles)
Duarte-1
Duarte-2 (D2)
Esta asociado
asociado con
con
Esta
Esta asociado con
aumento de
de la
la actividad
actividad
aumento
disminución de la actividad
de
GALT
(110-130%
de
de GALT (110-130% de
de GALT
lo
normal)
lo normal)
El polimorfismo N314D es
N314D es
es un
un ligamiento
ligamiento
un ligamiento en
N314D
en desequilibrio
desequilibrio con
con la
la
en
desequilibrio con 3
sustitución silenciosa
silenciosa
sustituciones intrónicas
sustitución
L218L (c.652C>T).
(c.652C>T).
(IVS 4nt-27g>c; IVS 5ntL218L
24g>a y IVS 5nt+62g>a) y
una deleción de 4pb en el
promotor de GALT
La frecuencia
frecuencia de
de los
los
La
La frecuencia de los alelos
alelos D1
D1 es
es de
de 2,7
2,7
alelos
D2 es de 5,1
El Alelo Duarte puede tener significancia
clínica con otras mutaciones en el gen
GALT, llamadas galactosemia DG (genotipo
Duarte/Galactosemia).
La combinación de una mutación clásica (G)
y la variante D muestra una disminución de
la actividad de GALT pero no resulta
típicamente en los síntomas de galactosemia
clásica
7
Tabla II: Diagnostico de sospecha de la Galactosemia
I-Clínica de sospecha
II- Bioquímica Inespecífica
A- Síntomas Tóxicos
A- Disfunción Hepática
Vómitos
Rechazo del alimento
Depresión neurológica
Hiperbilirrubinemia
Hipoalbuminemia
Déficit complejo protrombina
GOT, GPT, GGT, LDH
Acidos Biliares plasmáticos.
Hipoglucemia
B- Afectación oftalmológica.
Cataratas
B- Tubulopatía proximal renal
Acidosis hiperclorémica
Glucosuria
Aminoaciduria
Albuminuria
C- Fracaso hepático grave
III- Bioquímica Específica
A-Galactosuria
Diagnostico Bioquímico
B- Aumento de galactosa en
plasma
C- Aumento de Gal-1-P en
eritrocitos
Ictericia
Hepato-esplenomegalia
Ascitis
Diátesis hemorrágica
D- Tubulopatía proximal
Determinación de metabolitos
Determinación de actividad enzimática
D- Galactitol en plasma y orina
E- Déficit Inmunitario
Sepsis E. coli
Determinación de metabolitos:
Galactosa en Orina
Gal-1-P en eritrocitos
Gal TOTAL en eritrocitos
Galactosa en Orina:
Pesquisa Neonatal
Galactosa oxidasa
Galactosa + O2
Ac.Galactónico + H2O2
Peroxidasa
Tabla VIII: Resumen de los niveles de metabolitos
Deficiencia
Galactosa (Plasma u
Orina)
Gal-1-P (sangre)
GALK
Elevada
Normal
GALT
Elevada
Elevada
GALE
Normal - Elevada
Elevada
H2O2 + Cromógeno
Cromógeno oxidado + H2O
Los valores normales en RN:
• hasta 60mg/dl de orina
8
Galactosuria Cuantitativa
D- Galactosa es oxidada a D-galactonolactona (que
en un medio alcalino se hidroliza espontáneamente)
en presencia de la enzima galactosa deshidrogenasa
(EC1.1.1.48).
La formación de NADH es medido en un intervalo de 10’, por
incremento en la absorbancia a 340nm que es proporcional a la
cantidad de D-Galactosa en la muestra.
Gal-1-P= Gal Total (2º) – Gal (1º)
Determinación Enzimática
Galactosa 1- Fosfato Uridil
Galactosa-1-Fosfato Uridil
Transferase (GALT), en Sangre
Hemolizado de GR
Transferasa (GALT) en eritrocitos
9
Ausencia NADPH – No hay decoloración
del Azul de Metileno
Análisis Molecular:
Detección de Mutaciones por
> NADPH ⇒ > actividad de GALT ⇒
> rapidez de decoloración de AM
amplificación por PCR+ER
Mutación Q188R
Mutación N314D
Mutación S135L
En Brasil la galactosemia tiene una frecuencia de
1:19.984 recién nacidos.
Q188R: exon 6, Por PCR se amplifica PA: 256 bp.
El cambio de de una A por G crea un sitio de corte para la enzima de
restricción HpaI.
El alelo Q188R genera dos bandas de 158 y 98 bp.
El alelo normal tiene un fragmento de 256pb.
N314D, Duarte 2 variant:exon 10, Por PCR se amplifica PA: 166pb
La mutación genera un sitio de corte para la enzima Ava II
El alelo N314D genera dos bandas de 100 y 66 bp.
El alelo normal tiene un fragmento de 166pb.
S135L: exon 5, Por PCR se amplifica PA: 252 bp. La mutación
genera un sitio de corte para la enzima TaqI en el exón 5.
El alelo S135L genera dos bandas de 192 y 60 bp.
El alelo normal tiene un fragmento de 252pb.
(A) Q188R – exon 6 GALT gene. L, marker; lane
1, mutated homozygous (referred case); lanes 2
and 3, heterozygous (two screened cases) and
lanes 4–10, homozygous wild-type allele.
(B) N314D – exon 10 GALT gene. L, marker; lane
4, homozygous mutated allele (referred case);
lanes 1, 2, 5 and 6, heterozygous and lines 3, 7–
10, homozygous wild-type allele
After amplification, the PCR products were digested overnight at 37-C using the
enzymes HpaII for exon 6, AvaII for exon 10 and TaqI for exon 5.
10
??
Duarte 2 homocigota, DG??
Tratamiento
La galactosa de la dieta debe ser
eliminada ante la menor sospecha
La ingesta diaria no debería contener
nunca más de 125 mg de galactosa
(frente a los 6.500 mg que por término
medio tiene una dieta de un adulto
normal);
Una dieta estricta contiene
aproximadamente unos 40 mg
Alimentos lácteos
La leche y todos sus derivados son la
principal fuente de galactosa liberada en
el intestino mediante hidrólisis de la
lactosa; y por tanto deben ser excluidos
de la dieta en cualquiera de sus formas.
La caseína es probablemente también una
fuente importante de galactosa libre, ya
que 100 gr. aportan 184 mg, y una
fórmula láctea cuyas proteínas sean un
hidrolizado de caseína, puede llegar a
tener 60-75 mg por litro.
11
Tabla IV: Contenidos aproximados en galactosa soluble de algunos
alimentos(mg/100 gr de alimentos)
Menos de 5 mg
Melón, uva, pomelo, naranja, fresas
Espárragos, remolacha, repollo, coliflor, apio, pepino, berenjena, espinaca, lechuga y
maíz.
Entre 5-10 mg
Manzana, banana, pera.
Brócoli, zanahoria, cebolla, nabo.
Entre 10-20 mg
Kivi, sandia, piña.
Col de Bruselas, calabazas, sandia, batata.
Entre 20-30 mg
Arándano
Tomate
Entre 30-50 mg
Soja, alubias
Más de 100 mg
Control del tratamiento:
Los marcadores utilizados para el
seguimiento del tratamiento dietético son
los niveles de Galactosa-1-P eritrocitarios,
y galactitol plasmático.
Valores de 4 mg % de Gal-1-P, y de
25-30 µmol/L de galactitol plasmático
(mg/dl =38 x µmol/L), es lo máximo que
puedan aceptarse como buenos
Lentejas, guisantes, porotos
Más de 400 mg
Higos secos, pasas, avellanas
Garbanzos
Bibliografía:
- Baldellou A.; Briones P. y Ruiz M.
AECOM: Asociación Española para Estudio de Errores Congénitos del Metabolismo:
Protocolo 9: Galactosemia. Protocolo de diagnóstico y tratamiento de los errores
congénitos del metabolismo de la galactosa
- Segal SS ; Berry GT. Disorders of Galactose Metabolism. En Scriver CR, Beaudet
AL, Sly W S, Valle D (eds). The metabolic and molecular bases of inherited disease.
New York, McGraw Hill, 2001; pag. 967-1000
- Annet M. Bosch. Classical galactosaemia revisited. J Inherit Metab Dis (2006)
29:516–525
- J. DíazRuiz, A.CordónMartínez,J.LópezLópezyA.JuradoOrtiz. Galactosemia.
An Pediatr (Barc). 2011
JM Flanagan, G McMahon, SH Brendan Chia, P Fitzpatrick, O Tighe, C
O’Neill, P Briones, L Gort, L Kozak, A Magee, E Naughten1, B Radomyska, M
Schwartz, JS Shin, WM Strobl,
LA Tyfield, HR Waterham, H Russell, G Bertorelle, JKV Reichardt, PD Mayne
and DT Croke. 2010. The role of human demographic history in determining the
distribution and frequency of transferase-deficient galactosaemia mutations.
Heredity 104, 148–154
- Amanda E. Carney, Rebecca D. Sanders, Kerry R. Garza, Lee Anne McGaha,
Lora J. H. Bean, Bradford W. Coffee, James W. Thomas, David J.
Cutler,Natalie L. Kurtkaya and Judith L. Fridovich-Keil. Origins, distribution
and expression of the Duarte-2 (D2) allele of galactose-1-phosphate
uridylyltransferase. Human Molecular Genetics, 2009, Vol. 18, No. 9
- Mohamed Jama, Lesa Nelson, Rong Mao and Elaine Lyon. Simultaneous
Amplification, Detection, and Analysis of Common Mutations in the Galactose-1Phosphate Uridyl Transferase Gene.J Mol Diagn 2007, 9:618–623.
- Suzuki, M., West, C. and Beutler, E. (2001) Large-scale molecular screening for
galactosemia alleles in a pan-ethnic population. Hum. Genet., 109, 210–215.
Alguna pregunta?
12
Trastornos del metabolismo
de la Fructosa
Estructura
Fructosuria esencial
Intolerancia hereditaria a la fructuosa
Deficiencia hereditaria de fructosa 1,6 bifosfatasa
No existen métodos específicos para la
determinación de fructuosa en presencia de otros
azucares. La mayoría de los métodos colorimétricos
derivan de la reacción de Selivanoff
Para confirmar la presencia de
fructuosa se realiza por TLC y
cromatografía liquida
hidroximetilfurfural
resorcinol
Sin embargo, da positivo para las siguientes reacciones:
Cromatografia de la orina
del paciente y estándar
de azucares.(Butanol-acido
ácetico; 16 horas)
13
Fructuosa ingresa al enterocito a través del
transportador apical GLUT5 por difusión
facilitada.
La captación desde el enterocito a la circulación
portal es por medio del transportador basal
GLUT2, el cual transporta también glucosa y
galactosa.
MUSCULO
Fosfohexosa isomerasa
HIGADO
Aldolasa B
Fosfofructo Quinasa-1
(PFK-1)
Fructuosa 1,6-bisfosfatasa
(FBPasa-1)
Aldolasa
14
Glucosa
Enzimas del metabolismo
de Fructuosa:
Glicerol, Lactato y Alanina
Hexoquinasa (cerebro, músculo)
1-Fosfofructoquinasa (músculo)
PFK-1
FBPasa-1
Fructuosa 1,6 bisfosfatasa
Fructaldolasa (Fructuosa 1,6-difosfato
Aldolasa, Aldolasa)
Fructoquinasa (músculo e hígado)
Fructuosa-1-fosfato aldolasa
Triosaquinasa
Efectos tóxicos de
Fructuosa
Acido Úrico
Acido Láctico
2-Incremento de Lactato en
sangre provocado por Fructuosa
La mayor actividad de fructoquinasa comparada con
la capacidad de la hexaquinasa + glucoquinasa para
fosforilar glucosa;
El hecho que en la fructolisis elude el paso de la vía
glicolítica catalizado por la PFK-1 (fosfofructoquinasa)
evita el punto principal de control metabólico a lo
largo de la vía glicolítica;
Una estimulación de piruvato quinasa, la segunda
enzima regulatoria de la vía glicolítica, por fructosa
1−fosfato y por fructuosa 1,6− bisfosfato.
15
Defectos hereditarios:
Fructosuria benigna o esencial: Deficiencia de
fructoquinasa (FK)
Intolerancia hereditaria a la fructuosa:
Deficiencia de la Aldolasa B
Deficiencia hereditaria de fructosa 1,6 bifosfatasa
Fructosuria benigna o esencial:
Deficiencia FK
No ocasiona síntomas clínicos, por lo
que su detección suele ser un
hallazgo casual.
Esto sucede al encontrar sustancias
reductoras en orina en pacientes
que están ingiriendo fructosa o
alimentos que la contengan.
Fructosuria benigna o esencial:
Deficiencia FK
La enzima se expresa en hígado, riñón,
intestino, islotes pancreáticos y corteza renal
Esta enzima actúa en la conversión de fructosa a
fru-1-P, de forma que la fructosa se acumula en
la sangre y es eliminada por la orina aunque una
parte, la ingerida, se puede metabolizar
probablemente por otras vías minoritarias.
Su frecuencia se estima en 1/120.000, aunque
probablemente, dada su benignidad, haya
muchos casos no diagnosticados y la frecuencia
real sea superior.
Intolerancia hereditaria a la fructuosa:
Deficiencia de la Aldolasa B
Frecuencia se estima en 1/23-25.000
Hay falta de actividad del enzima fructosa1,6-difosfoaldolasa o aldolasa B.
Metabolito TOXICO que se acumula: Fru-1P
Produce agotamiento de los depósitos de Pi
hepáticos.
Cae la [ATP] celular
16
ATP (40%)
Pi (80%)
Algunos efectos tóxicos
observados con hiperfructosemia
Acido Úrico
Acido Láctico
Magnasemia
Fosfatemia
Glucemia
Acidosis metabólica
Intolerancia de Fructosa Hereditaria
Condiciones Normales
Adenilato kinasa
adenosina kinasa
AMP deaminasa
(+)
Adenosina
deaminasa
5’ Nucleotidasa
Nucleósido Fosforilasa
AMP deaminasa
Xantina Oxidasa
Xantina Oxidasa
17
Intolerancia hereditaria a la fructuosa:
Deficiencia de la Aldolasa B
Intolerancia hereditaria a la fructuosa:
Deficiencia de la Aldolasa B
Mutaciones en gen de Aldolasa B
Mutación
A149P
(G C)
Porcentaje de
alelos con la
mutación
67%
A174D
16 %
L288∆C
Cambio en marco
de lectura
Población Europea
(50 pacientes.)
Intolerancia hereditaria a la fructuosa:
Deficiencia de la Aldolasa B
Laboratorio
Deficiencia hereditaria de Fructosa-1 ,6difosfatasa (FDPase-1) hepática
El primer paciente con una deficiencia
de FDPase-1 fue descrita en 1970. Los
pacientes se presentan con la
hipoglucemia, acidosis, cetonuria, e
hiperventilación
Se trata de un defecto autonómico
recesivo que se caracteriza en el periodo
neonatal por presentar episodios de
hiperventilación, apnea, hipoglucemia con
cetosis y acidosis láctica
Restringida a
sujetos sicilianos
18
Glucosa
Deficiencia hereditaria de Fructosa-1 ,6difosfatasa (FDPase-1) hepática
Glicerol, Lactato y Alanina
El bloqueo metabólico altera la vía de
formación de glucosa a través de la
neoglucogénesis incluyendo el glicerol,
lactato y alanina.
En un recién nacido o un individuo
después de un ayuno prolongado
aumenta la necesidad de obtención de
energía y al estar bloqueada la
neoglucogénesis se produce
hipoglucemia, que normalmente está
acompañada de hiperlactatemia, aumento
del ácido pirúvico y cuerpos cetónicos.
Deficiencia hereditaria de Fructosa-1 ,6difosfatasa (FDPase-1) hepática
El objetivo principal del tratamiento
es prevenir hipoglucemias y
Evitar la neoglucogénesis,
proporcionando una dieta
fraccionada, con ingesta elevada de
carbohidratos compuestos (cereales
integrales)
PFK-1
FBPasa-1
Tratamiento:
Consiste en eliminar la fructosa de la
dieta con la dificultad que esto con
lleva, dado que la sacarosa suele ser
componente de numerosos
productos.
19
Bibliografía:
Gitzelmann R., Steimann B., Van den
Berghe G. Disorders of Fructuose
Metabolism. En Scriver CR, Beaudet AL,
Sly W S, Valle D (eds). The metabolic and
molecular bases of inherited disease. New
York, McGraw Hill, 2001; Chapter 23.
pag. 905-934.
Nadia Bouteldja & David J. Timson.
The biochemical basis of hereditary
fructose intolerance. J Inherit Metab Dis
(2010) 33:105–112
Alguna pregunta?
20