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UTILIZACION DE Azospirillum brasilense PARA EL BIOCONTROL
DE ANTRACNOSIS EN FRUTILLA (Fragaria ananassa)
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Tortora María L. , Díaz Ricci Juan C. , Pedraza Raúl O.
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Facultad de Agronomía y Zootecnia, Universidad Nacional de Tucumán.
Avda. Roca 1900. (4000) Tucumán, Argentina. BID1728-OC/AR PICTO 2004 Nº860. CIUNT Programa 26/A331.
E-mail: raulpedraza03@yahoo.com.ar
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Instituto Superior de Investigaciones Biológicas, INSIBIO-CONICET.
Chacabuco 461. (4000). Tucumán, Argentina.
E-mail: juan@fbqf.unt.edu.ar
RESUMEN
La antracnosis es una de las enfermedades más importantes que afecta al cultivo de frutilla. Debido a la
grave contaminación ambiental y a la resistencia que se genera al tratar de reducir su impacto con compuestos
químicos, actualmente se considera al control biológico como una alternativa para su tratamiento. Las bacterias
promotoras del crecimiento de las plantas (PGPB) se cuentan entre los agentes de control biológico utilizados
actualmente, y dentro de las PGPB mas estudiadas están las pertenecientes al género Azospirillum. Estudios
realizados en nuestro laboratorio han demostrado que la asociación Azospirillum-frutilla es benéfica para el
crecimiento de la planta.
En este trabajo analizamos la capacidad de dos cepas endofíticas de A. brasilense, aisladas de raíz (REC) y
estolón (PEC) de plantas de frutilla, de inducir protección frente a la antracnosis al ser inoculadas en plantas de
frutilla de diferentes variedades. Los resultados obtenidos muestran una marcada disminución en la severidad
de los síntomas de la enfermedad en plantas ‘Camarosa’ inoculadas con la cepa REC3, var. ‘Selva’ inoculadas
con la cepa PEC5 y var. ‘Milsei’ inoculadas con la cepa REC3 con respecto a las plantas control no inoculadas.
También se observó que esta respuesta es cepa específica y depende de la variedad de frutilla utilizada.
PALABRAS CLAVES: Azospirillum brasilense, antracnosis, frutilla
ABSTRACT
Anthracnose is one of the major diseases that adversely affects the strawberry crop. Due to the environmental
pollution and resistance caused by chemicals, nowadays biological control is considered as an alternative for
crop protection. PGPR strains represent one of the most important biological control agents. One of the more
studied PGPB are bacteria of the genus Azospirillum. Reports from our group demostrated that Azospirillumstrawberry association could promote plant growth. In this work, we analyzed the resistance mediated by two
strains of A. brasilense isolated from the inner tissues of roots and stolons of the cultivar ‘Camarosa’ in impeding
the development of antrachnose disease when are inoculated on strawberry plants.
Our results showed a strong decrease of disease symptoms in the cultivar ‘Camarosa’ inoculated with REC3,
‘Selva’ with PEC5 and ‘Milsei’ with REC3 in comparison with the control plants no inoculated. We observed
that the defense response was strain-specific and also depended on the strawberry cultivar.
KEYWORDS: Azospirillum brasilense, antrachnose, strawberry
INTRODUCCIÓN
La frutilla (Fragaria ananassa) es uno de los cultivos más importantes en las regiones templadas de producción de fruta en el mundo (Von Bernard y Obschatko, 2003). Argentina produce frutilla durante los doce
meses del año siendo uno de los países de mayor producción. Debido a su ubicación geográfica y condiciones
agroecológicas, Tucumán presenta ventajas comparativas tanto para la producción de fruta como para la de
plantines (vivero) con respecto a las demás zonas de Argentina (Pérez y Mazzone, 2004). La superficie plantada
en Tucumán supera las 500 ha y las principales zonas de producción se encuentran en los departamentos de
Lules y Tafí del Valle.
Uno de los principales problemas que presenta el cultivo de frutilla es la elevada susceptibilidad a enfermedades y plagas que resultan ser limitantes para la producción y la calidad de la fruta (Howard y Albregts,
1984). A nivel mundial, la mayoría de las enfermedades que afectan al cultivo de frutilla están relacionadas
con hongos de los géneros: Colletotrichum, Phytophtora y Botrytis. Estas enfermedades producen importantes
pérdidas de fruta y plantines, y su control incide considerablemente en los costos de producción.
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En Tucumán una de las enfermedades que mayores pérdidas ha producido es la antracnosis, causada por
hongos del género Colletotrichum (Kirschbaum, 2000). Si bien existen tres especies identificadas como agentes etiológicos de esta enfermedad: C. acutatum, C. fragariae, y C. gloeosporioides (Howard et al., 1992), C.
acutatum es la más frecuentemente asociada (Mena et al., 1974; Mónaco et al., 2000; Ramallo et al., 2000).
Actualmente, para reducir la incidencia de la antracnosis se realizan aplicaciones de grandes volúmenes de
fungicidas y la desinfección de suelos con bromuro de metilo. Esto ha causado con el tiempo una grave contaminación ambiental, desarrollo de resistencia y un aumento en los costos de producción. Como una solución
a este problema la agricultura moderna ha desarrollado una nueva tendencia en lo que respecta a la protección
vegetal que se orienta hacia el empleo de agentes de control biológico (ACB) para el manejo integral de plagas
y enfermedades del cultivo.
Los ACB pueden actuar directamente sobre el patógeno (microorganismos antagonistas) o bien, interaccionar con la planta huésped confiriéndole protección mediante la activación de sus mecanismos de defensa
(Compant et al., 2005).
Durante los últimos años se ha intensificado el uso de bacterias promotoras del crecimiento de las plantas
o PGPB (por sus siglas en inglés Plant Growth Promoting Bacteria) para el biocontrol de microorganismos
fitopatógenos. Entre las PGPB encontramos a las pertenecientes al género Azospirillum. Si bien existen numerosos estudios que demuestran que Azospirillum es capaz de estimular el crecimiento de diversas especies de
plantas, incluida su asociación con frutilla (Bellone et al., 1995; Kirschbaum., 1999), existen pocos informes
sobre esta bacteria utilizada como agente para el biocontrol de fitopatógenos (Bashan y Bashan, 2002).
El objetivo de este trabajo es evaluar la capacidad de cepas homólogas de A. brasilense con efectos positivos
sobre el crecimiento vegetal (Pedraza et al., 2007), de inducir protección frente a la antracnosis en diferentes
variedades de plantas de frutilla.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se trabajó con plantas saneadas por cultivo “in vitro” de las variedades: ‘Camarosa’, ‘Selva’ y ‘Milsei’.
Las plantas se mantuvieron en cámaras de crecimiento (fitotrón) bajo condiciones controladas (28 ºC, 70% HR
y un ciclo de luz de 16 hs diarias).
Microorganismos
Hongos
En los ensayos de infección se utilizó el aislado M11 de C. acutatum. El hongo se cultivó durante 7 días
en medio agar papa glucosado (APG) a 28 ºC y en condiciones de luz continua para favorecer la producción
de conidios (Smith y Black, 1990).
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Para la inoculación de las plantas se preparó una suspensión de conidios de 1,5 x 10 conidios/ml en agua
destilada estéril adicionada con 0,1% (v/v) de Tween 80. Para ello, los conidios se recolectaron raspando con
ansa la superficie del micelio del hongo crecido durante 7 días a 25 ºC en medio APG, se resuspendieron en
agua destilada estéril y se filtraron con gasa colocada en una jeringa para eliminar el resto de micelio. La cuantificación se realizó en cámara de Neubawer (Salazar et al., 2007).
Bacterias
Para la inoculación de cada cultivar se eligieron las cepas de A. brasilense que mejores propiedades promotoras del crecimiento presentaron en trabajos realizados previamente (Motok et al., 2006). Se utilizaron
cepas endofíticas de A. brasilense aisladas de raíces (REC3) y de estolones (PEC5) de plantas de frutilla de la
variedad ‘Camarosa’ (Pedraza et al., 2007)
En la preparación de los inóculos bacterianos se partió de una colonia aislada, crecida en medio sólido NFb
con Rojo Congo; se realizó un cultivo en medio NFb líquido sin azul de bromotimol y suplementado con 0,1%
de NH Cl. Se incubó a 30 ºC durante 72 hs y se realizó una dilución con agua destilada estéril hasta alcanzar
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una densidad óptica DO 0,2, correspondiente a una concentración celular de aproximadamente 10 ufc/ml.
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Ensayo de inhibición
La inoculación de las plantas se realizó por riego con 30 ml de la suspensión bacteriana DO 0,2. Las
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plantas inoculadas permanecieron en cámaras de seguimiento, bajo condiciones controladas. Quince días después
de la inoculación fueron infectadas con C. acutatum M11 por pulverización hasta punto de goteo. Se colocaron en cámaras de estrés donde permanecieron 24 hs, a 30ºC y 100% de HR en la oscuridad, para favorecer
el crecimiento y el establecimiento del hongo. Luego de este período las plantas se colocaron nuevamente en
cámaras de seguimiento (30ºC, 70% HR y ciclo lumínico de 16 horas/día), en donde se evaluó el desarrollo de
la enfermedad a los 9, 21, 30 y 40 días después de la inoculación y la severidad de los síntomas se cuantificó
siguiendo la escala DSR (Disease Severity Rate): 1; pecíolos saludables sin lesiones, 2; pecíolos con lesiones
menores a 3 mm, 3; pecíolos con lesiones de 3 a 10 mm, 4; pecíolos con lesiones de 10 a 20 mm y 5; pecíolos
totalmente necrotizados y plantas muertas (Delp y Milholland, 1980).
Como control negativo se utilizaron plantas que no fueron sometidas a ningún tratamiento. Además se utilizó
como control de infección, plantas no inoculadas con la bacteria, infectadas con el hongo, y como control de la
inoculación bacteriana se utilizaron plantas inoculadas con la bacteria pero sin infectar con el hongo.
Diseño experimental y análisis estadístico
El diseño experimental fue aleatorizado con 10 plantas por genotipo, utilizando 5 plantas como control y
5 plantas inoculadas. Los datos experimentales obtenidos a partir del ensayo fitopatológico fueron analizados
con el programa Statistix (Analytical Software, 1996). Se utilizo el test LSD para la determinación de la significancia estadística de las medias aritméticas de los valores de DSR (P = 0,05) de las plantas inoculadas con
cada cepa. Para analizar la dispersión de los datos alrededor de la media aritmética se realizó el análisis de la
varianza (ANOVA).
RESULTADOS
A los 9 días después de la infección de las plantas con C. acutatum M11, tanto las plantas control como las
inoculadas con A. brasilense presentaron síntomas de la enfermedad en pecíolos. Sin embargo, 21 días después
de la infección todas las plantas control presentaron un DSR = 5, mientras que el DSR de las plantas inoculadas
al mismo tiempo de infección fue menor. Las plantas de la var. ‘Camarosa’ inoculadas con REC3, presentaron
en promedio un DSR = 3, la var. ‘Milsei’ inoculada con REC3 presentó un DSR = 3 y con PEC5 un DSR = 4,
y la var. ‘Selva’ inoculada con PEC5 presentó un DSR = 2.
En la Fig. 1 se muestran los resultados obtenidos para las plantas control y las inoculadas, 40 días después
de la infección con el hongo. Se observa una marcada disminución en la severidad de los síntomas (DSR)
causados por la antracnosis en las plantas ‘Camarosa’ inoculadas con REC3, ‘Selva’ inoculadas con PEC5 y
‘Milsei’ inoculadas con REC3 con respecto a las plantas control.
A pesar de que las plantas ‘Milsei’ inoculadas con PEC5 presentaron valores de DSR menores que los de
las plantas control hasta los 21 después de la infección, a partir de los 30 días y hasta finalizar el ensayo éstas
diferencias dejaron de ser estadísticamente significativas.
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Fig1: Efecto de la inoculación de las cepas REC3 y PEC5 sobre la susceptibilidad frente a C. acutatum M11 de los cv
‘Camarosa’, ‘Selva’ y ‘Milsei’. Los resultados muestran los valores de DSR evaluados a los 40 días desde la infección
de las plantas con C. acutatum M11. Los valores de DSR con diferentes números representan valores estadísticamente
diferentes. (Test de Tukey, p = 0,05)
Según se puede observar en la Tabla 1, la protección frente a la antracnosis inducida por la cepa REC3 fue
similar tanto para el cultivar ‘Milsei’ como para ‘Camarosa’, sin embargo, la cepa PEC5 confirió una mayor
protección cuando fue inoculada en ‘Selva’ (disminución de aproximadamente el 50% en el valor de DSR con
respecto a las plantas control).
Estos datos coinciden con los observados en trabajos realizados anteriormente en donde se observó que
el efecto promotor del crecimiento depende de la combinación de la cepa con respecto a la variedad utilizada
(Motok et al., 2006). Podría decirse entonces que al igual que el efecto promotor del crecimiento, la inducción
de resistencia frente a la antracnosis también depende de la combinación cepa-variedad utilizada.
Tabla1: Severidad de los síntomas de la antracnosis expresados como % DSR, evaluados a los 40
días desde la infección de las plantas con C. acutatum M11.
DISCUSIÓN
Las bacterias PGPB son consideradas uno de los agentes más importantes para el biocontrol de numerosas
enfermedades fúngicas que afectan los cultivos. En este trabajo, analizamos la capacidad de cepas homólogas
de A brasilense con propiedades promotoras del crecimiento conocidas, de inducir resistencia frente a la antracnosis causada por C. acutatum M11 en plantas de frutilla de diferentes variedades.
Se observó una marcada disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad en las plantas
inoculadas con las cepas de A. brasilense con respecto a las control. La resistencia desarrollada por la cepa
REC3 fue similar para las variedades ‘Camarosa’ y ‘Milsei’, mientras que la cepa PEC5 indujo resistencia solo
cuando fue inoculada en la variedad ‘Selva’, y esta resistencia fue mayor que la observada para REC3 con las
otras dos variedades.
Según estos resultados podría decirse que la inducción de resistencia es cepa especifica y que depende de
la variedad utilizada, además, los resultados son coincidentes con los de un bioensayo realizado anteriormente
(Motok, et al, 2006), en el cual se concluye que las cepas homólogas endofíticas de A. brasilense producen efectos positivos en la promoción del crecimiento de plantas de frutilla y que este efecto promotor del crecimiento
depende de la combinación entre la cepa y la variedad utilizada. Esta especificidad en la combinación cepavariedad podría deberse a la necesidad de adaptación de la bacteria a las diferentes condiciones nutricionales
proporcionadas por las plantas (Reinhold et al., 1985).
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Trabajos previos realizados en nuestro laboratorio demostraron que la quimiotaxis de distintas cepas endofiticas y rizosféricas de A. brasilense aisladas de frutilla es cepa especifica respecto de la variedad de frutilla
utilizada y que depende de la composición química de los exudados radiculares (Ragout et al., 2007).
En base a los resultados obtenidos en este trabajo podrían utilizarse cepas de A. brasilense aisladas de
plantas de frutilla con características promotoras del crecimiento como agentes de biocontrol para reducir los
síntomas de la antracnosis.
CONCLUSIONES
Podemos concluir que las cepas homólogas endofíticas de A. brasilense REC3 y PEC5, son capaces de
reducir la severidad de los síntomas de la antracnosis cuando son inoculadas en plantas de frutilla. Esta inducción de resistencia depende de la combinación entre cepa y la variedad utilizada.
Debido a que estos datos se correlacionan con los de promoción de crecimiento, es posible encontrar una
combinación cepa-variedad donde el efecto promotor del crecimiento y la inducción de resistencia tengan
valores óptimos.
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