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Mutagénesis sitio-dirigida en la proteína OppA de Yersina pseudotuberculosis YPIII Escobar Garduño Elenaa, Soto Urzúa Lucíaa, Scior Thomasb, Baca Beatriz Eugeniaa, Martínez Morales Luis Javier*a. a Centro de Investigaciones en Ciencias Microbiológicas Instituto de Ciencias, bFacultad de Ciencias Químicas. Benemérita Universidad Autónoma de Puebla. Edif. 103 J, C.U. Av. Sn. Claudio y 24 sur Col. Sn. Manuel, C.P.72570, puebla, Pue. Mex. E-mail: elesgard@gmail.com Porcentaje de actividad de αglucosidasa Introducción. Yersinia pseudotuberculosis tiene sistemas de transporte tipo ABC entre ellos el sistema de transporte de oligopeptidos (Opp), cuya proteína receptora (OppA) que tiene actividad supuesta de tipo chaperona y de unión a ligando. La relación entre la actividad dual propuesta de OppA y su estructura no está analizada, por lo que en este estudio se realiza sustitución de aminoácidos, para determinar cómo afectan estos cambios a la supuesta actividad de tipo chaperona en OppA. Material y métodos. Para determinar los aminoácidos a sustituir, se compararon in silico las proteínas OppA de E. coli (PDB: 3TCH y 3TCG), de Y. pestis (PDB: 2Z23) y la chaperona HdeA (PDB: 1DJ8), usando los programas SwissPdbViewer y Discovery Studio de Accelrys. Mutagénesis sitio-dirigida: Realizada mediante PCR inversa con oligonucleótidos mutagénicos complementarios. Purificación de las proteínas OppA silvestre y OppA(mut): El gen oppA está clonado en el vector de expresión pEXP5-CT y las proteínas fueron purificadas con Ni-NTA (siguiendo las instrucciones del fabricante). Ensayos de actividad de chaperona: Una unidad de α-glucosidasa se desnaturalizó con urea 4 M, después de 60 minutos, se agregaron 1.15 μM de albúmina, OppA wt u OppA R41A/D42A, en un volumen final de 500 μL, por 90 minutos, posteriormente se agregaron 2 μg de maltosa y después de 90 minutos se midió la concentración de glucosa con el método de glucosa oxidasa. Los ensayos fueron realizados por triplicado. Resultados. Los cambios seleccionados Renaturalización de α-glucosidasa fueron: Arg 41 y Asp 42 sustituidos por alanina, 100 Asp 419 y Tyr 420 por glicina y sustituir estos 50 cuatro aminoácidos juntos. La mutante analizada fue OppA R41A/D42A. Al agregar 0 solución de KH2PO4 50 mM y KCl 200mM a la enzima desnaturalizada, el porcentaje de recuperación de la actividad es del 36%, con Figura 1. Porcentaje de recuperación de la actividad de αalbúmina es del 55%, con la proteína OppA wt glucosidasa. Sin desnaturalizar, desnaturalizada con urea del 83% y con OppA R41A/D42A del 4M, agente renaturalizante buffer, albúmina, OppA wt y OppA R41A/D42A 61%.(fig.1) Conclusiones. Con los datos obtenidos se comprueba que la proteína OppA, tiene actividad tipo chaperona bajo las condiciones utilizadas, el cambio de Arg 41 y Asp 42 por alanina disminuye esta acción, lo que sugiere que esa región de OppA, está involucrada en la actividad de tipo chaperona.
