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TUNEL EN TEJIDOS Grupo de señalización por cannabinoides Departamento de Bioquímica y Biología Molecular I Facultad de Ciencias Químicas Universidad Complutense de Madrid 28040 Madrid Tlfn: +34 913944668 Fax: +34 913944672 Pág. 1/1 PROCEDIMIENTO PASO 1. Si el corte está congelado y fijado, se pone 5’ en PBS limpio. Si el corte está en parafina, se desparafina primero. PASO 2. Permeabilizar el tejido con PBS + 0.25 % de Triton X-100 + 10% de suero de cabra durante 30-40’. PASO 3. Lavar con PBS (1x). PASO 4. Incubar los cortes con la mezcla de reacción (calcular aproximadamente 350 µl por cada portaobjetos) durante 2 horas mínimo en cámara húmeda a 37º C. Volúmenes (por ml de mezcla): Buffer 5x 200 µl Enzima rTdT 0.5 µl dUTP 2.5 µl H2O 792.5 µl PASO 5. Parar la reacción con 2x SSC durante 15’ a temperatura ambiente. PASO 6. Lavar con PBS (3x) de 5 a10’. PASO 7. Incubar con Streptavidina conjugada con Alexa 594 (rojo) (3.5 µl de Strp/ml PBS) durante 2 horas en cámara húmeda en oscuridad. PASO 8. Lavar con PBS (3x) de 5 a10’. PASO 9. Montar con Mowiol + YOYO-1 (1/1000) o TOTO-3 (1/1000).
