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TAREA BQ Experimental
Teoría
De acuerdo a los enunciados que aparecen a continuación, seleccione la respuesta
que le parezca más adecuada.
Son los aminoácidos que permiten la determinación de proteína a 280 nm y por
qué, dibuja su estructura
Se requiere determinar la concentración de una proteína pura, esa misma proteína
se utilizará para determinar la kcat. Qué método utilizaría para determinar su
concencetración? Y por qué?
Es el método para determinación de proteínas en el que se forma un compuesto
colorimétrico, entre el cobre y el enlace péptidico de la proteína, que reacciona con
el reactivo de Folin.
Se requiere separar de una mezcla de proteínas A,B,C,D a la proteína C y sólo se
conoce el porcentaje de saturación por sulfato de amonio para cada una de ellas, los
cuales son para A 25%, B 37%, C 50% y D 65% de acuerdo a estos datos que
protocolo de separación utilizaria:
Se desea purificar la betaína aldehído deshidrogenasa de planta expresada en
E.coli, para llevar a cabo experimentos cinéticos y estructurales, que pasos
emplearía?
Relaciona las columnas
1) Técnica que se encarga
de separar las proteína en
base a su carga
2) Técnica que separa a las
proteínas por tamaño
3) Técnica que separa a las
proteínas aprovechando su
solubilidad
4) Técnica que utiliza la
afinicad especifica de la
proteína por un ligando,
como su cofactor,
anticuerpo o ion métalico.
( ) Cromatografía de
afinidad
( ) Cromatografia de
intercambio iónico
( ) Precipitación por
sulfato de amonio
( ) Cromatografía de
filtración en gel o
exclusión molecular
Problemas
1. Una reacción transcurre con una velocidad de 5 mmoles de sustrato transformado
por minuto y litro de medio. Si el sustrato está en exceso: ¿Qué cantidad se habrá
transformado al cabo de 10 min de reacción si el recipiente contiene 20 litros de
medio?
2. Una preparación enzimática tiene una actividad específica de 74 U/mg de
proteína y contiene 21 mg de proteína/ml. Calcular la velocidad de reacción en una
mezcla de reacción estándar que contiene:
a) 5 µl de la preparación enzimática;
b) 25 µl de la preparación enzimática
c) 50 µl de la preparación enzimática
3.Después de purificar la enzima LDH se determinó su actividad mediante la
absorción del NADH a 340nm (e= 6220 M-1 cm-1). La reacción se llevó acabo en
un volumen total de 500 µL de amortiguador de fosfatos pH 7.5 con 0.5 mM de
piruvato y 4 mM de NADH, para iniciar la reacción se adicionó 1µL de proteína a
una concentración de 2µg/µL. Los datos obtenidos son los siguientes:
Tiempo (min)
0
0.5
1.0
1.5
2.0
3.0
Absorbancia a 340 nm
1.20
1.1
0.99
0.90
0.80
0.60
4. Un extracto de bacterias contiene 24 mg de proteínas por mililitro. 20 µl de este
extracto en un volumen estándar de incubación de 0,1 ml catalizan la producción de
1,6 µmoles de producto en un minuto. Calcular:
a) La concentración del enzima en U/ml de extracto.
b) La actividad específica del enzima en el extracto.
c) La actividad total del enzima si tuviéramos 200 ml de extracto.
5. Al hacer una purificación de una enzima el extracto crudo tiene una actividad total
de
45 U y una actividad específica de 29 mU/mg. En el último paso de purificación se
obtuvo una actividad total de 19,8 U y una actividad específica de 780 mU/mg.
Calcular:
a) Cantidad de proteínas en mg en ambas fracciones.
b) Porcentaje de recuperación.
c) Factor de purificación.
6. Un extracto crudo contiene 25 mg de proteínas/ml. 35 µl de este extracto
catalizaron la transformación de 0.22 µmoles de sustrato por minuto. 85 ml de este
extracto se fraccionan con sulfato de amonio. La fracción que precipitó entre el 25 y
el 50% de sulfato amonio se redisolvió en 15 ml. Estos 15 ml contienen 67 mg de
proteínas por ml y 35 µl de este extracto catalizan la transformación de 0.9
µmoles/min.
Calcular:
a) El porcentaje de recuperación de la enzima en la fracción precipitada.
b) El factor de purificación obtenido en el fraccionamiento con sulfato amónico.
7 Para purificar una determinada enzima, a partir de un extracto crudo que lo
contiene, se ensayan sucesivamente precipitaciones fraccionadas, cromatografía de
intercambio iónico y cromatografía de exclusión, con los resultados que registra la
siguiente tabla:
a) Calcular el porcentaje de recuperación del enzima después de cada una de las
manipulaciones a las que se le ha sometido
b) Indicar si procede seguir purificando el enzima o cabe esperar haber alcanzado
su homogeneidad electroforética.
8. Smith y colaboradores han logrado purificar hasta homogeneidad la nitrato
reductasa de la cianobacteria Anacystis nidulans mediante un procedimiento que se
resume en la tabla siguiente:
Fracción V (ml) Prot (mg) AE (U/mg)
Extracto crudo 195 10126 0,087
Enzima solubilizada 175 5596 0,120
Precipitado etanol (50-70%) 38 152 3,400
Eluato en cromatografía en DE-S2 95 43 10,19
Eluato cromatográfico en Fd-sefarosa 60 0,46 588,70
Eluato concentrado de filtración en ACA49 1,15 0,26 874,80
A partir de estos datos calcular:
a) Actividad total en unidades después de cada paso de purificación.
b) Porcentaje de recuperación final.
c) Número de veces que se ha logrado purificar el enzima.