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Distribuidora de Reactivos y Agentes
de Diagnóstico para Laboratorio
Blvd. J. Alonso de Torres 312 pte. Col. San Jerónimo León Gto.
(477) 718-5948 ventasleon@microelisas.com
Inserto Triiodothyronina Total (T3t) CLIA
MONOBIND, INC.
Triiodothyronina (T3 total)
Código de Producto: 175-300
Intención de uso:
La determinación cuantitativa de de la concentración de Triodo tironina T otal en
suero humano o plasma por un micro plato de
inmuno-ensayo de
quimioluminiscencia.
RESUMEN Y EXPLICACION DE LA PRUEBA
La medida de la concentración del Triiodotironina en suero generalmente se
observa como una valiosa herramienta en el diagnos tico de la disfunción de la
tiroides. Esta importancia ha proporcionado ímpetu para la mejora significativa en
la metodología del análisis que ha ocurrido en ya décadas pasadas. El
advenimiento antí-suero mono-especifico y el descubrimiento de los agentes de
bloqueo a las proteínas obligatorias del suero T3 permitieron el desarrollo de los
procedimientos simples de radio-inmuno-ensayo (1.2).
Esta metodología de inmuno análisis de la enzima en micro plac a provee a los
téc nicos con una óptima sensibilidad requiriendo muy pocas manipulaciones
téc nicas. En este método, la referencia del s uero, el espécimen del paciente, o el
control se agrega primero a un micropozo. Se agrega después la enzima
conjugada de T3, y entonces los reactivos se mezclan. Resultado de una reacción
de la c ompetición entre la enzima conjugada y el tríodo tironina nativo para un
limitado número de anticuerpos que se combinan a los sitios inmovilizados en el
pozo.
Después de la terminación del período requerido de incubación, la conjugación
atada del anticuerpo a la enzima-T3 es separada de la conjugación desatada de
enzima -T3 por la aspiración o la decantación. La actividad de la enzima presente
en la superficie del pozo es cuantificada por la reacción con un sustrato
conveniente para producir luz.
El empleo de varias referencias del suero de concentrac ión conocida de
Triiodotironina permite la c onstrucción de un gráfico de actividad y de
concentración. De la comparación a la curva de la reacción a cierta dosis, la
actividad de un espécimen desconocido se puede correlacionar con la
concentración T3.
REACTIVOS
MATERIAL PROVEEIDO
A. SUERO HUMANO DE REFERENCIA -- 1ml/vial - Frascos A-F
Seis (6) frascos de referencia del s uero para triiodothyronine en las
c oncentraciones de 0(A), 0.5(B), 1.0(C), 2.5(D), 5.0(E) y 7.5(F) ng/ml. Almacén
en 2-8°C. Se ha agregado un preservativo.
B. TRAZADOR DE T3 TOTAL - 1.5ml/vial - frasco icono
Un (1) frasco de peroxidasa conjugada de T3-horseradish (HRP) en una matriz
albúmina-estabilizante. Se ha agregado un preservati vo. Almacén a 2-8°C.
C. BUFFER DE T3/T4 TOTAL -- 13ml - icono?
Un (1) frasco de reactivo que contiene el buffer, tinte rojo, preservativo, e
inhibidores atados a la proteína. Almacén en 2-8°C.
D. POZOS DE REACCION A LA LUZ DE T3-- 96 pozos -icono
Una microplaca con 96 pozos cubierto con el suero de oveja anti-T3 y
empaquetado en un bolso de aluminio con un elemento deshidratador. Almacén
en 2-8°C.
E. CONCENTRADO LAVADOR (WASH) -- 20ml - ic ono
Un (1) frasco que contiene un surfactante en solución salina. Se ha añadido un
preservativo. Almacén en 2-30 °C.
A
F. Reactivo Señal A -- 7ml/vial - icono S
Un (1) fras co que contiene Luminol en solución. Almacén en 2-8ºC.
B
G. Reactivo de Señal B -- 7ml/vial - ic ono S
Un (1) frasco que contiene el peróxido de hidrógeno (H2O 2) en solución. Almacén
en 2-8ºC.
I. INSERTO DE LA PRUEBA.
Nota 1: No utilice los reactivos más allá de la fec ha de vencimiento del kit.
Nota 2: Los reactivos abiertos son estables por sesenta (60) días cuando están
almacenados en 2-8ºC.
Nota 3: Los reactivos son para uso en un plato de 96 pozos.
PRECAUCIONES
PR INCI PIO
Inmunoensayo Com petitivo de Quimioluminiscencia:
Los reactivos esenciales requeridos por una fase sólida de enzima en inmuno
ensayo incluye el anticuerpo inmovilizado, enzima-antígeno conjugado y antígeno
nativo. Mezclando el anticuerpo inmovilizado, el conjugado de la enzima-antígeno y
suero que contienen el antígeno nativo, resulta una reacción de la competición
entre el antígeno nativo y la conjugac ión del enzima-antígeno para un limitado
número de sitios insolubles obligatorios. La interacción es ilustrada por la ecuación
seguida:
Para el uso de diagnóstico in vitro no para el uso interno o externo en s eres
humanos o animales
Todos los productos que contienen el suero humano han sido encontrados para ser
no-reactivos para el antígeno superfic ial de la hepatitis B, los anticuerpos del VIH
1&2 y de HCV por los reactivos con licencia del FDA. Puesto que ninguna prueba
sabida puede ofrecer el aseguramiento que los agentes infecciosos están
ausentes, todos los productos humanos del suero deben ser dirigidos como
potencialmente peligrosos y capaces de transmitir enfermedad. Los buenos
procedimientos del laboratorio para manejar productos de la s angre se pueden
encontrar en el centro para el c ontrol de enfermedad/el instituto nacional de la
salud, "Bioseguridad en laboratorios microbiológicos y biomédicos," 2da Edición,
1988, publicación No. (CDC) 88-8395 de HHS.
RECOLECCION DE LA MUESTRA Y PREPARACION
Los especimenes serán sangre, suero en tipo y las precauciones generalmente en
la colec ción de muestras del veni-punctura deben ser observados. Para la
comparación exacta a los valores normales establecidos, una muestra de ayuno
del s uero de la mañana debe ser obtenida. La s angre se debe recoger en un tubo
llano del venipunctura del tapón rojo sin los añadidos o anticoagulantes. Permita
que la sangre coagule. Centrifugue el espécimen para separar el suero de las
células.
Las muestras se pueden refrigerar en 2-8° C por un período máximo de 48 horas. Si
el espécimen no se puede probar dentro de este tiempo, la muestra se puede
almacenar en las temperaturas de -20°C por hasta 30 días. Antes de hacer el
ensayo tenga los reactivos y muestras a temperatura ambiente de 20° C- 27° C.
Evite c ongelar y deshelar. Cuando está probado en duplicado, 0.10ml del
espécimen se requiere.
Después de logrado el equilibrio, la fracción del antic uerpo-atado es separado del
antígeno desatado por la decantación o la aspiración. La actividad enzimática,
determinada por la reacción con un sustrato que genera luz, en anticuerpo-atado a
la fracción es inversamente proporcional a la concentración nativa del antígeno.
Utilizando varias diversas referencias del suero de los valores del antígeno
conocido, una curva a la reacción a cierta dosis puede ser generada de la cual
puede ser comprobada la c oncentración del antígeno de un desconocido.
MATERIAL REQUERIDO PERO NO PROPORCIONADO:
1. Una pipeta capaz de entregar los volúmenes 50µl con una precisión de mejor de
1.5%.
2. Dispensadores para las entregas repetidas de los volúmenes 0.100ml y 0.350ml
con una precisión de mejor de 1.5%.
3. Dispensadores de volumen ajustable (20-200µl) y (200-1000µl) para diluciones
conjugadas y de s ustrato.
4. Lavador de Micro plac a o una botella de apretón (opcional).
5. Luminómetro de Microplacas.
6. Tubos de prueba para dilución de enzima conjugada y sustrato A y B.
7. Papel absorbente para retirar excesos de los pozos de la micro placa.
8. Plástico o cubierta de micro plato para los pasos de incubación.
9. Aspirador Vacuum (opcional) para los pasos de lavado.
10. Contador de tiempo.
11. Materiales del control de calidad
PR EPARACION DE LOS REACTIVOS
1. REACTI VO DE TRABAJO - T3-SOLUCIÓN DE ENZIMA CONJUGADA.
Diluir el trazador de T3 1:11 con el buffer trazador de T3/T4 Total en un envase
limpio. Por ejemplo, 160µl del conjugado c on 1.6ml del buffer para 16 pozos (Se
produce un exceso leve de la solución). Este reactivo se debe utilizar dentro de las
24 horas siguientes para el funcionamiento máximo del análisis. Almacenese a 28°C.
FORMULA GENERAL:
CANTIDAD DE BUFFER REQUERIDA = el número de pozos * 0.1
Cantidad de Enzima-T3 necesario = numero de pozos * 0.01
i.e. = 16 x 0.1 = 1.6ml para T3/T 4 total Buffer conjugado
16 x 0.01 = 0.16ml (160µl) para T3 de la enzima conjugada
2. Solución de Lavado.
Diluya los contenidos del concentrado lavador a 1000 ml con agua destilada o
desionizada en un contenedor de almacén adecuado. Guarde la solución diluida a
temperatura ambiente 20-27°C.
3. Solución de Trabajo con Reactivo de Señal. – Guárdese a 2-8°C. Determine
la cantidad de reactivo que necesite y prepare mezclando porciones iguales de
Reactivo de Señal A y Reactivo de Señal B en un contenedor limpio. Por ejemplo:
añada 1 ml de A a 1 ml de B por dos (2) en la tiras de 8 pozos (se produce un
exceso leve de s olución). Deseche la porción que no use si es que no se usara
dentro de las siguientes 36 horas después del m ezclado. Si la utilización de los
reactivos se completa por anticipado, dentro del tiempo asignado, etiquete
acordemente los contenidos del reactivo de Señal B dentro del reactivo de Señal A.
PR OCEDIMIENTO DE LA PRUEBA
3. Dibuje la mejor curva que concuerde a través de los puntos trazados.
4. Para determinar la concentración de T3 en un desconocido, localice el promedio
de RLU´s para cada desconocido en el eje del gráfico, encuentre el punto que
intersecta en la curva, y lea la concentrac ión (en ng/ml) del eje horizontal (eje-x) del
gráfico (los duplicados del desconocido se promedian según lo indicado). En el
siguiente ejemplo, el promedio de RLU´s (63817) del desc onocido intersecta la
curva de calibración en (1.4ng/ml) la concentración de T3. (Véase Figura1).
Nota 1: El software de reducción de información de computadora diseñada para los
análisis de quimioluminiscencia puede ser usados también para la reducción de
información. Los duplicados para los desconoc idos pueden promediarse c omo se
indican. (Ver figura 1).
* La información presentada en el Ejemplo 1 y la figura 1 es ilustrativa solamente y
no debe ser usada como guía para la preparación de la curva con cada ensayo.
En adición, los RLU´s de los calibradores han sido normalizados a 100,000
RLU/seg para el calibrador A (mayor salida de luz). Esta conversión minimiza las
diferencias causadas por la eficiencia de varios ins trumentos que pueden s er
usados para medir las salidas de luz.
Antes de proceder con el análisis, traiga todos los reactivos, referencias del suero y
controles a la temperatura ambiente (20 - 27°C).
1. Ajuste el formato de los pozos de los micro placas para que c ada referencia del
suero, control y espécimen del paciente sean probados en duplicado. Devuelva
cualquier tira que no use del micro pozo nuevamente dentro de la bolsa de
aluminio, séllela y almac énela en 2-8°C.
2. Mida con una pipeta 0.050 ml (50µl) de la referencia del control o del espécimen
apropiado del suero en el pozo asignado.
3. Agregue 0.100 ml (100µl) del Trazador de Trabajo, la solución de enzima/T3
conjugada a cada pozo. (Ver la Sección de Preparación de los Reactivos).
4. Remolinar la microplaca suavemente por 20-30 s egundos para mezclar y cubra.
5. Incube 45 minutos en la temperatura ambiente.
6. Deseche el contenido de la microplaca por decantac ión o aspiración. Si decanta,
golpee ligeramente y seque la placa seca con el papel absorbente.
7. Agregue 350µl del buffer lavador (véase la sección de la preparac ión el reactivo),
decántelo (golpec ito contra el papel absorbente) o aspírelo. Repita cuatro (4) veces
adicionales para un total de tres (5) lavadas. Puede ser utilizada un lavador
automático o manual de placa. Siga la instrucción del fabricante para el uso
apropiado. Si se emplea una botella de apretón o piz eta, llene cada poz o
presionando el envase (evitando las burbujas de aire) para dispensar la
lavada. Decante la lavada y repita cuatro (4) veces adicionales.
8. Agregue 0.100 ml (100µl) de solución de señal de trabajo a todos los pozos
(véase la sección de la preparación el reactivo). Agregue siemp re los reactivos
en el mismo orden para reducir al mínimo diferencias del tiempo de reacción
entre los pozos.
9. Incube en la temperatura ambiente por cinco (5) minutos en la oscuridad.
10. Lea las Unidades Relativas de Luz en cada pozo, en un mínimo de 0.5-1.0
segundos, usando un luminómetro de micropozos. Los resultados se deben leer
en un plazo de treinta (30) minutos de agregada la solución de sustrato.
Nota: Para los especimenes que se vuelvan a analizar con c oncentraciones
mayores de 7.5 ng/ml, pipetear 25µl del espécimen y 25µl de la referencia de suero
0 en cada pozo de la muestra (es to mantiene una concentración uniforme de
proteína). Multiplique el valor de la lectura por 2 para obtener la concentración de
triiodotironina.
CONTROL DE CALIDAD
Cada laboratorio debe probar controles en los niveles en rangos de hipotiroideo,
eu-tiroideo e hiper-tiroideo para supervisar el funcionamiento del análisis. Estos
controles se deben tratar como desconocidos y los valores determinados en cada
método de prueba realizado. Las c artas del control de calidad se deben mantener
para seguir el funcionamiento de los reactivos provistos. Los métodos estadísticos
pertinentes se deben emplear para comprobar tendencias. Cada laboratorio debe
establec er límites aceptables de análisis para c ada procedimiento. En adic ión. La
intensidad de luz máxima debe ser c onsistente con experiencias pasadas. La
desviación significativa del funcionamiento establecido puede indicar el cambio
inadvertido de condiciones o la degradación experimental de los reactivos del kit.
Se deben utilizar reactivos frescos para determinar la razón de las variaciones.
RESULTADOS
Una curva de reacción a cierta dosis se utiliza para comprobar la conc entración de
triiodotironina en especimenes desconocidos.
1. Registre los RLU´s obtenidos de la impresota del lector del micro placas
conforme al ejemplo 1.
2. Trace los RLU´s obtenidos para cada referencia duplicada del suero contra la
concentración correspondiente de T3 en ng/ml en el papel de gráfico linear.
PARAMETROS DEL CONTROL DE CALIDAD
En la orden para que los resultados del análisis sean considerados válidos los
criterios siguientes deben ser resueltos:
1. La curva de respuesta debe estar dentro de los parámetros.
2. Cuatro fuera de seis POOL del control de calidad deben estar dentro de los
rangos.
LIMITACIONES DEL PROCEDIMIENTO
Funcionamiento
1. Es importante que el tiempo de la reacc ión en cada uno de los pozos este
llevado a cabo constante para la reproducción de resultados.
2. El medir c on una pipeta de muestras no debe extender más allá de diez (10)
minutos para evitar la deriva del análisis.
3. Si se utiliza más de un (1) plato, se recomienda repetir la curva de la reacción a
cierta dosis.
4. El fallar al remover la solución de adherencia adecuadamente en los pasos de
lavado por as piración o decantación puede dar resultados erróneos o falsos.
5. Use componentes del mismo lote. No mezcle los reac tivos de diferentes lotes.
6. Las pipetas multicanal se recomiendan para la adición de los reactivos.
7. Las muestras que puedan estar contaminadas microbiologicamente, no deben
ser usadas en este análisis. Lipemica alta o especimenes bemolizados no deben
ser usados.
7. Las muestras que puedan estar contaminadas microbiologicamente, no deben
ser usadas en este análisis. Lipemica alta o espec imenes bemolizados no deben
ser usados.
B. Interpretación
1. Si la reducción de datos controlados de la computadora se utiliza para interpretar
los resultados de la prueba, es imperativo que los valores predichos para los
calibradores c aigan dentro del 10% de las concentraciones asignadas.
2. La concentración total del Triiodotironina del suero es dependiente de una
multiplicidad de factores: función de la glándula tiroides y su regulación,
concentración globulina atada a tiroxina (T BG), y el atascamiento de la
triiodothyronina a TBG (3,4). Así, la concentración total de triiodotironina por si sola
no es suficiente para determinar el estado clínic o.
3. Una disminución de valores totales de triiodothyronina s e encuentran con
enfermedades de pérdida de proteína, ciertas enfermedades del hígado y la
administración de la testosterona, de diphenylhydantoin o de los salicylates. Una
tabla de las drogas y condiciones que interferían, afectando los valores totales del
triiodotironina, ha sido compilada por el diario de la asociación americana de los
3
químic os clínicos .
RANGOS ESPERA DOS Y VALORES
Un estudio de la población euthyroidea adulta fue emprendido para determinar los
valores previstos para el sistema de la prueba de T3 CLIA. El significado (R) valora
las desviaciones de estándar (?) y los rangos previstos (±2? ) se pres entan en la
tabla 1. El número total de muestras era 85.
Es importante tener presente que el establecimiento de un rango de valores que se
puede esperar ser enc ontrado por un método dado para una poblac ión de
"persona-normal" es dependiente sobre una multiplicidad de factores: la
especificidad del método, de la población probada y de la precisión del método en
las manos del analista. Por estas razones cada laboratorio debe depender del
rango de valores esperados establecidos por el fabricante solamente hasta que un
rango interno determinada por los analistas usando el método con una población
indígena al área en la cual el laboratorio está situado.
CA RACTERISTICAS DE ACTUACION
A. Precisión
La precisión en y entre la precisión del análisis del procedimiento de T3 CLIA por
Micro plac a fue determinada por análisis en tres diversos niveles de los sueros del
control. El número, el valor medio, la desviación de estándar y el coeficiente de
variación para cada uno de estos sueros del control se presentan en la tabla 2 y la
tabla 3.
B. Exactitud
La prueba de T3 CLIA fue comparada con un método de inmunoanalisis de enzima
de referencia. Fueron usados especimenes biológicos de poblaciones de
hipotiroideo, eutiroideo e hipertiroideo (Los valores de rango desde 0.010ng/ml –
7.30ng/ml). El total de números de cuyos especimenes fue 110. El ultimo cuadro de
ecuación de regresión y el c oeficiente de correlación fue computado por el T 3 CLIA
en comparación con el método de referencia, La información obtenida se muestra
en la tabla 4.
Sólo pequeñas cantidades de diagonales entre este método y el método de
referencia están indicados por la cercanía de los valores de significado. La
ecuación de regresión del último cuadro y el coeficiente de correlación indican una
concordancia excelente del método.
C. Especificidad: La reactividad cruzada del anticuerpo del triiodotironina a las
sustanc ias seleccionadas fue evaluada agregando la sustancia que interfería a una
matriz del s uero en las varias concentraciones. La reac tividad cruzada fue
calc ulada derivando un cociente entre la dosis de la sustancia que interfería a la
dosis del triiodothyronine necesitada para desplazar el mismo trazo de la cantidad.
Substance
I-Triiodothyronine
I-Thyroxine
lodothyrosine
Diiodothyrosine
Diiodothyronine
Phenylbutazone
Sodium Salicylate
Cross Reactivity
1.0000
< 0.0002
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
< 0.0001
Concentracion
10µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
10µg/ml
D. Sensibilidad
El procedimiento de sistema de la prueba de Triiodothyronine tiene una sensibilidad
de 0.04ng/ml. que la sensibilidad fue comprobada determinando la variabilidad de
los 0 calibradores del suero de ng/ml y usando la estadística de la certeza del
2?;(95% ) para calcular la dosis mínima.
REFERENCIAS